3.细胞工程(shi)

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,3,细胞工程,学习目的,了解制备植物细胞及微生物细胞的原生质体并进行细胞融合的基本方法。学习如何进行动植物细胞及组织的培养方法。认识单倍体植物的诱发及人工种子制备的基本要领。探讨植物脱除病毒的途径和检测手段。掌握利用动物体细胞克隆哺乳动物的基本做法及其重要意义。领会人类干细胞研究的原理和光明前景。,3.1,细胞工程的基础知识与基本技术,细胞工程,3,细胞工程,3.1.1,基础知识,原核细胞：,DNA,裸露，生长迅速，易于操作；但具细胞壁，表达真核基因受一定限制。,真核细胞：接近人类需要，但具细胞周期，要同步化培养；生长慢，植物细胞和真菌细胞具细胞壁。,3.1.2,基本操作,3.1.2.1,无菌操作概念与技术,细胞工程,3.1,细胞工程的基础知识与基本技术,无菌室布局、卫生、消毒、超净台,3.1.2.2,细胞培养技术,取样 灭菌 培养 传代 收获,除菌 取样,3.1.2.3,细胞融合技术,原生质体 融合 筛选 鉴定,细胞工程,3.1.2,基本操作,3.2,植物细胞工程,细胞工程,3,细胞工程,植物组织培养,悬浮细胞培养和次生代谢物生产,花药及单倍体植株培养,原生质体制备与细胞融合,人工种子制备,植物脱病毒技术,3.2.1,植物组织培养,细胞工程,3.2,植物细胞工程,在无菌和人工控制营养及环境条件下研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长、发育的技术。,全世界通过植物细胞培养再生成植株已超过,600,种，已使许多具有重要经济价值的果树、药材、蔬菜和花卉等实现商品化生产。,离体的,植物器官、组织、细胞,脱分化,愈伤,组织,再分化,芽,根,植物体,培养,细胞工程,3.2.1,植物组织培养,植物组培的基本过程,细胞工程,3.2.1,植物组织培养,选择合适的外植体,外植体大小要适宜,外植体的部位影响分化能力和器官分化类型,外植体的年龄影响其分化率,同一植物不同部位的分化需不同的生长素,/,激动素比例,不同物种的相同部位外植体分化能力不一样,3.2.1.1,预备阶段,细胞工程,3.2.1,植物组织培养,除菌与接种,自来水多次漂洗 消毒剂处理 无菌水反复冲洗,外植体,无菌滤纸吸干 切割,无菌,外植体,细胞工程,3.2.1.1,预备阶段,小块外植体,置培养基上,培养,消毒剂 使用浓度,/%,清除 消毒时间,/min,灭菌效果,次氯酸钠,2,容易,530,很好,次氯酸钙,910,容易,530,很好,漂白粉 饱和溶液 容易,530,很好,升汞,0.11,较难,210,最好,酒精,7075,容易,0.22,好,过氧化氢,1012,最容易,515,好,溴水,12,容易,210,很好,硝酸银,1,较难,530,好,抗生素,450 mg/L,中等,3060,较好,常用消毒剂的使用和效果,细胞工程,3.2.1.1,预备阶段,基本组分,微量无机物,微量有机物,琼脂,细胞工程,3.2.1.1,预备阶段,培养基配置,添加较高浓度的生长素,固体培养,液体培养,光照培养,黑暗培养,3.2.1.2,诱导去分化阶段,细胞工程,3.2.1,植物组织培养,吲哚乙酸（,IAA,）,常用,1,10mg/L,吲哚丁酸（,IBA,）,常用,1,5,mg/L,2,，,4-D,（,2,，,4-,二氯苯氧乙酸），常用,10,-5,10,-7,mol/L,萘乙酸（,NAA,），常用,1.0,mg/L,生长素类激素,细胞工程,3.2.1.2,诱导去分化阶段,细胞分裂素类激素,激动素（,KT,）,6-,苄氨基嘌呤（,6-BA,）,玉米素,先加少量碱液预溶,细胞工程,3.2.1.2,诱导去分化阶段,3.2.1.3,继代增殖阶段,移植扩增,分割继代,细胞工程,3.2.1,植物组织培养,光照培养室,细胞工程,3.2.1.3,继代增殖阶段,生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分化具有协同作用，它们的量以及比例的不同，对细胞分化起着重要的作用。,外植体本身内源激素水平的差异，导致它们分化时对培养基中所添加的这两种激素量及其比例反应不尽相同。,3.2.1.4,生根长芽阶段,细胞工程,3.2.1,植物组织培养,细胞工程,3.2.1.4,生根长芽阶段,保湿是,关键,避免强光直射,温度适宜,3.2.1.5,移栽成活阶段,细胞工程,3.2.1,植物组织培养,手指玫瑰,细胞工程,3.2.1.5,移栽成活阶段,3.2.2,植物细胞培养和次生代谢物生产,细胞工程,3.2,植物细胞工程,植物细胞培养罐,产量,物 种,天然产物,细胞培养,原植物,橘叶鸡眼藤,蒽醌,900,g/g,干重,110,g/g,干重,决明,蒽醌,鲜重的,0.334%,种子干重的,0.21%,长春花,蛇根碱,干重的,1.3%,干重的,0.26 %,三角叶薯蓣,薯蓣皂苷,26mg/g,干重,20mg/g,干块根,人参,人参皂角苷,鲜重的,0.38%,鲜重的,0.3% ,3.3%,烟草,烟碱,干重的,3.4%,干重的,2% ,5%,烟草,泛醌,0.5mg/g,干重,16mg/g,干叶,大红罂粟,蒂巴因,130mg/g,干重,140mg/g,干叶,细胞培养,和,原植物,的天然产物量的比较,细胞工程,3.2.2,植物细胞培养和次生代谢物的生产,氨基酸、核酸、蛋白质、碳水化合物、脂类、维生素、有机酸,抗白血病药、抗肿瘤药、抗病毒药、抗微生物药、 酶抑制剂,色素、香料、甜味剂、鸦片、杀虫剂、激素、强心苷、核苷酸,橡胶、阿司匹林、奎宁、可卡因,从植物培养细胞中获得的各类物质,细胞工程,3.2.2,植物细胞培养和次生代谢物的生产,1.,成批培养（封闭式培养）,优点：易于操作；,次生代谢物含量高。,缺点：效率低。,2.,半连续和连续培养,封闭式植物细胞培养系统,3.2.2.1,悬浮培养,细胞工程,3.2.2,植物细胞培养和次生代谢物的生产,次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性,细胞固定化有利于组织化的形成；,细胞固定化有利于在细胞团内外形成化学物质和物理因素的梯度，这是高产次生代谢物的关键；,细胞固定化有利于对外环境参数进行调控；,细胞固定化有利于回收次生代谢物。,3.2.2.2,固定化细胞培养系统,细胞工程,3.2.2,植物细胞培养和次生代谢物的生产,平床培养系统,优点：制作简单；,能生产较多次生代谢物。,缺点：占地面积大；,分化区比例较小；,0,2,供应受限。,细胞工程,3.2.2.2,固定化细胞培养系统,褐藻酸钙固定细胞,无菌大量培养植物细胞,等量混合,注入尼龙网,配制,4%,褐藻酸钠，灭菌,氯化钙溶液（,2%,）浸浴 褐藻酸钙固定的细胞团,立柱培养系统,细胞工程,3.2.2.2,固定化细胞培养系统,立柱培养系统示意图,细胞工程,3.2.2.2,固定化细胞培养系统,立柱培养系统操作要素,取静止期细胞，并使细胞达到一定密度；,控制营养液的成分（包括激素）、浓度及,O,2,供应；,某些种的细胞培养需光照；,尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细胞内释出的植物（品种）。,细胞工程,3.2.2.2,固定化细胞培养系统,3.2.3,植物原生质体制备与融合,细胞工程,3.2,植物细胞工程,植物原生质体,几个名词：,原生质体（,protoplast):,去除全部细胞壁的细胞,亚原生质体（,subprotoplast,):,只,含有部分原生质的原生质体（有核或无核）,微原生质体（,miniprotoplast,):,经,细胞松弛素,B,处理得到的仅含少量胞质及核或染色体的小原生质体,原生质球（球状体，,spheroplast,):,残存少量细胞壁的原生质体,细胞工程,3.2.3,植物原生质体制备与融合,外植体除菌,外植体酶解,（纤维素酶为主）,除菌后叶片 撕去下表皮 切块放入反应,不时轻摇 反应液转绿,细胞工程,3.2.3,植物原生质体制备与融合,25,30,24h,3.2.3.1,原生质体的制备,原生质体分离,过滤法,离心法（低速）,漂浮法（不同比重）,细胞工程,3.2.3.1,原生质体的制备,双亲本,原生质体,滴加聚乙二醇,25,保温,15,45min,滴加高钙高,pH,溶液,培养液,洗 涤,筛选,鉴定,目的植株,细胞工程,3.2.3,植物原生质体制备与融合,3.2.3.2,原生质体的融合,野生马铃薯和栽培马铃薯细胞融合,融合前,融合,2 min,融合,3 min,融合,10 min,细胞工程,3.2.3.2,原生质体的融合,设想中的,“,番茄,-,马铃薯,”,细胞工程,3.2.3.2,原生质体的融合,3.2.4,单倍体植物的诱发与利用,细胞工程,3.2,植物细胞工程,单倍体植物的特点,一套染色体,株矮，叶、花、果小，生活力弱,高度不育,加倍后可得到纯合隐性基因表达植株,单倍体植株的培育,选取成熟度适中的花药,离体成熟花粉培养,未授粉子房或胚珠的培养,杂交法获单倍体植株,选择适当的培养基（添加激素、脯氨酸等）,适当密植,细胞工程,3.2.4,单倍体植物的诱发与利用,单倍体植物的加倍,秋水仙素（,0.2%,0.4,%,）处理,24,48h,全苗或根或芽,处理后洗净，弱光保湿培养,细胞工程,3.2.4,单倍体植物的诱发与利用,3.2.5,人工种子的研制,细胞工程,3.2,植物细胞工程,人工种子：含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。,人工种子的构成,：,胚状体：由组织培养或细胞培养产生,人工胚乳：营养物质,+,激素,+,农药,+,抗生素,+,除草剂等,人工种皮：抗压，保水，透气,细胞工程,3.2.5,人工种子的研制,3.2.5.1,人工种子的构成及特点,人工种子的优点,不受环境因素制约,全年进行工厂化生产,无性繁殖有利于保存该种系的优良性状,成本低，适合于机械化播种,可添加营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等，以利胚状体的健康生长,细胞工程,3.2.5.1,人工种子的构成及特点,胚状体,褐藻酸钠,（终浓度,4,%,）,混匀,合成胚乳,1015min,CaCl,2,（,2.0 %,2.5 %,）,圆形胶囊,圆形人工种子,无菌水漂洗,干燥处理,捞起,3.2.5.2,人工种子的制备,细胞工程,3.2.5,人工种子的研制,细胞工程,3.2.5.2,人工种子的制备,反应池,CaCl,2,储罐,多管滴嘴,细胞工程,3.2.5.2,人工种子的制备,大量制备人工种子,物理方法：温度（高温）,化学方法：孔雀绿等（难）,生物学方法：芽尖、根尖,综合脱毒方法,3.2.6.1,植物脱毒途径,细胞工程,3.2,植物细胞工程,3.2.6,植物脱病毒技术,生物学方法,茎尖培养,茎尖越小越没病毒，但越小越难成活,一般要超过,2,万个细胞，或至少,310 mg,茎尖。,花瓣培养,花药培养,细胞工程,3.2.6.1,植物脱毒途径,植物脱毒处理,植物茎,除菌,超净台,无菌,植物茎,超净台,无菌切割,无菌茎尖,无菌培养,无菌苗,脱毒苗,检测,细胞工程,3.2.6.1,植物脱毒途径,种子脱毒,诱导植物进入种子繁殖阶段，形成种子、未成熟种子或种子胚,检验其是否带毒,取无病毒种子胚进行组培快速繁殖,浙江大学专利（,2004,）,细胞工程,3.2.6.1,植物脱毒途径,外形观察法,电镜法,免疫血清法,离心去渣,植物组织匀浆 上清液 纯化病毒,待检植物匀浆上清液,动物免疫 抗血清（抗体）,免疫检测,3.2.6.2,植物脱毒检测,细胞工程,3.2.6,植物脱病毒技术,植物脱病毒进展,脱毒马铃薯（青海）,染病毒的普通马铃薯亩产约,1,吨，脱病毒的马铃薯亩产达,4,吨。,脱毒草莓,鲜红色，酸甜适口，果汁丰润，果香四溢。,脱毒唐菖蒲,长势旺盛，花色艳，品质提高,1,2,个等级。,脱毒水仙,鳞茎大，花枝多，花期长。,细胞工程,3.2.6,植物脱病毒技术,3.3,动物细胞工程,细胞工程,3,细胞工程,动物细胞与组织培养,动物细胞融合,动物细胞核移植与胚胎克隆,淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体,染色体转移与基因转移,细胞系,（,cell line),原代培养物经首次传代成功后的细胞培养物，包括有限细胞系和连续细胞系。,细胞株,（,cell strain),通过选择或克隆从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的培养物。,细胞工程,3.3,动物细胞工程,制备动物细胞,无菌取出目的组织 无菌组织 小组织块,细胞 移放培养瓶,抗生素漂洗,离心洗涤,细胞工程,3.3,动物细胞工程,培养液漂洗,切割,解离液,3.3.1.1,细胞培养法,3.3.1,动物细胞组织培养,细胞工程,3.3.1.1,细胞培养法,微导管法,以醋酸纤维素或硝酸纤维素构成空心纤维管，搭成多层培养床。管内通空气，管外为培养液,微载体法,葡萄糖等聚合物形成直径,50500,m,的微球,悬浮培养液中 细胞贴附生长,微胶囊法,细胞与褐藻酸钠混合液 滴入,CaCl,2,中,褐藻酸钙胶囊 悬浮培养,细胞工程,3.3.1.1,细胞培养法,动物细胞培养器,细胞工程,3.3.1.1,细胞培养法,动物表面消毒 获组织 小组织块,无菌刀切,加培养液,吸放培养瓶,组织块,长大,传代,众多组织块,培养液、抗生素漂洗,解剖,静置培养（,37,）,3.3.1.2,组织培养法,细胞工程,3.3.1,动物细胞组织培养,培养细胞 贴壁细胞游离,弃上清,细胞沉淀 悬浮细胞,培养,细胞工程,3.3.1,动物细胞组织培养,加新培养液,分瓶,离心,胰酶,EDTA,3.3.1.3,培养物的传代,3.3.1.4,无血清培养,细胞和组织的体外培养一般都需添加一定量的血清，不仅价格昂贵、容易混进污染物,(,包括病毒和病菌,),，而且其成分不能完全确定，不同批次的血清之间难以保证实验结果的可重复性。因此无血清培养日益受到重视，并已取得了较大的进展。,细胞工程,3.3.1,动物细胞组织培养,3.3.1.5,培养物的长期保存,目前最常用的是液氮保存法：,将成熟培养物,(,细胞,),与,5%,10%,的甘油或二甲亚砜混匀，封装于若干个安瓿瓶中；,缓慢降温,(1,3/min),至,-,30,；,继续降温,(15,30/min),至,-,150,；,转移至液氮冻存，可无限期保存。,细胞工程,3.3.1,动物细胞组织培养,微生物污染,细菌污染,真菌污染,支原体污染,病毒污染,其他细胞污染,3.3.1.6,细胞组织培养污染的防治,细胞工程,3.3.1,动物细胞组织培养,污染源 治 理,细菌 青霉素（,200U/,mL),链霉素（,200,g/mL),真菌 制霉菌素（,100U/,mL),支原体 卡那霉素（,100,g/mL,，不能根除,),病毒 ？,其他细胞,1.,同一工作面不能有其他细胞系存在,2.,两种细胞系不能共用培养器具,细胞工程,3.3.1.6,细胞组织培养污染的防治,3.3.2,动物细胞融合,3.3.2.1,病毒诱导融合,细胞工程,3.3,动物细胞工程,双亲本细胞,灭活仙台病毒,（疱疹病毒，副黏液病毒）,细胞沉淀,细胞凝集,各种融合子,混匀，冰浴,20min,，,稍摇,37,30 min,洗涤,选择培养基,所需的融合子,分别制悬液,混合离心,细胞工程,3.3.2.1,病毒诱导融合,1974,年，高国南发现,PEG,能诱导植物细胞原生质体融合,1975,年，,Pontecorvo,用,PEG,法融合动物细胞取得成功,悬浮法,PEG,4000,40% ,50%,，,处理,12min,;,离心法,PEG,1000,30% ,40%,，,离心,58min,;,(,可加,5% ,15%,二甲亚砜）,细胞工程,3.3.2,动物细胞融合,3.3.2.2,化学诱导融合,杂种细胞筛选,抗药筛选,营养缺陷筛选,细胞工程,3.3.2.2,化学诱导融合,3.3.3,淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体,细胞工程,3.3,动物细胞工程,B,淋巴细胞,（脾）,浆细胞 特异抗体,融和,小鼠骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞,2002,年,12,月神舟,4,号飞船搭载,B,淋巴细胞和骨髓瘤细胞升空进行细胞融合实验,特异抗体,产生,产生,筛选,细胞工程,3.3.3,淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术,抗原,记忆细胞,淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术示意图,细胞工程,3.3.3,淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术,3.3.4,细胞核移植与动物克隆,细胞工程,3.3,动物细胞工程,将细胞的各部件进行重新组合装配，主要有,核移植,、叶绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等技术。,细胞核的制备,显微操作法,细胞松弛,素,B,处理法,细胞培养,获得,核质体,和,胞质体,离心,细胞松弛素,B,处理,3.3.4.1,细胞核移植,细胞工程,3.3.4,细胞核移植与动物克隆,3.3.4.2,体细胞克隆,细胞工程,3.3.4,细胞核移植与动物克隆,维尔穆特等用羊乳腺细胞克隆了多莉,（,1996,）,取,434,个绵羊乳腺细胞的细胞核与同等数量的去核卵电激融合,277,个融合细胞（,63.8,%,） 移入母羊输卵管发育，成功,247,个（,89.2%,） 发育到桑椹胚,29,个（,11.7%,） 分别植入,13,只母羊子宫 仅生一只“多莉”（,0.23%,）,细胞工程,3.3.4.2,体细胞克隆,“多莉（,Dolly,）”的身世,1.,从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度营养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为,供体细胞,；,2.,从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；,3.,利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了,融合细胞,，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成,胚胎细胞，,进行早期胚胎发育；,4.,将早期胚胎转移到苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只,小绵羊,。,细胞工程,3.3.4.2,体细胞克隆,细胞工程,3.3.4.2,体细胞克隆,克隆哺乳动物基本途径,取出体细胞核,未受精卵去核,异核卵 早期胚胎,化学或电激诱导融合,产下幼畜,假孕状态,植入代孕母畜子宫中,细胞工程,3.3.4.2,体细胞克隆,体外发育,自体克隆的小母马,Prometea,细胞工程,3.3.4.2,体细胞克隆,细胞工程,3.3.4.2,体细胞克隆,2004,年,2,月,15,日，,美国爱达荷大学的研究人员在西雅图的美国科学年会上展示三头克隆骡子,世界首例成年体细胞克隆水牛,2005,年,3,月,17,日在广西大学“,863,计划”良种牛南方繁殖中心诞生,细胞工程,3.3.4.2,体细胞克隆,2005,年,4,月,24,日韩国科学家培育出首只克隆狗 “史纳皮”（,snuppy,）,细胞工程,3.3.4.2,体细胞克隆,我国第一头体细胞克隆猪诞生,经中国农业大学李宁教授领导的课题组一年多的科技攻关，,2005,年,8,月,5,日，我国第一头体细胞克隆猪终于在河北省三河成功诞生,细胞工程,3.3.4.2,体细胞克隆,2005,年,12,月,8,日中国科学院动物研究所用山羊克隆的一只亚洲黄羊,(,左,),与普通山羊一起在山东临沂亮相,国际首例体细胞异种克隆亚洲黄羊临沂降生,细胞工程,3.3.4.2,体细胞克隆,世界冠军赛马“斯卡普”被克隆成功,世界速度赛马冠军查尔马妮,詹姆士,2006,年,11,月,16,日对外宣布，她向德克萨斯州奥斯汀的,ViaGen,公司支付了,15,万美元,在四次尝试失败后，最终在今年,8,月,8,日成功克隆了她的赛马,夺得过十项世界冠军的“斯卡普”，产下小马驹“克莱顿”,细胞工程,3.3.4.2,体细胞克隆,东北农业大学刘忠华教授带领的课题组，把水母绿色荧光蛋白基因转移到猪胎儿成纤维细胞的基因组中，再把转基因体细胞的细胞核移植到成熟的去核猪卵母细胞中构建成转基因胚胎。再将其植入受体母猪，经过,114,天的发育，,2006,年,12,月,22,日成功培育出国内首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪,中国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪问世,细胞工程,3.3.4.2,体细胞克隆,哺乳动物克隆存在的问题,流产率高；,难产率高；,畸形率高；,围产期死亡率高；,幼年死亡率高；,细胞工程,3.3.4.2,体细胞克隆,3.3.5,染色体转移,细胞工程,3.3,动物细胞工程,微细胞（微核体）介导,微细胞,(,minicell,),：只含有一至几条染色体、少量细胞质和完整质膜的核质体。,优点：,简化供体,受体细胞受影响小,染色体很少损坏或不损坏,微细胞制备,秋水仙素,，,816h,细胞松弛素,B,，,46h,供体细胞培养 中期细胞 大小细胞悬液,12 000,g,，,10min,细胞松弛素,B,，,0.51h,39 000,g, 20min,含微细胞上清液 微细胞,无血清培养基悬浮 滤膜过滤 微细胞,微细胞沉淀,线性梯度,BSA,悬浮 分别离心 微细胞,细胞工程,3.3.5,染色体转移,微细胞与受体细胞融合,微细胞（百万个）,含植物凝集素,P,的无血清培养基,受体细胞,吸去植物凝集素,P,加,PEG,1540,（,30% ,50%,）,吸去,PEG,液 无血清培养基洗涤,3,次,加完全培养基，胰酶消化 收获离散细胞,分装培养瓶 选择培养基筛选,细胞工程,3.3.5,染色体转移,悬浮液,细胞凝集,37 ,1015min,1 min,1624h,，,37 ,细胞工程,3.3,动物细胞工程,3.3.6,人类干细胞研究,3.3.6.1,干细胞（,stem,cell,）简介,干细胞是动物（包括人）胚胎及器官中具有,自我复制,和,多向分化潜能,的原始细胞，能分裂、产生出表现型和基因型都和自己完全相同的子细胞，同时还能分化为各类,祖细胞,，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。,细胞工程,3.3.6,人类干细胞研究,干细胞的特征,具有无限增殖分裂的能力,长期保持自我稳定的能力,长期保持分化成其他细胞的可能性,产生新细胞是对组织（细胞）损伤的反应,以对称和（或）不对称两种方式进行生长：或保持不分化状态，或不可逆地向终末分化,细胞工程,3.3.6.1,干细胞简介,干细胞的应用,干细胞生物学研究与应用几乎涉及所有生命科学和生物医药学领域。,除了在细胞治疗、组织器官移植、基因治疗具重要意义外，还将在新基因发现与基因功能分析、发育生物学研究、新药开发与药效以及毒性评估等领域产生极其重要的影响。,细胞工程,3.3.6.1,干细胞简介,1999,年干细胞研究被世界著名杂志,Science,评为十大科技进展之首；,2000,年再度入选世界十大科技进展,细胞工程,3.3.6.1,干细胞简介,中国支持治疗性克隆研究,中国科学院副院长陈竺院士,2002,年,7,月指出：“一个体外的胚胎在有限的时间，如,14,天里，尚属一般的生物细胞，此时还没有神经细胞和脑细胞的产生，既无知觉也无感觉，因此科学界一般认为它在此时还不是一个道德意义上的人。,人类干细胞研究给,21,世纪医学的革命性发展带来可能，因此总的平衡利弊，还是要支持”。,陈竺副院长还强调，在支持的同时还要有严厉的法律、法规来保证这样的技术发展能真正造福人类。,细胞工程,3.3.6.1,干细胞简介,国家干细胞基地通过验收,天津国家干细胞工程产品产业化基地建筑面积,1.9,万,m,2,，建设总投资,1.18,亿元，,2004,年初建成。,天津脐带血造血干细胞库是目前世界规模最大的干细胞库之一，日处理脐带血能力,100,份，可储存量达,30,万份。,天津脐带血库还在国内首创了自体血储存，并创建公共储存与自体储存相结合模式，已在全国,19,个省市建立,70,多家分公司和工作站，储存新生儿脐带血干细胞,3,万余份，为数十位患者提供了移植供体。,细胞工程,3.3.6.1,干细胞简介,干细胞分类,全能性干细胞（,totipotent,stem,cell,）,多能性干细胞,(pluripotent,stem,cell),单能性干细胞,(unipotent,stem,cell),细胞工程,3.3.6.1,干细胞简介,干细胞分类示意图,全能干细胞,多能干细胞,细胞工程,3.3.6.1,干细胞简介,干细胞研究“三步曲”,获得干细胞系,;,建立干细胞诱导分化模型,;,将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织，考察其效果。,细胞工程,3.3.6.1,干细胞简介,获得干细胞系,这是本研究最重要的第一步。可以从动物或人的早期胚胎或各器官、组织中分离并经鉴定，且能在体外长期保持干细胞特性（一般应稳定传,25,代以上）；,细胞工程,3.3.6.1,干细胞简介,干细胞培养,饲养层细胞,提供附植环境,饲养层细胞分泌物对维持干细胞的生长、抑制分化起重要作用；,人类胚胎干细胞（,ESC,）可用小鼠纤维母细胞作饲养层，但效果不十分理想；可用人输卵管上皮细胞作饲养层。,培养液,细胞工程,3.3.6.1,干细胞简介,建立干细胞诱导分化模型,可利用基因工程手段引入外源目,的基因（对原有致病基因进行置,换改造）,探索诱导干细胞向特定组织、器,官分化的化学和（或）物理条件,细胞工程,3.3.6.1,干细胞简介,效果考察,将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织中，考察其效果。,2006,年,12,月,27,日旅美学者张曙光等报道，发明了一种由蛋白质纳米纤维组成的三维支架结构，其中每个蛋白质纤维是人的头发丝的,1/5 000,，支架结构中包含的孔洞是针眼的,1/20 000,。,干细胞能够在这种“脚手架”上生长、繁殖并分化成脑细胞。这种“脚手架”比现有的任何细胞培养系更接近生物活体本身。,细胞工程,3.3.6.1,干细胞简介,干细胞治疗的优点,低毒性（或无毒性），一次治疗有效；,不需要完全了解疾病发病的确切机理；,用自身干细胞移植，可避免产生免疫排斥反应。,细胞工程,3.3.6.1,干细胞简介,胚胎干细胞,（,embryonic,stem,cell,，,ESC,）是从哺乳动物囊胚内细胞团（,inner cell mass,）和原生殖细胞（,primodial,germ,cell,，,PGC,）分离并克隆培养出来的原始、未分化细胞，具有自我复制、更新和发育全能性并能产生后代的,早期胚胎细胞。,3.3.6.2,胚胎干细胞,细胞工程,3.3.6,人类干细胞研究,胚泡中的胚胎干细胞,受精后,57,天，胚胎由大约,140,个细胞组成，呈空心圆球状，即,胚泡。,胚泡中央的腔称,囊胚腔。,胚泡囊胚腔一侧的细胞群即为,胚胎干细胞。,胚胎干细胞可能发育成完整的个体，或演变成构成人体任何器官、组织的细胞。,细胞工程,3.3.6.2,胚胎干细胞,桑椹胚,(,囊胚,),细胞工程,3.3.6.2,胚胎干细胞,人早期胚胎,囊胚,细胞工程,3.3.6.2,胚胎干细胞,胚胎干细胞的特征,饲养层依赖的,有抑制因子存在时呈未,分化状态,无抑制因子存在时可被,诱导成各种细胞,悬浮培养时可形成拟胚,体，并有序分化,细胞工程,3.3.6.2,胚胎干细胞,胚胎干细胞的培养,将胚胎干细胞置于滋养层上；,放入,CO,2,（,5%,）,培养箱中，,37,39,饱和湿度；,培养液：,DMEM + 15%,胎牛血清,+LIF+EGF,（,表皮生长因子）,+IGF,（,胰岛素样生长因子）,+,胰岛素,+-,巯基乙醇。,细胞工程,3.3.6.2,胚胎干细胞,鼠胚胎干细胞培育出胰岛细胞,2002,年,2,月日本京都大学再生医学科学研究所用,鼠胚胎干细胞培育出胰岛细胞,，并将它们转移到,3,只患糖尿病的实验鼠体内，一周后实验鼠的血糖值都正常。,细胞工程,3.3.6.2,胚胎干细胞,胚胎干细胞生成牛微型肾,2002,年,2,月美国马萨诸塞州的先进细胞技术公司从母牛耳朵取皮肤细胞的细胞核，与去核卵电激融合，形成早期胚胎。取出其中的胚胎干细胞，放在肾形可降解“支架”上生长，获得外形和功能都似,牛肾的微型器官,，可泌尿，存活数月，不被排斥。,细胞工程,3.3.6.2,胚胎干细胞,中国建立人胚胎干细胞,2002,年,10,月广州中山大学附属第二医院黄绍良教授等在国内首次建立三个中国人胚胎干细胞系,CHE1,、,CHE2,和,CHE3,，并采用分阶段方法成功诱导小鼠胚胎干细胞发育成造血干细胞。,细胞工程,3.3.6.2,胚胎干细胞,3.3.6.3,造血干细胞,两个特征,高度的自我更新或自我复制能力,;,可分化为各类血细胞,(,不对称分裂,),。,造血干细胞仅占骨髓有核细胞的,0.5%,细胞工程,3.3.6,人类干细胞研究,三类造血干细胞,脐血干细胞（约占脐血组织的,0.4,%,）,骨髓造血干细胞（约占骨髓造血组织的,0.1,%,）,外周血干细胞（约占外周血单核细胞的,0.1% 0.01 %,）,它们各自的优缺点？,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,造血干细胞的分化,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,造血干细胞表面标志物,CD34,分子是目前应用最广泛的造血干细胞的表面阳性标志；,CD34,分子是一种跨膜黏蛋白，在造血干细胞、造血祖细胞、小血管内皮细胞以及胚胎成纤维细胞表面表达；,CD34,+,细胞不全是造血干细胞，但造血干细胞表面都具有,CD34,分子；,Lin,-,CD34,-,细胞中有些是比,CD34,+,造血干细胞更原始的前体细胞。,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,骨髓库,建立骨髓库是造血干细胞移植的必然需要；,美国骨髓供者库是世界最大的骨髓库，已有注册志愿者,500,多万人；,欧洲，约,300,万份；,日本，,18,万份；,台湾骨髓捐赠中心已有志愿者,24,万人。已经为约,200,人（其中内地近,100,人）提供了骨髓；,中国内地，到,2006,年,3,月，中华骨髓库入库,HLA,分型资料为,36,万份,，为患者检索配型,1,万多人次，仅可以使,50%,患者初配成功；,我国有大约,400,万名白血病患者等待骨髓移植；,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,造血干细胞培育出人体肾脏组织,2006,年,12,月，日本东京慈惠会医科大学和自治医科大学的研究人员从人体骨髓液中提取干细胞，将其植入,11,天半大的大白鼠胚胎内可能长出肾脏的部位。,两天后，人体干细胞就分化为承担肾脏主要功能的丝球体和尿细管。将它们移植到其他大白鼠腹腔中的大网膜内，结果新的血管开始朝着丝球体的方向延伸。植入的组织最终发育成只有普通大白鼠肾脏,1/10,大小的人体肾脏组织。,这项技术成熟后，可将肾功能衰竭患者的骨髓干细胞植入猪等动物的胚胎内，在干细胞分化成肾脏组织后再植回患者体内。等大网膜内的血管延伸到移植组织后，这些组织就能过滤尿液。这样，患者既不需要人工透析，也不必等待肾脏捐献者。,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,造血干细胞移植供者来源难题破解,2007,年,1,月,8,日，北京大学人民医院报道：他们已建立了“,HLA,不合造血干细胞移植技术体系”，使六个位点中部分不合者也获得治疗机会。标志我国在这一领域的创新性研究居于世界领先水平。,他们已使,3/6,相合的亲属间骨髓移植成为常规。由于,3/6,相合亲属可来源于父母、同胞、堂兄妹、表亲之一，因此，几乎能为,100,的人群找到供者，这从根本上解决了供者来源问题。,迄今采用该配型不合技术体系，完成,HLA,不合移植,300,多例，总体生存率达到,60,70,。,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,外周血干细胞移植,优点,：,无需麻醉，采集方便，可重采；重建造血功能快，免疫功能恢复早；感染等并发症轻；混入肿瘤细胞的机会较少。,缺点：,细胞少，仅占外周血有核细胞的,0.01%,0.1,%,，相当于骨髓干细胞的,1% 10%,；操作较复杂；要有一定条件和设备；费用比骨髓干细胞移植高。,外周血,CD34,+,细胞是造血干细胞的重要来源。,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,外周血干细胞移植治疗下肢缺血性疾病,2005,年,8,月国家干细胞工程技术研究中心主任韩忠朝教授报道，在国际上率先开展外周血干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的研究，建立了一个安全有效、简单经济的新方法。,已治疗的,45,例患者（,12,例动脉闭塞症，,28,例糖尿病足，,5,例血栓闭塞性脉管炎）全部取得显著疗效，使患者避免截肢的痛苦。,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,脐血干细胞,脐带血的优点：,含丰富的造血干细胞和（或）祖细胞（约,1%,，与骨髓相同，为外周血的,12,16,倍）；,免疫原（抗原）性较弱（主要含不成熟,T,细胞）；,增殖快，集落形成率高；,所需细胞数少；,来源广泛。,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,脐血干细胞是更原始的干细胞,脐血造血干细胞中的,CD34,+,CD38,-,细胞的百分比明显高于外周血和骨髓，提示,脐血造血干细胞中含有较多更为原始的造血干细胞。,脐带血造血干细胞移植时双方的白细胞组织相容性抗原无须完全相合，,同胞间有,75,的机会适合移植，非亲属间适合移植的机会相对较多，,并且手术后也较少发生排异反应。,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,用脐带血细胞培育出肝细胞,2003,年,3,月东京医科齿科大学教授寺冈弘文领导的研究小组，从婴儿的脐带血中提取细胞，加入对肝细胞的生成有促进作用的一些物质，经过一段时间的培养，这些细胞,生成了肝细胞,，并且开始分泌只有肝脏才能合成的白蛋白。,目前治疗严重肝病只能依靠肝脏移植，但肝脏的来源得不到保证；用人体胚胎干细胞生成肝细胞正在研究之中，但存在伦理方面的争议。如果用脐带血细胞培育出大量肝细胞，并将它们注入患者的肝脏，有可能开辟治愈肝病的新途径。,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,脐带血干细胞修复脊髓,2004,年,12,月，一名瘫痪长达,20,年的韩国女子黄美顺，在韩国科学家用脐带血修复她受损的脊髓后，又重新获得站立和蹒跚行走的能力。,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,脐血库,美国纽约脐血库是世界最大的脐血库，,1993,年建成。,1998,年存有,8 700,份，,2005,年约存有,80 000,份脐血。已为世界,600,多例患者进行了脐血移植；,西欧、加拿大、日本和韩国等相继建立国家脐血库；,北京、天津、上海、济南、杭州、成都和广州分别建立了脐血库，已有脐血,15 000,多份；,2005,年世界约有,5 000,个脐血库。,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,脐血库建造“生命银行”,脐血库被称做,“,生命的银行,”,，至,2005,年,7,月北京脐血库已经存储,1,万多例脐血。,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,脐带血储备,取血,50mL,婴儿出生脐带结扎,造血干细胞分离,添加冷冻保护剂,冷冻至,-80,保存在,-196,液氮中,细胞工程,3.3.6.3,造血干细胞,干细胞培育出胸腺,2002,年,6,月澳大利亚的莫纳什大学研究人员在世界上首次利用人干细胞培育出完整的功能齐全的,胸腺,。,细胞工程,3.3.6,人类干细胞研究,3.3.6.4,其他干细胞研究,干细胞长成牙冠,2002,年,9,月美国波士顿弗西斯研究中心从小猪体内提取牙齿干细胞，用酶催化后，放入可降解牙模中，再植入小鼠腹部。,30,周内，这些细胞,长成包含珐琅质和牙质的牙冠。,细胞工程,3.3.6.4,其他干细胞研究,神经干细胞治脑瘫,2005,年,6,月,6,日海军总医院宣布为一名刚出生,70,多天的脑瘫患儿娜娜进行神经移植手术取得了成功。,医生先从流产胎儿大脑中取出脑组织进行细胞培养和扩增 ，然后在娜娜头颅上穿刺，在,B,超的引导下，用探针将健康的神经干细胞种进娜娜受损的大脑。,17,天后，娜娜会笑了，眼神灵活了，可以玩拨浪鼓，还能认出妈妈，智力发育已经追上了同龄婴儿。,这种治疗小儿脑瘫的方法尚属世界首例。,细胞工程,3.3.6.4,其他干细胞研究,干细胞形成脑组织,2002,年,10,月韩国与美国的科学家把干细胞置于可被吸收的生化塑料小架子上，再放到受中风严重破坏的老鼠脑部。一个月之内，干细胞,形成了新的脑部组织,，还刺激原有的脑细胞生长。受损的部位已经大部分恢复。,细胞工程,3.3.6.4,其他干细胞研究,单个干细胞使小鼠生成乳腺,2006,年,1,月澳大利亚墨尔本的沃尔特,-,伊丽莎白霍尔研究所的科学家发现乳腺组织中有一种细胞具有干细胞的特性，,只要有一个这样的细胞，,科学家就可能在实验室,中培养出一个具备完全,功能的乳腺。,细胞工程,3.3.6.4,其他干细胞研究,干细胞治尿失禁,2004,年,10,月，奥地利因斯布鲁克医科大学科学家报告说，他们从,20,名患有尿失禁症女性的手臂取干细胞，培养,6,周后，借助超声波三维显示，将干细胞注入她们的尿道和括约肌。,术后,24h,内，多数患者表示，尿漏症停止，尿道和括约肌力量和功能得到恢复。一年之后，其中,18,名患者都能自控小便。,细胞工程,3.3.6.4,其他干细胞研究,干细胞首次培育出内脏细胞,美国科学家,2005,年,10,月宣布找到一种在实验室培育内脏器官细胞的方法。几乎囊括了胰腺、肝脏与肺在内的所有内脏器官细胞。这一科研成果，对于疾病治疗、研究生命演变等都具有极其重大的意义。,关键在于，科学家成功地将胚胎干细胞转变为一种,内脏原始细胞,。这种原始细胞可以适应并转化为各种内脏器官细胞，也意味着人类利用干细胞组合成人体器官的时代已为时不远。,细胞工程,3.3.6.4,其他干细胞研究,首次成功移植人造再生膀胱,新科学家,杂志,2006,年,4,月,4,日报道，美国科学家研制成人造膀胱移植到病人的体内，临床试验获得了成功。,首先，科学家从每个患者的膀胱中提取半张普通邮票大小的活细胞样本，剥下胶原质，将肌肉细胞和膀胱上皮细胞分别置于不同的培养器皿中培育。利用这种方法培育的细胞可以在两个月内迅速增长。,经过,7,到,8,个星期，原先的数万个细胞已经繁殖到,15,亿个左右。接下来，科学家通过精细的手术，将这种新膀胱移植入患者体内。这样，新器官会继续生长，并与老器官“重组”，取代老器官中丧失功能的部分。先后在,7,名患者身上取得成功。,细胞工程,3.3.6.4,其他干细胞研究,干细胞培育出心脏瓣膜,在,2006,年,11,月,15,日的美国心脏学会科学年会上,瑞士苏黎世大学的,西蒙,赫斯特鲁普博士等,研究者报告,他们首次利用胎儿羊水中提取的干细胞培育出人类,心脏瓣膜,。这为将来修复有缺陷的心脏提供了一种革命性的方法,也避免了可能的伦理学争议。,细胞工程,3.3.6.4,其他干细胞研究,羊水干细胞培育出人体组织,美国科学家,2007,年,1,月,7,日宣布，在子宫的羊水中发现了丰富的干细胞来源，并利用这些干细胞培育出多种人体组织。这项成果不仅避免了关于胚胎干细胞的伦理争论，而且为今后的医学治疗开辟了新途径。为器官移植提供了更大可能性。,这项研究由美国维克森林大学和哈佛大学的科学家共同进行，研究成果发表在,自然,-,遗传学,上。研究发现，从羊水中提取的干细胞含有大量与胚胎干细胞相同的成分，,可以培育成各种人体组织，如大脑、肝脏和骨骼,等。,细胞工程,3.3.6.4,其他干细胞研究,干细胞器官工程的难点,地球重力限制了细胞的三维生长；,离体培养难以确保器官形成所需的多种条件；,细胞间相互促进或抑制的机理尚未研究清楚；,细胞工程,3.3.6.4,其他干细胞研究,3.4,微生物细胞工程,3.4.1,原核细胞的原生质体融合,细胞工程,3,细胞工程,溶菌酶的作用,溶菌酶可分解革兰氏阳性菌（,G,+,）细胞,壁,;,溶菌酶要分解革兰氏阴性菌（,G,-,）细胞壁,须,添加,EDTANa,2,(,乙二胺四乙酸,);,提高溶菌酶作用效率的因素,:,菌龄,:,指数生长期,;,预处理,:,酸,碱,热,冷,表面活性剂,巯基乙醇,丙酮，三氯乙酸，,EDTANa,2,。,细胞工程,3.4.1,原核细胞的原生质体融合,革兰氏阳性菌融合的主要步骤,实验菌,30,振摇,5,10,7,CFU/mL,离心,菌沉淀,高渗液悬浮,菌悬液,加溶菌酶,混合双亲本,双亲本溶菌液,约,30min,双亲本原生质体,离心,原生质体沉淀,加,1/10,体积 高渗液,加,PEG,6000,（,40,）,原生质体凝集,约,1min,高渗液适量稀释,融合细胞,融合子悬浮液,筛选,传代,融合子,验证,细胞工程,3.4.1,原核细胞的原生质体融合,革兰氏阴性菌球状体制备,大肠杆菌,培养,37,摇动,菌悬液,(,OD,450,=0.9),离心,菌沉淀,10mmol/L,Tris(pH8.0),缓冲液洗,2,次,离心,菌沉淀,加,100mmol/L,Tris(pH8.0),缓冲液（包括,20%,蔗糖）,菌悬液,37,摇,1min,加溶菌酶,(100g /,mL,),溶菌酶,-,大肠,杆菌悬浮液,37,轻摇,12min,加,0.1mol /L EDTANa,2,37,轻摇,12min,球状体,细胞工程,3.4.1,原核细胞的原生质体融合,融合子筛选,营养缺陷重组法,产生原养型细胞,产生新的重组缺陷型细胞,抗药标记法,产生双抗药重组细胞,细胞工程,3.4.1,原核细胞的原生质体融合,降解酵母细胞壁的酶,消解酶（,zymolase,）：,0.3mg/mL,纤维素酶（,cellulase,）,蜗牛酶,几丁质酶等,Drislase,3.4.2,真菌的原生质体融合,细胞工程,3.4,微生物细胞工程,丝状真菌的脱壁酶,消解酶（,zymolase,),新酶（,novozyme,),纤维素酶（,cellulase,),几丁质酶（,chicinase,),解螺旋酶（,helicase,),-D-,葡萄糖苷酸酶（,-D-glucuronidase,),细胞工程,3.4.2,真菌的原生质体融合,融合子分析,核,标记分析,细胞核染色：融合成一个核或异核体,DNA,含量测定,染色体核型分析,营养缺陷型纠正分析,细胞工程,3.4.2,真菌的原生质体融合,胞质标记分析,抗药性检测：由胞质中的质粒决定。,呼吸缺陷的纠正：,缺线粒体的酵母仍可呼吸，移入线粒体可大大提高呼吸效率。,细胞工程,3.4.2,真菌的原生质体融合,生化分析,特定代谢产物的量与质的分析,蛋白质电泳分析,细胞工程,3.4.2,真菌的原生质体融合,应用非选择标记,菌落形态，生长速度，孢子颜色，孢子形态，代谢产物（色素、抗生素、同工酶等）；,细胞工程,3.4.2,真菌的原生质体融合,复习思考题,如何从一片嫩叶经组织培养培育出众多的完整植株,?,如何从植物细胞培养中获得较高的次生代谢物产量,?,单倍体植株形单体弱,为什么还有不少科学家热衷于诱发产生单倍体植株,?,什么叫植物原生质体,?,如何进行植物原生质体的融合,?,可以采取哪些途径脱去植物体内的病毒？如何检测植株中是否还有病毒？,人工种子包括哪几部分,?,如何制备人工种子,?,怎样才能在体外大量培养哺乳动物细胞？,如何获得能在体外大量生长、分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆？,如何用体细胞克隆出一只哺乳动物,?,克隆动物有什么积极意义,?,开展干细胞研究对人类有何积极的意义？,有什么方法可以分别去除革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌的细胞壁？,细胞工程,3,细胞工程,主要参考文献,李建凡,.2002.,克隆技术,.,北京：化学工业出版社,李志勇,.2003.,细胞工程,.,北京：科学出版社,林加涵，魏文铃,.2001.,现代生物学实验,.,北京：高等教育出版社，施普林格出版社,刘广发,.2001.,现代生命科学概论,.,北京：科学出版社,马晓岚，陈大元,.,细说克隆牛,.,科学时报，,2002,年,3,月,12,日,裴雪涛,.2002.,干细胞克隆技术,.,北京：化学工业出版社,谢从华，柳俊,.2004.,植物细胞工程,.,北京：高等教育出版社,郑国锠,.2003.,植物细胞融合与细胞工程,.,兰州：兰州大学出版社,Muller W A,著,.1998.,发育生物学,.,黄秀英，劳为德，郑瑞珍等译,.,北京：高等教育出版社，施普林格出版社,Wilmut I et al. 1997.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature.385(6619):810,813,中国生物技术信息网,中国干细胞网,(,刘广发编