PTLC和柱色谱精讲

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,浅谈,（,硅胶,）,制备型薄层色谱与,（,硅胶,）,柱色谱的操作问题,结合我们实验室中具体操作,一般我们实验中应用最多的是以,硅胶,吸附剂,为固定相的薄层色谱和柱色谱。,虽然很多化学实验书中都叙述了,（硅,胶）制备型薄层色谱与（硅胶）柱色谱的操作技术的实验方法，但大多数都是比较雷同地泛泛地描述，而且有些描述在实验室中并不适用。例如，很多书中都提,到装柱时先在底层铺一层石英砂，加入固定相后再在顶部铺一层石英砂。比较繁琐，而且效果“？”，在实验室中不适用。,吸附色谱,的原理：,吸附色谱是根据物质在硅胶上的吸附,力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附， 整个过程即是,吸附、,解吸、 再吸附、 再解吸,过程。,第一部分（,硅胶）制备型薄层色谱,(PTLC),一、制板操作,二、,点样,操作,三、回收分离组分,四,、,常见,问题及注意事项,第二部分,（硅胶）柱色谱的操作问题,一,、装柱,二,、上样,三,、洗脱剂的使用,四,、,洗脱,的技巧,第一部分（,硅胶）制备型薄层色谱,(PTLC),一、,制,板操作：,我们实验室常用的制板操作（手工制备硅胶硬板）：,1.,溶解制备,0.5%CMC-Na,溶液,(,为何用,0.5%CMC-Na,溶液？,),先说一下,CMC-Na,（,1,）,.,结构,:,（,2,）物理和化学性质,：,纤维素羧甲基醚的钠盐，为白色或乳白色纤维状粉末或颗粒,，,几乎无味，,具吸湿性,。,易于分散在水中成透明胶状溶液，在,乙醇,等有机溶,剂,中不溶。,1%,水溶液,pH,为,6.5,8.5,，当,pH10,或,5,时，胶浆粘度显著降低，在,pH=7,时性能最佳,。,对热稳定，在,20,以下粘度迅速上升，,45,时变化较慢，,80,以上,长时间,加热可使其胶体变性而粘度和性能明显下降。,在碱性溶液中很稳定,，遇酸则易水解，,pH,值为,2-3,时会出现沉淀，遇多价金属盐也会反应出现沉淀。,作用是做粘合剂,。,其他粘合剂：,煅石膏、淀粉,等。,0.5%CMC-Na,溶液制备过程：,例如，取蒸馏水,1000ml,，加热,煮沸,，将,羧甲基纤维素钠,5g,分次撒入沸水中，玻璃棒搅拌，直到完全溶解。,煮沸前加少量水补,蒸发量,。,为何分次加入,CMC-Na,？,2.,硅胶粘合,取一定量硅胶放入研钵中，加入,3,倍量,的,0.5%CMC-Na,溶液，向,同一方向,研磨至无气泡，,粘液成线状,即可。,为什么要同一方向？,3.,铺板,适宜的薄层吸附剂的厚度为,0.5-2mm,，板的尺寸一般为,20cm20cm,大约需要硅胶的量为,30,克,（经验值）,，所以,PTLC,常用来分离毫克级的样品。,二、,点样,操作,上样是,PTLC,分离的一个最关键的步骤。薄层板最好先用,甲醇,展开一次，以减少杂质的混入。,上样前将样品用挥发性的,溶剂,溶解，浓度应在,5%-10%,左右，点样带应尽量窄，以获得较好的分离效果。,一般来讲，一块,1mm,厚,的,20cm20cm,的硅胶薄层板可分离,10-100mg,的样品，,如果厚度加倍，可多上样,50%,。,三、回收分离组分,PTLC,展开结束后，有紫外吸收的化合物，可以在紫外灯下确认色带位置；,无紫外吸收的化合物，可采用在板上面覆盖一块玻璃板，然后在板的边缘喷洒显色剂来确认色带的位置,。,确定各组分色带的位置后，用刮刀将该色带从板上刮下，然后用,极性尽量低,（,极性越高，往往被提出的杂质的量就越大,）、,对该化合物溶解度好的溶剂洗脱,，过滤除去吸附剂，收集洗脱液，回收溶剂，即可。,甲醇可溶解硅胶及其中含有的一些杂质，因此，并不适合用来洗脱，较合适的溶剂是,丙酮、乙醇或氯仿。,四,、,常见,问题及注意事项,1.,板子裂口可能的原因：,（,1,）,硅胶的比例太大,（,2,）,板子未自然干透，就在烘箱中活化,（可用低温大约,40,度左右烘,30,分钟左右再用进行活化）,（,3,）,CMC-Na,中有絮状沉淀所致。,2.,活化问题：,活化的目的是除去水分，自然晾干后，再在,105110,活化，活化时间为,0.51,小时，冷却后即可使用。,厚板在活化时容易裂，可以降低活化温度，自然晾干后，,40,至,60,摄氏度的烘箱中,2,3,小时即可，干燥器中保存。,3.,玻璃板清洁问题：,可以先用洗手液或洗衣粉清洗，再用,自来水冲洗干净，接着用蘸有乙醇的棉花擦拭干净，最后把板吹干或烘干，放置于清洁处，备用。玻璃板应该很干净，没有划痕，没有缺口，,4,个角要,“,健全,”,。,4.,平衡与饱和问题：,展开前薄层板置于盛有展开剂的展开缸中饱和,15,30,分钟，此时薄板不与展开剂接触。,饱和可以增加展开剂的散发面积，减少边缘效应。,5.,显色的问题：,（,1,）,物理显色：紫外灯下观察，常用波长,254nm,或,365nm,。,（,2,）,化学显色：,通用型显色剂：,碘蒸气,对许多有机化合物都可以显色，如生物碱、,AA,衍生物、肽类、脂类、皂苷类等，该显色反应是可逆反应，在空气中随着碘的升华挥发，组分斑点可恢复到原来状态,。,10%,硫酸乙醇溶液,使大多数有机化合物产生有色斑点，例如棕色，甚至于出现荧光。,0.05%,荧光黄甲醇溶液,是芳香族与杂环化合物的通用显色剂。,专属性显色剂,第二部分,（硅胶）柱色谱的操作问题,一,、,装柱,柱,色谱,用的硅胶一般是,200-300,目,， 称量硅胶时一般称,3070,倍,于上样量， 如果极难分， 也可以用,100,倍量以上,的硅胶。,初做柱,色谱,很容易把柱子装得长了或短了，有时还会有大量的硅胶剩余， 浪费硅胶， 这主要是对硅胶等固定相的使用的量没有掌握。,解决,方法很简单：将称取的,干硅胶,， 直接,倒入所选柱子中， 敲实， 观察硅胶在柱子中的高度，这样就可以做到心中有数了。,一般在装柱的时候可以根据实验所需柱子的高度来调整硅胶的使用量,，这样就可以大大地节省硅胶的使用，避免造成没有必要的浪费。,柱,色谱,的装柱非常重要，装柱的效果会直接影响层析分离效果。有,湿法装柱,和,干法装柱,等两种方法。,湿法装柱很简单，使用也最普遍， 就是先用比固定相,多一倍的洗脱剂,，,将固定相,拌,成匀浆,状。,柱子底部先用脱脂棉塞紧，,并向柱子中加入适量初始流动相，,用漏斗将,匀浆状,的固定相倒入柱子中， 将柱子中高出固定相的溶剂放出。期间,可,用橡皮棒敲打， 将固定相敲实， 做到,密实均匀无气泡,即可。,很多时候用加压的方法可以很高效地装好柱子，而且在柱子中没有气泡产生。,干法装柱与湿法装柱刚好相反的是，它是将干燥的吸附剂从柱子上端直接加入到一个空的柱子中，用,洗脱,剂,将柱子冲实,。,干法装柱的一个缺点就是在装入洗脱剂后， 由于溶剂和固定相之间的吸附放热， 所以柱子容易变花，影响分离效果。,解决的方法,：,（,1,） 固定相要,装,结实；（,2,） 用较多的,洗脱剂,冲柱子,。,无论使用哪种方法装柱，最后都要求所装的柱子结实、 匀称、 无气泡。,二,、 上样,上样也有湿法和干法之分,，,我们实验室常用干法,上样，就,是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，研磨均匀并在,60,下加热挥尽溶剂。一般样品和硅胶按,1:1,的量混合， 硅胶使用的量也可以少一些， 不能看到明显的固体颗粒，让样品都吸附在硅胶的表面上。然后小心地加入到装好的柱子中， 加入洗脱剂洗脱,，然后,将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。,湿法一般用,洗脱剂,剂溶解样品， 也可以用二氯甲,烷、 乙酸乙酯等， 但溶剂越少越好。再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁缓慢地均匀加入。,在不用海沙的情况下， 尽量不要破坏硅胶面。,加样后， 打开柱底活塞， 让固定相充分地吸附所加样品。然后再加入一些洗脱剂，再充分地吸附后将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂， 而不会冲坏硅胶表面。,三,、 洗脱剂的使用,洗脱剂的极性可用薄层,色谱,来确定， 一般以待分离样品,Rf,值为,0.2-0.3,为宜。选择的洗脱剂应该使两相邻物质,Rf,值之差最大化。,有时虽然在薄层板上看到分离的效果很好，但,在,柱,色谱上,还是很难分开。,这主要的原因就是,薄层,色谱,用硅胶比柱,色谱,用硅胶要细得多,，所以分离效果好。解决的办法就是,降低洗脱剂的极性,，一般柱,色谱,用,的,洗脱剂比薄层,色谱,用的展开剂极性要再,降低,2-3,倍,可以达到比较好的分离效果。,当所分离物质极性跨度较大时， 可用采梯度洗脱的方法， 即逐渐增加溶剂的极性，使吸附在硅胶上的不同化合物逐个洗脱下来。,常用的展开剂,：,极性小的用乙酸乙酯： 石油醚系统；,极性较大的用甲醇：,氯仿,（二氯甲烷）,系统；,极性大的用甲醇： 水： 正丁醇： 醋酸系统；,拖尾可以加入少量,氨水或冰醋酸,。,对于很难分离的化合物，,一是增加柱子的长度和直径， 二是减小洗脱剂的极性，,这样可以很好地将混合物分开。在同样能洗脱的情况下， 尽量使用毒性小的洗脱剂。,另外洗脱剂在,洗脱柱子,后最好也回收使用， 一方面环保， 另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。,这里要注意的是,：,一般在过柱同时进行的是,减压旋蒸,，,混合溶剂的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化， 一般会使得极性变大， 在梯度淋洗时比较合适。,还有一般回收的溶剂中会有少量水分，使用前先要用干燥剂干燥好才能使用。,四、洗脱,技巧,柱,色谱,按过柱时的压力可以分为： 加压， 常压， 减压。,压力可以增加,洗脱,剂的流动速度， 减少产品收集的时间， 但是会减低柱子的塔板数。,其他条件相同的时候 常压柱是效率最高的， 但是时间也最长。,减压柱能够减少硅胶的使用量，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发， 有时会在柱子外面有水汽凝结， 另外有些比较易分解的东西可能得不到， 而且还必须同时使用水泵抽气， 噪音大， 时间长， 所以减压过柱用得比较少。,加压过柱是一种比较好的方法， 与常压柱类似， 但用外加压力可以使淋洗剂走的快些。,压力的提供可以是压缩空气，,双连球,或者小气泵,。,特别是在容易分解的样品的分离中很适用。一般压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。因为加压过柱效率高， 分离效果较好， 所以加压过柱在普通的有机化合物的分离中是非常适用的。,一些低沸点溶剂装柱时往往会在柱子中产生气泡， 使柱子变花， 可以利用加压过柱法在装柱时就可以有效地解决这个问题， 而且可以使柱子很快装实,。,随着科技的发展， 色谱法的技术也日新月异， 但薄层,色谱,和柱,色谱,实验技术还是比较简单和实用的， 每个科研工作者在使用薄层,色谱,和柱,色谱,时， 可以根据自己的实际情况来不断地摸索，不断地总结和提高薄层,色谱,和柱,色谱,的实验技术。,