食品中蛋白质含量的测定

,闽北职业技术学院食品与生物工程系,食品中蛋白质含量的测定,食品安全检验技术（理化部分）,蛋白质测定的意义,蛋白质是食品中重要的营养指标。各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。,蛋白质测定的方法,蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法，它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一,应用普遍。此外，双缩脲分光光度比色法、染料结合分光光度比色法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速，多用于生产单位质量控制分析。近年来，国外采用红外检测仪对蛋白质进行快速定量分析。,一、凯氏定氮法,新鲜食品中的含氮化合物大多以蛋白质为主体，所以检验食品中蛋白质时，往往测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法可用于所有动物性、植物性食品的蛋白质含量测定，由于样品中含有少量核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白质含量。,该法分常量法、微量法、改良凯氏定氮法、自动定氮仪法、半微量法等多种方法。,1、常量凯氏定氮法,原理 将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C和H被氧化为CO,2,和H,2,O逸出，而样品中的有机氮转化为NH,3,，并与H,2,SO,4,结合成NH,4,SO,4,，此过程称为消化。加碱将消化液碱化，使NH,3,游离出来，再通过水蒸气蒸馏，使NH,3,蒸出，用硼酸吸收形成硼酸铵，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。,适用范围,此法可应用于各类食品中蛋白质含量的测定。,试剂,浓硫酸 硫酸铜 硫酸钾,氢氧化钠溶液：400g/L,硼酸吸收液：40g/L，称取20g硼酸溶解于500mL热水中，摇匀备用。, HCl标准溶液：0.1000mol/L。,甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：5份2g/L溴甲酚绿95%乙醇溶液与1份2g/L甲基红乙醇溶液混合均匀。,主要仪器,如图，凯氏烧瓶（500mL)定氮蒸馏装置。,准确称取固体样品0.202.00g（半固体样品2.005.00g，液体样品10.0025.00mL），小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中，加入研细的0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及20ml浓硫酸，小心摇匀后，按图安装消化装置，瓶颈45角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化）。,样品消化,先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力保持瓶内液体微沸，消化至溶液呈蓝绿色透明后，再继续加热微沸0.5h，取下冷却，小心加入20mL水，移入100mL容量瓶中，用少量水洗定氮瓶，并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。, 蒸馏、吸收,按图装好蒸馏装置，在水蒸气发生瓶内加入100mL蒸馏水约2/3处、玻璃珠数粒，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内预先装有10mL 20gL硼酸溶液及混合指示剂12滴）。准确吸取10mL样品处理液由小漏斗流入反应室，并以10mL水洗涤小烧杯使之流入反应室内，塞紧玻璃塞。从安全漏斗中慢慢加入10mL400g/L氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。用直火加热蒸馏30min，将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏1min，用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。,滴定： 将接受瓶内的硼酸液用0.1000mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。,结果计算,式中,-蛋白质的含量，g/100g；,c-硫酸或盐酸标准溶液的浓度，mol/L；,V,1,-滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL；,V,2,-滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL；,m-样品质量g，g；,0.0140-1.0mL1.000mol/L硫酸（1/2H2SO4）或盐酸标准溶液相当的氮的质量， g/mmol ；,F-氮换算为蛋白质的系数。,2、微量凯氏定氮法,原理,同常量凯氏定氮法。,主要仪器,凯氏烧瓶（100mL）,微量凯氏定氮装置（如图）,试剂 0.01000mol/L盐酸标准溶液，其他试剂同常量凯氏定氮法。,操作方法, 样品消化：样品消化步骤同常量法。,将消化完全的消化液冷却后，完全转入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。, 蒸馏：按图装好微量定氮装置，准确量取消化稀释液10mL于反应管内，经漏斗再加入10mL400g/L氢氧化钠溶液使呈强碱性，用少量蒸馏水洗漏斗数次，夹好漏斗，进行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有10mL40g/L（或20g/L）硼酸吸收液的液面下。蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏10min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。馏出液用标准溶液滴定至微红色为终点。同时做一空白试验。,凯氏定氮法是各种测定蛋白质含量方法的基础，但操作费时，且在操作中会产生大量有害气体而污染工作环境，影响操作人员健康。而分光光度测定法不仅能满足对工艺过程的快速控制分析，而且具有环境污染少，操作简便省时等特点。,基本原理：食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后在pH=4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。,二、蛋白质的分光光度测定法,试剂,氢氧化钠溶液：300g/L。, 乙酸：1mol/L。,对硝基苯酚指示剂溶液：,乙酸钠-乙酸缓冲溶液：pH=4.8。,显色剂：15mL37%甲醛与7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100mL,剧烈振摇，混匀（室温下放置稳定3日）。,主要仪器：分光光度计；电热恒温水浴锅（1000.5）；10mL具塞玻璃比色管。,氨氮标准贮备溶液：1.0g/L。精密称取105干燥2h的硫酸铵0.472g，加水溶解后移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，混匀。此溶液每升相当于1.0mgNH,3,-N（10下贮存稳定1年以上）,氨氮标准使用溶液：0.1g/L。用移液管精密吸取10mL氨氮标准贮备溶液（1.0mg/mL）于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于100,gNH,3,-N。,操作方法,精密称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.10.5g或半固体试样0.21.0g，或吸取液体试样15mL，移入干燥的100mL或250mL定氮瓶中，加0.1g硫酸铜、1g硫酸钾及5mL硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化、泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加入20mL水，放冷后移入50mL或100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理试样相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。,精密吸取25mL试样或试剂空白消化液于50mL或100mL容量瓶内，加12滴对硝基苯酚指示剂溶液（1g/L），摇匀后滴加氢氧化钠溶液（300g/L）中和至黄色，再滴加乙酸（1mol/L）至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。,精密吸取0.0mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL氨氮标准使用溶液（相当于0.0,g,、5.0g、10.0g、20.0g、40.0g、60g、80.0g、100.0gNH,3,-N），分别置于10mL比色管中。加4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH=4.8）及4mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀，置于100水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色皿内，以空白为参比，于400nm波长处测量吸光度，根据标准各点吸光度绘制标准曲线。,精密吸取0.52.0mL（约相当于氮小于100g）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10mL比色管中。加4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4显色剂，加水稀释至刻度，混匀，置于100水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色皿内，以空白为参比，于波长400nm处测量吸光度。,试样吸光度与标准曲线比较定量求出含量。,结果计算,式中,X-试样中蛋白质的含量，g/100gg/100mL；,m,1,-试样测定液中氮的量，,g,；,m,2,-试剂空白测定液中氮的量，,g,；,V,1,-试样消化液定容体积mL，；,V,2,-制备试样溶液的消化液体积， mL ；,V,3,-试样溶液总体积，mL；,V,4,-测定用试样溶液体积，mL；,m-试样质量（或体积），g（或mL）；,F-氮换算为蛋白质的系数。,cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1cmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dkuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0aksCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtALV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY*5fqAKV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuBMW(7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDNY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$2dnxIS$3dnyIS%3doyIT%3eoyJT%4eozJT&4epzJU&4fpzKU&5fpAKU*5fqAKV*5gqALV*6gqBLV(6grBLW(6hrBMW(7hrCMW)7hrCMW)7hsCMX)7isCNX)8isDNX-8itDNY-8jtDOY-9jtEOY+9juEOZ+9kuEPZ+akuFPZ0akvFP#0alvFQ#0blvGQ#1blwGQ!1bmwGQ!1bmwGR!1cmwHR!2cmxHR$2cnxHS$2dnxIS$3dnyIS%3doyIT%vlb0#QGvlb0#QFvla0#PFvka0ZPFuka+ZPEuk9+ZOEuj9+YOEtj9-YODtj81!RGwmb1!QGwlb1#QGvlb0#QFvla0#PFvka0ZPFuka+ZPEuk9+ZO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