实验一光学显微镜及其使用A

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞生物学实验规则,保持实验室和实验台面的整洁；,保持安静有序的实验秩序；,规范操作，爱护仪器设备；,不随意动用不必要的仪器设备，更不可在不懂操作规程的情况下或不按规范使用仪器设备；,实验结束后认真、完整地填写“仪器设备使用记录”，仪器运行出现异常或损坏要及时报告老师，不可私自拆装仪器；,鼓励提出实验设计或操作的改进意见；,独立完成实验报告。,1,周次,实验名称,学时数,6,光学显微镜构造和使用,3,7,叶绿体的荧光观察,3,8,线粒体和液泡系的超活染色与观察,3,9,红细胞凝集反应和细胞膜渗透性,3,10,巨噬细胞吞噬现象观察,3,11,蟾蜍骨髓细胞染色体标本制作,3,本学期细胞生物学实验开设项目和时间安排,2,实验一 光学显微镜构造和使用,一、实验目的,1 了解和掌握普通光镜、暗视场显微镜、相差、荧光、微分干涉差、倒置等显微镜的原理和使用方法。同时简单介绍电镜原理。,2 了解掌握光学显微镜的光路合轴方法，了解显微摄影的基本操作。,3,二、原理和方法,一）普通光学显微镜,1 普通明场光学显微镜各零部件构成：镜座、柱、筒、臂、转换器、载物台、调节器、光源及光源聚光镜，视场光阑、孔径光阑、镜台下聚光器、聚光器前透镜、物镜和目镜。,2 物镜的种类：消色差物镜、复消色差物镜、平场物镜。,3 显微镜的光路原理（略）,光源色光,视场光阑折射,孔径光阑,聚光镜,样品在物镜后焦平面成像,目镜观察,4,4 显微性能参数,显微镜的性能参数包括分辨率、放大率，焦点深度、视场宽度等。,1）分辨率：R=0.61 /N.A.； N.A.sin/2,式中：n=介质折射率；=孔径角（镜口角，物镜最边缘斜光线与显微镜光轴所成的交角），N.A.=数值孔径（镜口率，numeric aperture）。镜口角总是要小于180，所以sina/2的最大值必然小于1。,2）显微镜总放大率（Mt）=物镜放大率目镜放大率摄影透镜放大率；,有效放大率 = 物镜数值孔径的500-1000倍，故需根据物镜选配适宜的目镜。,5,5 显微镜的使用,1）光路合轴：镜检与摄影前，使照明光线与显微镜光轴合一即为光路合轴，整个过程涉及到聚光器调中和光源灯丝调中两部分，详细过程参阅教材。,2）光阑的调节：视场光阑用于控制照明光束可以限定视场大小；孔径光阑用于限定聚光器孔径大小。调节时以视场光阑内缘外切孔径光阑为基准。,6,二）暗视野显微镜,特殊部件：,暗视野聚光器/暗视野光挡,1 由于聚光器构造的特殊性，导致直射光线不能进入视野，此时视野黑暗。光线斜向照射时，样品产生散射光，一部分散射光线可以进入视野，在黑暗视野中样品边缘明亮。,2 暗视野光档：光挡直径取决于物镜数值孔径，光挡恰好能挡住物镜通光孔径。另一个问题是暗视场聚光器的调中。,7,暗视野照明方式,8,三）相差显微镜,部件构成：,环状光阑，相差物镜,1这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。光线经环状光阑投射样品的直射光和衍射光透过物镜相差板时，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4（波长），如果再增加或减少1/4，则光程差变为1/2，两束光合轴后相互干涉加强，振幅增大或减小，提高反差，造成不同的反差效果。,2 聚光器调中，需要借助调中望远镜调中。,9,四）微分干涉差显微镜,部件构成：,起偏器+DIC棱镜+DIC滑行器+检偏器,偏振器装在聚光器的前面，使光线发生线性偏振，聚光器前的DIC棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和y），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，两束光产生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个DIC棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器，检偏器与起偏器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差，成像效果有浮雕立体感。为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，改变影像的亮度，使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，三维立体感明显。,10,DIC显微镜下的硅藻,11,五）偏光显微镜,部件构成：,起偏器+检偏器,偏光显微镜用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是：其光源前有起偏器，使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器。检偏器偏振方向与起偏器垂直时则为正交偏光镜，这种显微镜的载物台一般是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。,12,13,六）荧光显微镜,1 短波光照射样品导致荧光分子被激发，分子能级跃迁，以光子的形式释放能量。,2 光源：,高压汞灯,，使用时需要预热十五分钟，断电后十分钟内不能重启。,3,滤色镜,：包括激发光滤镜和阻断滤镜。,4 汞灯使用前需聚焦调中。,14,七）倒置显微镜,光源在上，物镜在下，光路设计与普通显微镜正好相反，经常用于观察,工作距离较大,的样品，如观察培养的活细胞。,八) 电子显微镜,电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是用,电子束作照明源，用电磁场作透镜,，放大倍数最高可达近百万倍。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。,15,16,透射电子显微镜,17,