实验八总RNA提取和反转录

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验八,总RNA提取和反转录,1,实验目的：,1.掌握TRIZol试剂法提取细胞总RNA的原理和实验步骤；,2. 掌握反转录（RT）的基本原理和操作步骤。,总RNA提取,反转录,（RT）,聚合酶链式反应,（PCR）,检测目的基因的表达：,2,通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，样品分成水样层和有机层，,RNA存在于水样层中,。收集水样层后，通过异丙醇沉淀RNA，再经过洗涤、晾干、最后溶解等步骤即得到相对较纯的RNA。,反转录是在反转录酶的作用下，以,总RNA中mRNA为模板合成cDNA的过程,。,实验原理：,3,1TRIzol试剂：主要成分是苯酚，它能裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚并得到释放。此外，TRIzol中还有8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。,2,氯仿：与酚一起作用，使蛋白质变性；抽提水相中残留的酚，减少,RNA,损失。,3,异丙醇：沉淀核酸。,4,75,乙醇（DEPC水配制）：去除,RNA,沉淀中的盐分。,试剂的用途：,4,实验步骤：,1. 取1/3小鼠完整肝组织（约1g）,，直接加入,4mL,TRIzol,试剂。用匀浆器进行匀浆处理，室温放置,5,分钟,每组取,0.5mL,。,2.,加入,0.1mL,氯仿，剧烈振荡,15s,，室温放置,3min,。,3. 10000rpm,离心,5min,，,RNA,主要在上层水相中,。转移0.3mL水相至新的离心管中。,4.,加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，室温静置,5,min,。,5. 10000,rpm,离心,5,min,，弃上清。,6.,加入1mL,75,乙醇，轻轻洗涤,RNA,沉淀，,10000,rpm,离心,5,min,，弃上清。,7.,室温晾干,(,约,5,10,min,),。,8.,加入,100L,无,RNase,水溶解,RNA,，取,50L,用于,A260,和,A280,值测定。,9.,计算,RNA,的浓度和,A260/A280,值,总RNA提取,1,只小鼠,/,小班,，,3,个匀浆器,/,小班,5,（1）在0.2mL微量离心管中配制混合液,试剂,使用量,Oligo dT Primer,1 L,dNTP Mixture,1 L,Total RNA,15g,RNase free dH,2,O,补水到 10 L,（2）轻轻混匀，离心，将样品沉至管底后，65水浴保温5分钟，然后迅速冰浴冷却。,反转录（RT）,6,以下操作在,冰上,进行。,（3）往上述管中配制下列反转录反应液,试剂,使用量,上述变性后反应液,10 L,5 PrimeScript,Buffer,4 L,RNase Inhibitor,0.5 L (20 U),PrimeScript,RTase,1 L,RNase free dH,2,O,5.5L,（4）缓慢混匀，稍稍离心将样品沉至管底，按下列条件进行反转录反应：,42,保温3060分钟，70,保温15分钟，然后冰上冷却。,7,1.提取总RNA和反转录的整个过程都要严格控制,RNase,的污染。操作者要配带口罩、帽子和手套。所有用到的塑料和玻璃器皿均需要灭活,RNase,。,2.,反转录中，迅速冰浴的操作一定要快，不能是温度缓慢下降，否则RNA可能局部复性降低反转录的效率。,3.反转录的反应中对RNA浓度有比较高的要求，因此必需测定RNA浓度。只有保证RNA浓度在合适的范围内才能提高扩增的成功几率。,注意事项:,8,28S,18S,5S,5.8S,1 2,（A）,（B）,(A)细胞总RNA的制备; (B)RT-PCR分析TBX5在不同细胞中的表达,9,思考题：,RNA,酶的变性或失活剂有那些？其中在总,RNA,的抽提中主要可用哪几种？,在提取总,RNA,和反转录的过程中，如何避免,RNase,的污染？,10,