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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,实验十二 微丝的观察(荧光探针标记),1,一 实验目的,1 学会使用细胞涂片机,2 掌握微丝显示的方法,3 熟练使用荧光显微镜,2,二 实验原理,Actin-Tracker Green是一种Actin绿色荧光探针,可以用于培养细胞或组织切片的Actin特异性荧光染色。, Actin-Tracker Green探针为荧光染料FITC标记的毒蕈肽(phalloidin),即phalloidin-FITC,其分子量约为1251.4,最大激发波长为496nm,最大发射波长为516nm。, 本产品可以用于细胞或组织内的微丝(microfilament)的荧光检测。, 本产品使用时的推荐稀释比例为1:200。如果每个片子需要使用200l染色工作液,每个包装的本产品足够用于200个片子,3,三 实验步骤,a. 用PBS洗涤细胞或组织切片2次。或采用细胞涂片机离心涂片。,b. 用PBS配制的3.7%甲醛溶液室温固定细胞或组织切片约10分钟。注意:甲醇可以破坏actin蛋白,因此不能使用含有甲醇的固定液。并且尽量使用不含甲醇的甲醛。,c. 用或含0.1% Triton X-100的PBS洗涤2-4次,每次约5分钟。,d. 用含有2%BSA和0.1% Triton X-100的PBS按照1:200的比例稀释Actin-Tracker Green,例如5l Actin-Tracker Green用1ml稀释液稀释,稀释后的溶液即为Actin-Tracker Green染色工作液。,稀释比例可以根据实际染色效果进行适当调整。,e. 把Actin-tracker Green染色工作液按照每个片子约200l的比例滴加到片子上,室温避光孵育20-60分钟。为防止蒸发,孵育时最好将片子置于载玻片染色盒中,载玻片染色盒(FSR958)可以订购。,4,三 实验步骤,f. 用含0.1% Triton X-100的PBS洗2-4次,每次约5分钟。,g. 盖上盖玻片随后可以直接用荧光显微镜进行观察。为长期保存,可以在片子自然干燥后封片并于4避光保存,保存时间可长,达6个月左右。,荧光显微镜下观察结果,用绿光激发。,5,注意事项:,1 荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。,2 Phalloidin 有一定毒性(LD50 为2 mg/kg),1ml Actin-Tracker Green中的phalloidin少于0.01mg,使用时请注意适当防护。,3为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。,4 固各步洗细胞要轻,勿使细胞脱落。,5 用1%Triton X100 抽提杂蛋白要作预实验,抽提时间长将破坏细胞结构,抽提时间短背景干扰大。,6 鬼笔环肽标记微丝,染色时间勿太长,否则背景发红。在没有固定液3.7%甲醛PEMD的情况下,也可以用-20冷甲醇代替,但是效果较差。,7 细胞充分贴壁铺展时应力纤维较多,形态挺直。反之,细胞收缩变圆,应力纤维弯曲,甚至部分解聚消失而显得稀少。,8每步洗涤要充分,并吸去水分(但也不要干透),以免稀释下一步的抗体或试剂,这样才能得到清晰的荧光图像。,6,四 作业,微丝观察实验中,1%Triton X100 处理细胞的作用是什么?,此实验是否能看到微管、中间纤维?,为什么?,7,五 预期结果(共聚焦效果图),8,
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