细胞毒理学实验三血细胞过氧化物酶检测

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,细胞毒理学实验,血细胞过氧化物酶活性检测,山东师范大学生命科学学院,实验目的,掌握酶细胞化学的基本原理和方法。,了解血细胞的基本形态特征。,了解血细胞过氧化物酶检测的意义。,实验原理,过氧化物酶是一类氧化还原酶,能催化很多反应。 其以过氧化氢作为电子受体,能催化底物的氧化。主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。,实验原理,-,外周血细胞基本类型,血细胞,血小板,红细胞,白细胞,颗粒性,白细胞,嗜中性粒细胞（,70%,）,嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞,无颗粒,白细胞,淋巴细胞（,8%,）,单核细胞（,20-30%,）,红细胞,成熟的哺乳动物外周血红细胞呈双凹圆饼状，中间透亮，无细胞核，直径约为,7,m,。,淋巴细胞,淋巴细胞呈圆形，细胞核圆形，核质比高，小淋巴细胞一般无颗粒，大淋巴细胞可有少量粗大不均匀，深紫红色颗粒，直径约,6-15,m,。,单核细胞,单核细胞呈圆形或不规则形，细胞核多呈肾形、马蹄形，直径约,10-20,m,。,嗜中性粒细胞,中性粒细胞呈圆形，细胞核分叶，,2-5,叶，以,3,叶为多，细胞质中多浅色颗粒，量多，细小，均匀分布，直径约,10-15,m,。,嗜酸性粒细胞,嗜酸性粒细胞呈圆形，细胞核分为,2,叶，细胞质中颗粒粗大，圆而均匀，充满胞质，偏红色，直径约,10-16,m,。,嗜碱性粒细胞,嗜碱性粒细胞呈圆形，细胞核结构分叶不明显，细胞质中多粗大颗粒，呈蓝紫色，直径约,10-12,m,。,血小板,血小板是从骨髓成熟的巨核细胞细胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质。多集中出现，双面微凹，圆盘状，无细胞核，在正常血液中有较为恒定的数量。,实验原理,髓过氧化物酶（,MPO,）是过氧化物酶（,POX,）家族中的重要成员， 是白细胞中的主要成分,存在于单核细胞、中性粒细胞、某些组织巨噬细胞和小胶质细胞中。,MPO,在早期幼粒细胞阶段合成，然后加工和包装形成嗜碱性颗粒，,MPO,水平与中性粒细胞数之间存在极显著的相关性，中性粒细胞是血管内,POX,最主要的细胞来源,分泌的,POX,占全部细胞蛋白质的,4%,占全部循环,MPO,含量的,95%,。,MPO,可作为中性粒细胞的活性标志，也把它作为髓细胞的特异性标志。,MPO,的合成是在粒细胞进入循环之前于骨髓内进行的,贮存于嗜天青颗粒,/,嗜碱性颗粒中。,实验原理,酶细胞化学技术的基本要求：,保持样品的形态结构不发生改变；,保存细胞内生前化学成分及酶的活性；,显示成分的化学反应必须对将被显示的化学物质有高度特异性和高度灵敏性；,反应所生成的产物要在原位沉淀、显色明显、不溶、不扩散，并在重复实验中结果一致。,实验原理,酶是催化细胞内生物化学反应的特殊蛋白质。酶的正常与否反映了机体的功能。酶具有高度特异性，它仅作用于一种或一类底物，将酶催化其底物形成的最终产物显示出来。也就间接地显示了酶。,在生物制片过程中，酶的保存是关键的一步，温度对酶活力影响很大，高于,37,时酶往往失去活性，因此显示酶常用新鲜组织的冰冻切片或临时制片的方法。此外酶活性需要一定的,pH,值，所以酶的作用液常选用恰当,pH,值的一定缓冲液来配制。,实验原理,血细胞内过氧化物酶（,POX,）氧化过氧化氢，释放单原子氧，将联苯胺氧化，生成联苯胺蓝，该产物的显色情况随,POX,的活力不同，其颜色由棕黄到蓝黑不等。,POX I,液,含有乙醇、联苯胺,POX II,液,含过氧化氢,实验用品,仪器：,显微镜,材料：,小鼠外周血,试剂：,瑞氏染液、,MPO,孵育液、,95%,乙醇。,取血,：取适量小鼠血液一滴置于在玻片靠近一端处。,实验步骤,延展：再取另一张边缘光滑的双凹片，斜置于血滴的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状。,实验步骤,推片：两玻片的角度以,3045,为宜，轻轻将双凹片向前匀速推进，即涂成血液薄膜。,3045,实验步骤,酶显孵育,取新鲜涂片滴加,I,液数滴，以覆盖血膜为准，室温下放置,1min,，切勿冲洗，即加入,II,液数滴，混合后室温放置,5min,，流水冲洗。滴加,95%,乙醇脱色后,立即水洗,瑞氏染液染色,.,复染染色,待涂片在空气中干燥后，滴加数滴,Wrights,染液盖满血膜为止，染色,1,3 min,。然后滴加等量蒸馏水，使其与染液均匀混合，静置,10,15 min,。用蒸馏水冲去染液，吸水纸吸干，镜检。,阴性,:,细胞质内无沉淀物,(,无色,),阳性,:,细胞质内出现棕黄色或者蓝黑色沉淀物,.,思考与讨论,酶细胞化学染色的基本原则？,酶细胞化学染色的基本技术要求？,血细胞髓过氧化物酶检测的意义。,