核酸化学02 - 2012生物化学

Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,第五章 核酸化学,Nucleic Acids,第三节 核酸的性质及纯度的测定,DNA,、,RNA,都是极性化合物，都微溶于水，不溶于,乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂；,核酸的钠盐比自由核酸易溶于水；,核酸、核苷酸、碱基在水中的溶解度依此减小；,不同核酸在盐溶液中溶解度不同；,一、核酸的溶解性：,核酸的酸碱性质,核酸的碱基、核苷、核苷酸均可发生解离,pH 4,时全部解离，呈多阴离子状态,二,.,核酸的水解,1,、酸水解,DNA,或,RNA,在酸性条件下都可被完全水解,生成戊糖,(,核糖和脱氧核糖）、碱（嘌呤碱和嘧啶碱）及磷酸；糖苷键比磷酸酯键易水解；嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键易水解；嘌呤碱与脱氧核糖的糖苷键最易水解。,如：用,98,100,的甲酸密封加热处理核酸至,175,C,，,2,小时，,DNA/RNA,都完全水解。,用三氟乙酸于,155,C,加热,DNA60,分钟，或处理,RNA80,分钟，此时嘧啶碱的回收率显著提高。,在酸、碱或酶的作用下，磷酸酯键、糖苷键都可被水解,水解,2,、碱水解,：,RNA,的磷酸酯键易被碱（,KOH,）,水解,，生成,2-,核苷酸或,3,核苷酸；,DNA,对碱稳定,，磷酸酯键不易被碱水解,。这是因为,DNA,的,脱氧核糖无,2,-OH,，,不能形成碱水解的中间产物，故对碱有一定抗性。在,1M,NaOH,加热,100,C,，,4,小时条件下，,可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸,。,由于,核苷酸,是两性电解质，在不同,pH,的溶液中,解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离子,对于含,A,、,G,、,C,的核苷酸而言，,pI,= pK,1,+ pK,2,2,当环境,pH ,pI,时， 核苷酸,-,pH,pH,离子化程度,pH,离子化程度,pH,尿苷酸碱基碱性极弱，实际测不出含氮环的解离曲线，故不能形成兼性离子。,核苷酸中磷酸基在糖环上的位置对其,PK,值,略有影响：距离小，由于静电场的作用，,PK,值应越,大。,利用核苷酸及其衍生物在一定,PH,条件下具有不同的解离特性，可用离子交换柱层析和电泳等方法分级分离之。,核苷酸的滴定曲线：,酸碱滴定可用于确定参与酸碱反应的基团的性质。,天然,DNA,与变性,DNA,的滴定曲线是不同的，双链解开后碱基即可参与酸碱滴定。,DNA,的酸碱滴定曲线对了解,DNA,的酸碱变性很有帮助。,三、紫外吸收,最大吸收波长：,260nm,核酸定量分析,核酸定性分析,核酸的紫外吸收,-,由碱基的共轭体系决定,由于嘌呤碱和嘧啶碱具有,共轭双键,，所以碱基、核苷、核苷酸、核酸都在,240,290nm,范围内有特征吸收。组分结构不同，紫外吸收也就不同。如,max AMP257nm,、,GMP,为,256nm,、,CMP,为,280nm,、,UMP,为,262nm,。,通常测定核酸及核苷酸选用,260nm,波长。,核酸的紫外吸收,应用：,1,、不同核苷酸有不同吸收特性，,可用紫外分光光度计进行定性、定量测定。,1,OD,相当于：,50g/ml DNA,40g/ml RNA,2,、,确定所提取的核酸是否纯品。,1,）,DNA,：,1.8,纯品,OD,260,/OD,280,1.8 RNA,污染,1.8 pro,污染,2,）,RNA,：,OD,260,/OD,280,2.0,纯品,OD,是,optical density,（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度,核酸的紫外吸收,四、变性、复性、分子杂交,1,、,DNA,变性（,DNA,denaturation,）：,DNA,变性是指在理化因素作用下，,DNA,分子中的氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开形成单链的过程。,DNA,的变性,(,denaturation,),方法：,过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,OD,260,增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性改变,DNA,变性的本质是双链间氢键的断裂,DNA,变性,增色效应：,DNA,变性时其溶液,OD,260,增高的现象。,当,DNA,的稀盐溶液加热到,80-100,时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。,80 90 100,100%,50%,OD,260,（,254,）,Tm,变性温度范围,融解温度（,melting,temperature,Tm,）：,DNA,热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度（,Tm,）或解链温度、变性温度。,实验室常用的方法,热变性,影响,T,m,值的因素,(1),溶液的性质,(2)DNA,的性质和组成,大肠杆菌,DNA,在不同浓度,KCl,溶液下的熔融温度曲线,GC,含量越高，,T,m,越大,（,1,）变性后理化性质改变,DNA,溶液的粘度降低,浮力密度增加,旋光偏振光改变,紫外吸收增加（高色效应）,高色效应（,hyperochromic,effect,）：,DNA,变性后，在,260nm,处的紫外吸收增高，称为高色效应或增色效应。,（,2,）变性后的,DNA,一级结构没有改变。,（,3,）融解温度（,melting,temperature,T,m,）：,DNA,热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度（,T,m,）,GC,含量越高，,T,m,越大,DNA,越长，,T,m,越大,溶液离子强度增高，,T,m,值增加,DNA,越纯，相变范围越小,2,、,DNA,复性,DNA,复性,(,renaturation,),的定义,:,在适当条件下，变性,DNA,的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为,复性,。,热变性的,DNA,经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为,退火,(annealing),。,减色效应,（,hypochromic,effect,）,:,DNA,复性时，其溶液,OD,260,降低。,DNA,复性,（三）,酶水解,磷酸二酯酶是非特异性水解磷酸二酯键的酶，如：蛇毒磷酸二酯酶、牛胰磷酸二酯酶；,核酸酶是专一性水解核酸的磷酸二酯酶。,1,、碱基的解离,嘌呤、嘧啶化合物杂环中的氮以及各取代基具有结合和释放质子的能力，所以这些物质既有碱性解离又有酸性解离的性质。,2,、核苷的解离,糖的存在增强了碱基酸性解离。,核苷酸在,240,290nm,的紫外波段有一强烈的吸收峰,不同核苷酸有不同的吸收特性，,Amax,在,260nm,附近,。,不同核苷酸有不同的吸收特性，可以通过紫外分光,光度计进行定性、定量或纯度的测定。,1,、 （,1,）,A,260,/A,280,1.8 DNA,含量纯,（,2,）,A,260,/A,280,2.0 RNA,含量纯,对于纯样：,A,260,1,代表双螺旋,DNA 50ug/mL,单链,DNA 40ug/mL,寡核苷酸,RNA 20ug/mL,对于不纯样：先进行琼脂糖凝胶电泳分离，然后经溴化乙錠染色，在紫外灯下粗略估含量。,2,、,（,p,）,摩尔磷吸光系数,A/CL =30.98A/WL,一般天然,DNA,的（,p,）,约为,6600,，,天然,RNA,的（,p,）,约为,7700,7800,。,核酸的,（,p,）,值较所含核苷酸单体的（,p,）,要低,40,50,，单链多核苷酸的（,p,）,比双螺旋结构多核苷酸的（,p,）,要高。,(p),增色效应，核酸变性,(p),减色效应，核酸复性,五,.,核酸的变性与复性,1.,核酸变性的定义,-,维持核酸空间构象的主要作用力氢键、碱基堆积力发生断裂,双螺旋结构解体,分子由双链变为单链,这个过程称为变性。,2.,引起变性的因素,:,加热、极端的,pH,、,有机溶剂、尿素、甲酰胺等。,3.,变性后的表现,:,分子由具有一定刚性变为无规则线团。,DNA,：,其稀盐溶液加热至,80,100,度，双螺旋结构即发生解体，两条链分开，形成无规则线团。表现出增色效应、粘度降低、浮力密度增大等。,变性作用发生在一个很窄的温度范围内，有一个相变的过程。,（一）,DNA,的变性,（,1,）,DNA,变性后的表现：,DNA,溶液粘度降低，沉降速度加快,有增色效应,(,由于碱基暴露,DNA A,260,增加,),。,（,2,）,T,m,值：,DNA,的热变性是一个跃变过程,当,A,260,光吸收达到最大值的一半时,所对应的温度称为熔点或熔解温度：,T,m,T,m,：,一般在,82,95,摄氏度左右。,DNA,的,T,m,值与下列因素有关,DNA,的均一性：均质,DNA,温度范围窄，异质,DNA,温,度范围宽,2) G,C,之含量：在一定条件下，,DNA,中,G,C,含量与,T,m,值成正比关系。经验公式：,3),介质中的离子强度：离子强度低，,T,m,低，宽，离子强度高，,T,m,高，窄。故应在含盐缓冲液中保存,DNA,（二）,RNA,的变性,：,RNA,只有局部双螺旋，变性表现不如,DNA,明显，变性曲线不陡，,T,m,值,较低。但,tRNA,双螺旋区较多，,T,m,值,较高，变性曲线较陡,（三）,DNA,的复性：,变性的,DNA,在适当条件下，两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构，许多物化性质得到恢复的过程，谓之复性,复性的条件：,1.,缓慢冷却,2. DNA,的浓度越大，复性越快,3. DNA,的片段越大，复性越慢,4. DNA,的重复序列越多，复性越快,复性反应的速度,(C,o t1/2,),：,C,o,为变性,DNA,复性时的初始浓度,以核苷酸的摩尔浓度表示；,t,为时间，以秒表示。,C,ot1/2,表示复性一半的摩尔浓度,在,DNA,变性后的复性过程中，如果将不同种类的,DNA,单链分子或,RNA,分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成,杂化双链,(,heteroduplex,),。,这种杂化双链可以在不同的,DNA,与,DNA,之间形成，也可以在,DNA,和,RNA,分子间或者,RNA,与,RNA,分子间形成。这种现象称为,核酸分子杂交,。,核酸分子杂交,(hybridization),核酸的杂交,DNA-DNA,杂交双链分子,变性,复性,不同来源的,DNA,分子,核酸分子杂交的应用,:,研究基因的位置,确定两种核酸序列的相似性,检测样品中的特异序列,基因芯片技术的基础,核酸探针（,nucleic acid probe,）,:,能特异性的探测带某一特定序列的,DNA,或,RNA,分子的标记核酸分子。,3,、核酸分子杂交,(hybridization),由不同来源的核酸单链形成杂化双链的过程,分子杂交技术的应用：基因克隆筛选、酶切图谱制作、特定基因序列的定量和定性、突变分析、疾病诊断等,第五节 核酸酶,(nucleases),核酸酶,是指所有可以水解核酸的酶,一、种类,1,、根据底物分类,DNase,、,RNase,；,单链核酸酶、双链核酸酶、杂合双链核酸酶,2,、根据催化部位分类：外切核酸酶和内切核酸酶,外切酶：,5,端,3,端或,3,端,5,端核酸外切酶。,内切酶：,限制性核酸内切酶和非限制性核酸内切酶。,限制性核酸内切酶,(restriction,endonucleases,),：能够识别,DNA,分子的特定核苷酸序列，并在识别位点或其周围断开,DNA,双链的一类核酸酶,参与,DNA,的合成与修复及,RNA,合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程,负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸,在消化液中降解食物中的核酸以利吸收,体外重组,DNA,技术中的重要工具酶,生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解,二、核酸酶的功能,三、核 酶,催化性,DNA (,DNAzyme,),人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解,RNA,。,催化性,RNA (,ribozyme,),作为序列特异性的核酸内切酶降解,mRNA,。,第六节核酸的核苷酸序列测定,一、化学裂解法：标、切、分、染、读,二、酶解法,(,测,RNA),：标、切、分、染、读,三、合成终止法：标、合、分、染、读,Sanger,测定,DNA,核苷酸序列的方法：,DNA,合成终止法（双脱氧,DNA,链合成终止法）。,重要内容：,1,、重要名词：,anticodon,；,DNA,denaturation,；,melting temperature,（,Tm,）；,hyperochromic,effect,；,renaturation,；,annealing,；,hybridization,；,ribozyme,2,、结构层次,元素组成：,C,、,H,、,O,、,N,、,P(911%),结构单位：核苷酸（,DNA,和,RNA,组分的异同；核苷酸的功能）,一级结构,：,3, 5,磷酸二酯键；,5,端,3,端；,RNA,类型及结构和功能特点,二级结构：,DNA,双螺旋；,tRNA,“,三叶草”,三级结构特点：,DNA,超螺旋结构；,tRNA,“,倒,L”,结构,3,、重要性质：,紫外吸收；变性、分子杂交,一、酸性化合物,两性解离，但酸性强,电泳行为,泳向正极（,pH7-8,）,二、高分子性质,粘度,DNARNA,超离心沉降,凝胶过滤,分子大小单位：分子量（道尔顿，,D,）、碱基对数目（,bp,）、离心沉降常数（,S,）,沉淀行为,加盐（中和电荷）；乙醇,三,.,核酸的水解,紫外吸收,1. DNA,或,RNA,的定量,OD,260,=1.0,相当于,50,g/ml,双链,DNA,40,g/ml,单链,DNA,（或,RNA,）,20,g/ml,寡核苷酸,2.,判断核酸样品的纯度,DNA,纯品,:,OD,260,/OD,280,= 1.8,RNA,纯品,:,OD,260,/OD,280,= 2.0,OD,260,的应用,碱基的结构特征,嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有吸收（,260 nm,左右）。,