常用的生物学实验方法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验方法,1,一、概述,实验室的实验方法是多种多样的，我们将要在实验室进行的工作大致可以分为三个方向：,1.培养,2.血清学,3.分子生物学,2,二、分子生物学实验,分子生物学实验的范围很广泛，在这我只简单的介绍一下最基础和常用的几个实验：,1.从抗凝血中提白细胞,2.从细菌中制备基因组DNA,3.PCR,3,三、从抗凝血中提白细胞,试剂：,红细胞裂解液,双蒸水,步骤：,1.将采来的抗凝血离心4000rpm/30分钟/15。,2.将分界面的那层白细胞吸到2ml管中。,3.向管中加红细胞裂解液，离心3000rpm/10分钟/15，弃去上清。再加入红细胞裂解液，离心，弃上清，如此反复，直至无红色。,4.最后加入双蒸水，离心，弃上清，备用。,4,注意事项：,1.步骤2中，吸取白细胞时尽量小心。,2.步骤3、4中离心速率时间都相同。,3.最后一步中洗出白细胞后，如当时不继续实验，应加入保护液。20保存。,5,四、,从细菌中制备基因组DNA,材料：,TE缓冲液（每15lTE缓冲液加1lRNA酶）,10%（m/V）十二烷基硫酸钠（SDS）,20mg/ml蛋白酶K（分成单次使用的小份贮存于20）,5mol/L NaCl,CTAB/NaCl溶液,24：1氯仿/异戊醇,25：24：1酚/氯仿/异戊醇,异丙醇,70%乙醇,6,步骤：,1.培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.5ml的培养物3000rpm离心10分钟。,2.沉淀物加入567l的TE缓冲液，用吸管反复吹打，使之重悬。加入30l 10%的SDS和3l 20 mg/ml蛋白酶K，混匀，用封口膜封口37水浴4小时（水浴前震荡摇匀，每30分钟摇匀一次）或者37温箱过夜。,3.加入100l 5mol/L NaCl，充分混匀，再加入80lCTAB/NaCl溶液，轻轻颠倒混匀，65水浴10分钟。,从这一步开始可以去除多糖和其他污染的大分子。,4.加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀，离心13000rpm/10分钟/4。将上清液转入一个新管中，如果难以移出上清，先用牙签除去界面物质。,7,5.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀，离心13000rpm/10分钟/4，将上清液转入一只新管中。,对于某些细菌菌株由于氯仿抽提后形成的界面不够紧密，不容易移出上清液，这种情况下，在移出上清液之前，用无菌牙签挑出大部分的界面物质，残存的CTAB沉淀物随后在酚/氯仿抽提中被除去。,6.加入0.6体积异丙醇，轻轻颠倒混合，直至DNA沉淀下来，13000rpm/20分钟/4，用一个封口的巴斯德管将沉淀转移至500 l的70%乙醇中洗涤。,7.离心13000rpm/8分钟，弃上清，用冻干机稍加干燥或者在无菌台内自然风干，重溶于3050l的TE缓冲液。,8,注意事项：,1.如果是从白细胞中提取DNA，那么步骤1可以省略。如果白细胞量较大，步骤2中可以加入两倍的试剂。,2.步骤2中加入蛋白酶K后，于37温箱过夜，提取效果更好。,3.CTAB/NaCl溶液需要提前融化，并且在使用前放在60温水中，以免凝固。,4.25：24：1酚/氯仿/异戊醇，需要提前一天配好，放4保存。,9,五、PCR,一 原理,聚合酶链反应简称PCR，是体外酶促合成、扩增特定DNA片段的一种方法。其原理是：,在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液（Mg2+）的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。,10,二 标准的PCR扩增方案,（一）在0.5ml的离心管中反应体系混合物为：,1.模板：DNA/cDNA,2.引物：PrimerF,PrimerR（18-40个碱基的核酸）,3.底物：4种dNTP,4.酶：Taq酶,5.10倍Buffer,6. Mgcl2,7. H2O,11,（二）可以按如下温度程序，进行25-30个循环的PCR反应。,1.变性：96,，,15s,2.引物退火：55,，,30s,3.引物延伸：72,，,1.5min,12,三 实验结果检验,1 2 3 4,5,6 7 8 9 10,1 marker 1kb 10,l,2 S19 (,新酶0.5,l ),3 B.abortus 4 (,新酶0.5,l ),4 S19 (,新酶0.7,l ),5 B.abortus 4 (,新酶0.7,l ),6 S19 (,旧酶0.25,l ),7 B.abortus 4 (,旧酶0.25,l ),8 S19 (,旧酶0. 5,l ),9 B.abortus 4 (,旧酶0. 5,l ),10,marker 100bp 5,l,13,四 PCR反应的类型,1.PCR,2.RT-PCR（反转录PCR）,3.套式PCR,4.多重PCR,5.不对称PCR,6.原位PCR,7.重组PCR,8.免疫PCR,14,分子生物学的研究范围广泛，实验抽象，这就要求我们多查相关资料，在实验当中，要理论联系实际，不懂就虚心求教。还有一些常用的实验，我就不详细介绍了，同学们可以看看相关的资料：,1.质粒DNA的提取,2.核酸分子杂交,3.基因重组,4.重组体导入受体细胞,5.外源基因（加载体）导入受体细胞,15,最后预祝同学们在不久后的实验,室工作中一切顺利取得成功！,16,