实验五. 细胞染色体制备

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,组织培养细胞染色体的制备,实验五,实验目的,实验原理,实验试剂与仪器,实验步骤,注意事项,了解组织细胞的培养方法。,掌握染色体标本的制备方法。,一、实验目的,二、实验原理,二、实验原理,处于指数生长期的细胞，经过短期培养后，用秋水仙素处理，可把细胞分裂阻截在中期，再经过低渗、固定、滴片和染色，就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察。,材料：,具有很强生长分裂能力的细胞系（,Hela,细胞、白血病,K562,细胞、,C2C12,，,BHK,细胞等）,仪器：,恒温培养箱、离心机、显微镜,培养瓶、移液管、载玻片,试剂：,培养液（,RPMI1640,、,M199,、,DMEM,等）、胎牛血清、双抗、,NaHCO,3,、生理盐水、肝素、,1.0g/L,秋水仙素溶液（,0.1%,）、低渗液（,0.075M/L,KCl,）、固定液,(,甲醇：冰醋酸,=3,：,1),、,Giemsa,染液,三、实验试剂及仪器,1.,秋水仙素,阻止微管组装，破坏纺锤体阻断细胞有丝分裂。,使染色体收缩成一定的形状。,目的,:,获得大量的中期分裂相细胞。,2.,Carnoy,固定液,新配置的甲醇 ：冰醋酸混合液,(3:1),。,能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果,3.,低渗液（,0.075M/L,KCl,）,低渗的目的是,凭借反渗透作用使细胞膨胀（但不破裂）染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态,4.,染料 （,Giemsa,）,不是一种单一染料，而是天青、伊红、甘油和甲醇的混合物，配制后原液储存，,染色后，染色质呈红色，细胞核是蓝色。,四、实验步骤,培养液,4ml,胎牛血清,1ml,培养,24,小时,每,ml,培养液,加,1ug,继续培养,3-5,小时,培养,秋水仙素,培养瓶,取样,取,1ml,培养液于,10ml,离心管,1.,1000rpm,离心,5,分钟,弃上清,离心,2.,加,KCl,8ml,混匀,37,处理,20,分钟,低渗,3.,预固定,固定,加,3-4,滴固定液，轻轻吹打后，离心去上清,二次固定,4.,5.,6.,加,3ml,固定液，,2min,后轻轻吹打后，固定,10min,离心去上清,加,3ml,固定液，轻轻吹打后，固定,10min,后，离心去上清,三次固定（同,6,）,制片,预冷冰片,距离,20cm,以上,玻片倾斜,30,迅速吹气,过火焰,3-5,次,7.,8.,9.,空 气干燥,Giemsa,染色,10min,细水流冲洗,染色,10.,11.,12.,吹干,镜检,13.,14.,1,）秋水仙素处理时间要把握好，时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长,2,）低渗之后，要细心、温柔混匀细胞，防止细胞膜破裂、染色体散失；,3),离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失；,4),载玻片要洁净，预冷；滴片时确定将材料滴在玻片上；,五、注意事项,实验步骤,1.,秋水仙素预处理,:,收集生长旺盛的细胞,1ml,，轻轻吹打散，加入秋水仙素,1ul,，继续培养,6-8,小时（,已完成,）；,2.,预处理后的细胞，以,1000rpm,离心,5min,，去上清；,3.,低渗处理,：加入,1ml,低渗液，轻轻吹打，使细胞重悬，然后补加,7ml,低渗液，室温下静置,20min,4.,预固定：,加入,3-4,滴固定液后，轻轻混匀，避免粘连，,1000rpm,离心,5min,，去上清；,5.,固定：,沿管壁慢慢加入,3ml,固定液，,2min,后用吸管轻轻吹打，使细胞分散，固定,10min,后，,1000rpm,离心,5min,，去上清；,6.,二次固定：,加,3ml,固定液，吹打均匀，固定,10min,后，,1000rpm,离心,5min,，去上清；,7.,三次固定：,重复第,6,步；,8.,制悬液：,去上清后剩,0.5ml,固定液，用吸管轻轻吹打使其成为细胞悬液；,9.,滴片：,将冰冷的载玻片倾斜,30,，吸取细胞悬液距离载玻片至少,1m,滴于载玻片上，吹散，空气干燥；,10.,染色：,在干燥的载玻片上滴,Giemsa,，染色,10min,，细水冲洗后，空气干燥；,11.,镜检：,在低倍镜下寻找染色体分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。,小鼠中期细胞染色体（,2N=40,）,小鼠染色体核型分析,人类慢性骨髓性白血病,（,chronic,myelogenous,leukemia,）,Chr9,和,Chr22,相互易位,使得,Chr9,上的,c-abl,oncogene,和,Chr22,上的,bcr,gene,相连，形成融合基因。,其产物是一个融合蛋白,这个融合蛋白使细胞不受细胞周期的控制，导致白血病。,只要一个细胞带有这种易位,Chr,，就会致病。,猫叫综合征（,Cat cry syndrome,）,临床表现：,喉部发育不良，哭声似猫叫,身体与智能发育不全，小头畸形，满月形脸，眼距宽，低耳位，高鼻梁,在婴儿期或幼儿期夭折,病因：,5,号染色体短臂缺失，,5p,-,综合征,