影响生物转化的因素

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,影响生物转化的重要因素,1,第二讲 影响生物转化的重要因素,最佳微生物的选择,最佳反应条件的确立。,2,最佳微生物的选择,从现有的最活泼的菌株出发是相当重要的。,菌株获得途径,：,从此领域工作者或菌菌种保藏机构获得。 从自然界获得。,高产菌株的获得，耗时、费力。但一旦获得，其经济效益极佳。,3,寻找转化菌的基本途径,从自然界选种,微生物对外界适应能力强，能在各种极端环境下生长繁殖，在自然界分布极为广泛。,自然界的野生微生物在漫长岁月里，经过自然选育形成具有适应各种恶劣环境的本领。形成了独特的代谢途径和调节技能及不同的酶和酶系统，从而来转化外界的化合物。,结论：,野生微生物中蕴藏着各种新菌种和优良菌种的宝库。,4,从生产中选种,提高已知产物的生产能力,生产能力表示法：,1.单位体积发酵液中的产物量,2.单位重量菌体干重所产生的产物量,3.每小时，单位体积发酵液中的产物量,4.每小时，单位重量菌体干重所产生的产物量,5,最佳微生物应具备的条件,1.采用生长快、培养基价廉及酶产量高的菌株。,2.使其他酶的污染降至最低。,3.菌株能生长在浓厚的培养基中，便于提高产率。,4.酶的回收方法要简单易行。,5.产品必须安全可用。,6.生产过程中的流出物要有经济核算及易于处理等技术。,6,最佳反应条件的确立,一旦得到了优良的菌株。为了最高的生长量和酶产量，微生物生长参数必须最优化。,包括：温度、pH、氧的传递、微生物的营养、无机盐来源、表面活性剂（尤其对胞外酶而言）的使用等等,7,对优良转化菌株的其他要求,不论从自然界选种，还是从生产中选种，提高菌种的生产能力并非唯一的指标，除此之外还要求：,1. 应有较稳定的遗传性。,2.具有抗噬菌体能力。,3.转化菌转化时，希望泡沫少。,4.转化菌需氧量较低较好。,5.转化菌应该有较高的底物转化效率。,6.转化菌应对培养基的组分及前体有较高的耐受性。,7.生产菌株应当生长旺盛，产孢子菌株应有较强的产孢子能力。,8.菌株在发生转化时不产生或少产生副产品,。,8,影响生物转化的重要因素,识别生长周期高峰,酶合成的调节,诱导作用,调节诱变,避免代谢物的阻遏作用,渗透性,辅代谢作用,避免产物的抑制作用,9,识别生长周期高峰,如果反应是按分批反应进行的，必须确定酶含量最高的生长阶段。,一般在酶含量达到最高峰后，酶会迅速地消失。,10,酶合成的调节,为了培育用于某一生物转化的优质细胞，在这种细胞内必须含有最高量的适宜的酶，因此酶合成的调节是很重要的。,诱导作用,调节诱变,11,诱导作用,许多编码酶的结构基因在酶的作用基质不存在时，一般是无活性的，酶的生产正常地被阻遏。,但当加入基质时，结构基因被开放，从而产生了酶。,这样的过程叫做,诱导作用,或,脱阻遏作用,，这种酶叫做可诱导酶。,12,诱导作用示意图,13,诱导物的种类,基质,基质的类似物,产物,14,基质,尿素酶的诱导物是尿素,15,基质的类似物,顺丁烯二酸 顺反异构酶,基质：顺丁烯二 酸,诱导物：丙二酸,16,产物,苄青霉素6-氨基青霉烷酸,如：加入苯醋酸 转化作用增强。,这里苯醋酸是反应的产物之一，该反应是可逆的。,17,调节诱变,诱变作用可用来消除酶形成时对加入诱导物的依赖性,调节诱变,18,突变位置与效果,突变位置的不同，效果也不同。,突变位置,：,调节基因 消除活性阻遏物的合成,操纵基因 失去结合阻遏物的能力,此时，诱导物就不被需要。,没有诱导物时，正常的产生诱导酶的突变体被称为,组成突变体,。,19,组成突变体的选择方法,将经受诱变的细胞群体接种在含有非诱导物的基质作为唯一碳源的琼脂培养基中，只有组成突变体可以生长。,在恒化器中，用含有限量浓度的基质诱导物，可选择出不再需要,半乳糖苷诱导物而且能产生高浓度半乳糖苷酶的大肠杆菌突变体,20,避免代谢物的阻遏作用,例一,苄青霉素转化为6-氨基青霉烷酸,该过程受葡萄糖、果糖或甘油的阻遏。,例二,顺丁烯二酸转化为反丁烯二酸的过程,草酰乙酸、苹果酸、反丁烯二酸有阻遏作用,21,渗透性,某些生物转化的进行依赖于细胞渗透性的改变，主要表现在,不易渗透的基质,产物被磷酸化的化合物,22,渗透性改变,渗透性可借助诱变作用或改变环境而增强或削弱，主要包括限制性生物素的加入或Mn,2+,23,产物被磷酸化的化合物,例如 嘧啶（或嘌呤） 合成相应的核苷酸，在此过程中，很难用正常的细胞来完成。,以,Mn2+,的一种限速生长浓度生长时，则细胞膜的组分发生变化，结果所需的酶及从属的基质（磷酸核糖焦磷酸），从细胞内漏出，因此，对催化生物转化过程有效。,用这样的细胞可进行下列转化作用,24,渗透性改变转化实例,次黄嘌呤次黄苷5,单磷酸,烟酸烟酸单核苷酸,腺嘌呤腺苷 5,单磷酸,鸟嘌呤鸟苷 5,单磷酸,当然这种方法也可用来生产核苷5,二磷酸、核苷5,三磷酸,25,不易渗透的基质的转化,某些基质的不溶性，显然在生物转化中带来困难。,26,改变基质的不溶性方法,将不溶性基质变成可利用基质的常用方法一般有：,加入精细分散的悬浮液,加入Tween 80,加入可溶性的络合物与酯类等。,例如： 在转化甾体化合物时，加入环硼酸盐络合物，可使甾类化合物溶解度增加20,000倍。,27,辅代谢作用,在许多生物转化中常常存在两种基质,1.用于微生物生长基质1,2.被转化为所需产物基质2,例如,pseudomona,s在含有正十六烷的培养基中，能将正戊基苯转化为苯丙烯酸。其中正十六烷能促进,pseudomonas,生长。,辅代谢技术在生物转化用昂贵的基质时，是很经济的。而且还能转化不能支持微生物生长的物质。,28,避免产物的抑制作用,有时生物转化受产物的抑制是一个重要的问题。,末端产物的阻遏,作用亦称之为,反馈阻遏,。,细胞内物质代谢反应链中，某些中间代谢物或末端产物过量累积，阻遏了代谢途径中某些酶合成的现象。,29,产物的抑制作用实例,细菌合成色氨酸,当菌体内有少量色氨酸时，调节蛋白为非活性，不能与操纵基因结合，当环境中有大量色氨酸时，无活性的阻遏蛋白与色氨酸结合，形成活性阻遏蛋白，使转录进行不能，从而抑制色氨酸合成。,A,E,B,C,D,E,色氨酸,30,第三章 介绍生物转化的常见反应类型,以甾体化合物的生物转化为例进行阐述,甾体化合物和甾体药物简介,甾体化合物结构,甾类化合物常见种类,31,甾体化合物和甾体药物简介,1952年，美国普强药厂的Morray和Pereroon首次利用黑根霉将黄体同转化为11,黄体酮，人们开始认识到甾体微生物转化在甾体药物生产中的重要性。,微生物几乎对甾体的每个位置都能进行转化。,几种重要的甾体微生物转化发应如羟化，脱氢成为工业上生产甾体激素及其类似物的重要手段,32,甾体化合物,一类含有环戊烷多菲核的化合物,在甾核的第10，13位常常含有角甲基；在3，11,17位，可能有羟基、酮基；A，B环有部分双键；17位有不同的测链。,33,目前甾体微生物转化中受到人们广泛关注的领域,将微生物基因工程的新技术应用于甾体微生物转化,提高水不容性底物的溶解度,细胞和酶的固定化以利于酶的重复经济利用,发展经济有效的产物连续回收方式,将环糊精等应用于培养基以提高产量,34,甾体化合物结构,35,甾体化合物编号,36,甾类化合物常见种类,动物组织中：,胆固醇、胆酸、皮脂素、皮脂醇（氢化可的松）、皮脂酮等,睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。,植物中：,薯芋皂豆甾醇,酵母细胞：,麦角固醇,37,甾体类激素药,肾上腺皮脂激素类,可的松、强的松、氢化可的松,功能：,抗炎、抗毒、抗过敏,对风湿、类风湿性关节炎、红斑狼疮等有治疗作用。,生殖腺激素,孕酮、雌酮,功能：,调节内分泌,人工合成避孕药,长效孕酮等,38,微生物在甾体药物生产中的应用,主要分为两大类,将天然原料转化为生产甾体化合物的普通中间体。,如植物皂角苷羟化生成皂角苷配基,降解甾醇边链生成有用的甾体化合物中间体，,雄甾4烯3，17二酮；,雄甾1，4二烯3，17二酮。,转化成特殊的甾体化合物的中间体，以生产我们所需要的产物。,如：甾体11,，11,及16,羟化，,1 脱氢,甾体边链降解,39,微生物对甾体化合物的转化,微生物对甾体化合物的转化多种多样,它们对甾体的每一位置上的原子或基团都有可能进行生物转化。,其反应类型主要有氧化、还原、水解、酯化等等。,包括甾体母核上和测链上的某个位置的羟基化、酮基化、环氧化、脱氢形成双链、芳香化、开环、形成内酯、侧链断裂、降解。,40,羟基化反应,是甾体微生物转化中最重要的反应。,化学法除了较容易在,C17,引入羟基外，在其他位置都很难引入羟基。,41,微生物对甾体的羟基化作用,微生物能在甾体的任何位置进行羟基化发应，也可在非甾类有机分子上羟基化。,简单的羟基化作用是在甾体的某个位置上引入O原子。,在甾核上至少有21个位置可以发生。,11位羟基化作用最重要，11位C的氧化对可的松药物疗效是不可缺少的，11,，11。,除11位C进行羟基化反应外，9,，14,，16,的羟基化，在制备甾体药物时，生产皮质甾类化合物及其类似物。,42,进行甾体羟基化作用的微生物,转化物质,作用位置,微生物代表,孕酮,11,11,黑根霉、黑曲霉、腊状杆菌等,弯曲孢霉,化合物S,11,11,黑根霉、黑曲霉、焦曲霉构巢曲霉,假单孢杆菌、弗氏链霉菌、梨头霉,11脱氧皮脂酮,11,弯月弯孢霉,雌二醇,16,巨大芽孢杆菌,43,羟基化反应机理,44,羟基化反应,由于这些酶能将一摩尔分子氧引入底物，因此被定义位单氧化酶。,这种细胞色素p450依赖的单氧化酶存在于几乎所有形式的生命体中，以游离或膜结合的形式存在。,45,同位素实验证明,46,甾体羟基化中存在的问题,47,其他重要的羟基化反应,地索高诺酮（destogestrel） 新型避孕药（荷兰Organon公司推出）,作用：月经周期控制好，副作用少，避孕可靠,我国研究：上海医科大学史纪平,19去甲基13乙基雄甾4烯3，17双酮11,羟基化（金龟子绿僵菌）形成关键中间体,简化合成路线，降低副反应。,底物：0.2% 转化率：36,48,甾体的边链降解,49,甾体边链降解,甾体母核降解,50,51,3,羟基,5,甾醇,9,羟基化，1，2脱氢,3酮,4,化合物,微生物种类不同,1，2脱氢，9,羟基化,52,甾体边链降解,采用类似脂肪酸,氧化的氧化过程，最后形成C,17,酮甾体。,53,54,选择性甾体边链降解措施1,对甾醇进行结构改造，从而阻止酶对母核的降解,例如：1965 Sih等 将胆固醇先行改造为19羟基衍生物,再经一步微生物转化为A环芳香化的雌酚酮。,55,选择性甾体边链降解措施2,加入酶抑制剂，抑制母核降解关键酶如：C1，2脱氢酶和9,羟化酶。,如：,Ni Co Pb Se,8羟基喹啉应用于多种分枝杆菌对胆固醇的选性边链降解,金属鳌合剂 2，2双联吡啶 抑制母核降解,56,选择性甾体边链降解措施3,（3）对菌株进行诱变，产生仅降解甾醇侧链的突变株,例如：,原始菌株经诱变为,诱变菌株Mycobacterium sp，NRRL-B3683,不加抑制剂，便产生雄甾1，4二烯3，17二酮（ADD）,再诱变得Mycobacterium sp，NRRL-B3805，,无C1，2脱氢酶,能产生雄甾4烯3，17二酮（AD）,57,基因工程新技术的应用,专利：,Pseudomonas 菌株无降解甾体的能力,将Mycobacterium sp NRRL-3683 的DNA导入Pseudomonas 菌株中获得重组菌。,重组菌可在水相，一种或几种有机相中进行转化反应。,Pseudomonas 菌株比Mycobacterium sp NRRL-3683的生长输率快,结果加快转化进程，降低成本,。,58,方法,分离纯化Mycobacterium sp NRRL-3683 的DNA,整合到特定质粒载体中,导入,噬菌体中,用入,噬菌体感染E。coli HB101，得E。coli重组子,三亲杂交实现Mycobacterium sp NRRL-3683 的DNA到Pseudomonas 菌株得转移。,59,如何提高甾体边链降解的产率,接触,60,引入氧形成酮基甾体氧化途径之二,61,羟基氧化为酮基,62,脱氢作用使甾体核形成双键,强的松（去氢可的松）是可的松经脱氢而形成的，其抗炎功效比可的松高几倍。一般制备该种药物时，常常是将可的松或氢化可的松脱氢变为去氢可的松或去氢氢化可的松。,63,A环芳香化,所谓A环芳香化是指甾体A环核上的每个C原子都脱氢形成双键，而变为芳香化结构。雌性激素的生产（雌二醇），可通过此方法获得,脱氢反应的常见微生物为：简单节杆菌、各种芽孢杆菌（蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌）、镰刀霉、长蠕孢菌属。,64,侧链降解,微生物对甾体侧链的降解，解决了天然甾体化合物作原料合成甾体激素的问题，为利用原价的原料开辟了新的途径。,常见微生物有：,简单节杆菌,球形芽孢杆菌,玫瑰芽孢杆菌,淡紫青霉,藤黄诺卡氏菌,65,