兽医免疫学实验ELISA

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验四 酶联免疫吸附试验,Enzyme linked,immunosorbent,assay,（,ELISA,）,本次实验内容：,间接,ELISA,检测禽流感病毒（,AIV,）抗体,目的：,掌握间接,ELISA,原理，操作方法及结果判定方法,原理：,简单地说是利用抗原,-,抗体反应的高度特异性和酶反应的高度敏感性，进行对抗原或抗体的检测，是一种定性或定量的综合性技术。,包被鸡抗,NP,蛋白,IgG,IBV,加,IBV,或被检,加兔抗,IBVIgG,加羊抗兔,IgG,-HRP,加底物显色,加终止液,双抗体夹心,ELISA,检测传染性支气管炎病毒（,IBV,）,加底物显色,加被检血清,加羊抗鸡,IgG-HRP,加终止液,间接,ELISA,检测禽流感病毒抗体（,AIV,）,包被,AIV NP,蛋白,1,、酶标板,2.,禽流感病毒,NP,蛋白,3,、酶标记羊抗鸡,IgG,（,IgG-HRP,）,4,、阳性对照：,AIV,抗体,5,、阴性对照：健康鸡血清稀释液,6,、被检材料,7,、空白对照（,PBS,）,实验材料：,8,、包被液,9,、洗涤液,10,、封闭液：,0.5%,牛血清白蛋白（,BSA,）,11,、底物液,12,、终止液：（,2M H2SO4,）,13,、微量加样器（,50ul,）,14,、酶联免疫吸附测定仪,1,、,包被,AIV-NP,蛋白,：用微量加样器吸取稀释好,NP,蛋白加入,ELISA,板孔内,100,ul,/,孔，置,37,，,1h,后取出放,4,冰箱,或直接放入,4,冰箱,2,、,洗涤,:,次日从冰箱中取出滴定板,甩干内容物,向孔内加入,(,原则上以不溢出孔为益,用塑料吸管,),洗涤液,静置,3,分钟,甩干,并将板孔朝下放再滤纸上反复拍打干净,再加洗涤液,如此洗,3,次,每次,3,分钟,3,、,封闭：,加,0.5%BSA,，,100,ul,/,孔，,37,，,30,分钟，取出后甩干,4,、,加被检样品：,100,ul,/,孔，同时设阳性、阴性、空白（,PBS,）对照。均为,100,ul,/,孔,实验步骤：,5,、,洗涤,：同,3,6,、,加羊抗鸡,IgG,HRP,100 ul/,孔，,37,，,30,分,钟，取出后甩干,7,、,洗涤,：同,2,8,、,加底物液,：,100ul/,孔，置,37,，放置,15,分钟,10,、,终止反应,：每孔加终止液,50ul,，室温,5,分钟，终,止反应。,结果判定,：,阴性对照孔接近无色或,OD450,不超过,0.5,，阳性对照孔黄色或,OD450,超过,0.5,以上，为试验结果准确。,测被检孔,OD450,值，,OD450,0.5,判为阳性，,OD450,0.5,判为阴性。,