实验二酵母菌大小的测定和细胞计数一实验目的学会测

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验二 酵母菌大小的测定和细胞计数,一、实验目的,1、学会测微尺和血球计数板的使用方法。,2、建立对微生物大小的概念。,二、实验材料,1、显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球计数 板、载玻片等。,2、麦芽汁培养基、酵母菌。,3、吸管、吸水纸等。,1,三、实验原理,(一)酵母菌大小的测定原理,所有微生物的大小需要用刻有一定刻度的测微尺来测量，先用绝对长度的物镜测微尺来校正不表示绝对长度的目镜测微尺，计算后者每格所代表的实际长度，然后放上待测的标本，用目镜测微尺测定标本上微生物细胞占目镜测微尺的格数，就可计算该微生物的大小。酵母菌的直径约8-10,m。,2,(二)酵母细胞计数原理,微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和间接计数法。前者利用血球计数板在显微镜下直接计数，能立即得到数值，但死活细胞都计数在内。后者是在乎板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时太长。本实验是利用血球计数板进行直接计数。计数前需对样品做适当稀释，按照规定方法及计算公式运算后，即可得出实际数值。,3,四、操作方法,(一)酵母菌大小测定的操作方法,1.测微尺的构造和使用方法,(1)目镜测微尺的构造 目镜测微尺是一块圆形玻片，其中央刻有精确的刻度，通常是将5mm划分为50格，实际每格等于100,m。刻度的大小是随使用的接目镜和接物镜的放大倍数而改变，用前必须用物镜测微尺来标定，,如图,。,(2),物镜测微尺的构造,物镜测微尺为一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈内刻有分度，将长,1mm,的直线等分为,100,小格，每小格等于,10,m,，,如图,。,4,2.目镜测微尺的标定,(1)取下接目镜，旋下目镜上的目透镜，将目镜测微尺放人接目镜的中隔板上，使有刻度的一面朝下，再旋上目透镜，并装入镜筒内。,(2)将物镜测微尺置于显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上，同观察标本一样，使具有刻度的小圆圈位于视野中央。,(3),先用低倍镜观察，对准焦距，待看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与物镜测微尺的刻度相平行，并使两尺的左边第一条线相重合，再向右寻找两尺的另外一条重合线。,如图,(4),记录二条重合线间的目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。,5,3.计算方式,(1)目镜测微尺每格长度=两个重叠刻度间物镜测微尺格数,10,两个重叠刻度间目镜测微尺格数,(2)以同样方法，分别在不同倍率的物镜下测定测微尺上每格的实际长度。,目镜测微尺( )格=物镜测微尺( )格,目镜测微尺每格=( ),(3),如此测定后的目镜测微尺的尺度，仅适用于测定时所用的显微镜的目镜和物镜的放大倍数。若更换物镜、目镜的放大倍数时，必须再进行校正标定。,6,4.酵母菌大小的测定,(1)取下物镜测微尺，换上酵母菌水浸制片。,(2)测量菌体的长度和宽度各占目镜测微尺几格，然后换算出菌体的实际长度。,(3),在同一标本上测定,5-10,个菌体，求其平均值。,7,(二)酵母细胞数的测定操作方法,1.,血球计数板的构造,血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面个刻有一个方格网。方格网上刻有,9,个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物计数用。这一大方格的长和宽各为,1m,，深度为，其体积为,0.1mm,3,。,8,计数室通常有两种规格。一种是大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造；它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16,25=25,16=400个小方格组成，见图。,2.血球计数板的使用,(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。,(2),样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数，以每小方格内含有,4-5,个酵母细胞为宜，一般稀释,10,倍即可。,9,(3)将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上加盖专用的厚玻片。,(4)将稀释后的酵母菌悬液，用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘，使菌液缓缓渗入，多余的菌液用吸水纸吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球计数室内。,(5),计数时，如果使用,16,格,25,格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下,4,个中格（即,100,个小格）的酵母菌数。如果,规格为,25,格,16,格的计数板,，除了取其,4,个对角方位外，还需再数中央的一个中格,(,即,80,个小方格,),的酵母菌数。,10,(6)当遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞)。,(7),对每个样品计数三次，取其平均值，按下列公式计算每,1ml,菌液中所含的酵母菌个数。,11,3.计算公式,(1)16格,25格的血球计数板计算公式：,酵母细胞数ml=100小格内酵母细胞个数,10040010,4,稀释倍数,(2)25格x16格的血球计数板计算公式：,酵母细胞数ml=80小格内酵母细胞个数,8040010,4,稀释倍数,12,4.血球计数板的清洁,血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用,95,的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。,13,五、思考题及实验作业,1.,若更换不同放大倍数的目镜和物镜时，必须用物镜测微尺标定目镜测微尺，这是为什么?,2.,利用血球计数板时，注入的菌液为什么不能过多?,3.,测定酵母细胞大小的结果。,(1)接目镜倍数是,；低倍镜倍数,；高倍镜倍数,。,(2)低倍镜下，接目镜测微尺,格=物镜测微尺,格。,目镜测微尺每格=,m。,(3)高倍镜下，接目镜测微尺,格=镜台测微尺,格。,目镜测微尺每格=,m。,(4)酵母菌测量结果填表,(5)酵母菌直接计数结果报告,每,1ml,样品含酵母细胞,个。,14,15,16,17,