实验二蛋白质含量测定凯氏定氮法1

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验二,蛋白质含量,的测定,凯氏定氮法,一 目的：,学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验原理,掌握蒸馏、滴定操作技术,三聚氰胺,C,3,N,6,H,6,“,蛋白精,”,1,二、原理：,蛋白质含,N,量约为16，测出含氮量推知蛋白含量。,消化：,有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮,- -,硫酸铵。添加硫酸铜和硫酸钾的混合物，前者为催化剂，后者提高硫酸沸点。,CH,2,NH,2,COOH+3H,2,SO,4,2,CO,2,+3SO,2,十,4,H,2,O,十,NH,3,2NH,3,+H,2,SO,4,(,NH,4,),2,SO,4,蒸馏吸收：,浓碱使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到硼酸溶液中，硼酸吸氨后使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂变色,(NH,4,),2,SO,4,+ 2NaOH Na,2,SO,4,+ 2H,2,O + 2NH,3,NH,3,+ HBO,2, NH,4,BO,2,（,H,3,BO,3,HBO,2,+ H,2,O,）,滴定：,标准,HCl,滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，根据所用标准酸的摩尔数,(,相当于待测物中氨的摩尔数,)，,计算出样品中的总氮量。,NH,4,BO,2,+ HCl HBO,2,+NH,4,Cl,消化,蒸馏、吸收,滴定,2,三、试剂与器材,1,、消化液：,H,2,O,2,：,H,2,S0,4,：,H,2,O=3,：,2,：,1,2,、,粉末硫酸钾硫酸铜混合物,K,2,S0,4,与,CuS0,4,.,5H,2,0,以 3,：,1,混合,3,、,30,氢氧化钠溶液,4,、,2,硼酸溶液,5,、标准盐酸溶液,(,约,0,.,01 mol,L),6,、,混合指示剂,(,田氏指示剂,),由,50,mL 0,.,1,甲烯蓝乙醇溶液与,200,mL 0,.,1,甲基红乙醇溶液混合配成，棕色瓶贮存。,酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。,7,、待测样品,1.,凯氏烧瓶,2.,凯氏定氮仪,3.,分析天平,4.,酸式滴定管,5.,烘箱,6.,消化炉,7.,容量瓶,等等,3,四、操作方法,1. 消化前样品处理,固体样品,:,某一固体样品中的含氮量是用,100,g,该物质,(,干重,),中所含氮的,g,数来表示,(,),。,固体样品,105,烘干至恒重。,用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥,1,小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。,若样品为液体,(,如血清等,),，可取一定体积样品直接消化测定。,4,2、,消化,取凯氏烧瓶 标号。各加,几,颗玻璃珠,;,1,及,2,号瓶中各加样品,0.1,g,，,催化剂,200 mg,，,消化液,5,mL,。,3,及,4,号瓶中各加相同量的催化剂和消化液,-,对照，以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。,消化开始时应控制火力，不使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出,SO,2,白烟后，适当加强火力消化，直至消化液呈透明淡绿色。,定容：冷却后，加蒸馏水,(,慢加，随加随摇,),。将瓶中液体倾入,5,0 mL,或,100 mL,容量瓶，并以蒸馏水洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶，定容。,加样时应直接送人瓶底，不要沾在瓶口和瓶颈上。,5,3,、蒸馏吸收：,改进型凯氏定氮仪,特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。,1),水蒸汽发生器和反应室,2),冷凝器和通气室,3),排水柱,关键：搞清水管系统,6,蒸馏器的洗涤,.,接通冷凝水，向蒸汽发生器中加入一定量的水,(,以排水口高度为宜,)，,酒精灯加热烧开。,.,水的自动喷出：,将蒸馏水从加样室加入反应室,将酒精灯移开片刻，反应室内水自动喷出到蒸汽发生器,打开蒸汽发生器出水口，放水。,如此反复清洗,3-5,次。,.,清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有,5,mL,，,2,硼酸溶液和,1,2,滴指示剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。,7,蒸馏吸收,准备:,取,50,mL,锥形瓶,3,个，各加入,5,mL,硼酸溶液和,1,滴指示剂,，溶液呈淡紫色，表面皿覆盖备用。,关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将锥形瓶放在冷凝器下，冷凝器下端浸没在液体内。,加样:,移液管取,3 mL,消化液（空白液和样品消化液分别做），加入反应室，,用小量筒加,NaOH,溶液,5,mL,，关闭自由夹，少量水封口。,蒸馏:,关闭自由夹，打开冷凝水,。,点燃酒精灯，,蒸馏开始，锥形瓶中溶液由淡紫色变绿时,(,约,2,-,3,分钟,),开始计时，蒸馏,3,分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约,1,cm,，,继续蒸馏,1,分钟，取下锥形瓶，表面皿覆盖。,蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。 重复,3,次。最后将自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。,8,4、滴定,全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。,注意：使用前检查酸式滴定管漏不漏？漏的话，涂凡士林,滴定时一边滴一边摇，防止滴定过头！,及时记录读数,要求：空白液,1,次，样品消化液,2,次,9,5、计算,总氮量,(),=,c,为标准盐酸溶液摩尔浓度,(,0.0098,M),；,V,1,为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均,mL,数；,V,2,为滴定空白液用去的盐酸溶液,mL,数；,w,为样品重量,(,1,g),。,14,为氮的相对量子质量。,消化液总量,500,ml,蒸馏时消化液用量,3,ml,样品蛋白质含量(),=,总氮量6,.25,10,注意事项,冷凝水的开、关,自由夹：中间,酒精灯：加到,2/3,，防止燃烧中途不够,蒸汽发生器中：水到瓶颈凹陷处,火焰,小心照看，防止反应液喷出,防止烧到橡胶管,冷凝管末端不用时防在干净的烧杯中，防止,NaOH,污染,空白：蒸,10,分钟未变色，再蒸,3,分钟,铁架台：夹子口朝上,11,思考题,1,、何谓消化？如何判断消化终点？,2,、在实验中加入粉末硫酸钾硫酸铜混合物的作用是什么？,3,、固体样品为什么要烘干？,4,、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？,5,、如何证明蒸馏器洗涤干净？,6,、本实验应如何避免误差？,12,