实验7——茚三酮法测定氨基酸总量

,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,实验七：茚三酮法测定氨基酸总量,1实验原理,凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。,1,氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：,2,2. 实验材料、仪器与试剂,材料：,酱油,仪器：,可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管。,试剂：,茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。,3,试剂配制：,讲义P32,（1）2%茚三酮溶液,（2）pH8.04的磷酸缓冲液,（3）氨基酸标准溶液：200g/mL异亮氨酸标准溶液。,4,3. 实验步骤,（1）样品的处理：,量取,0.5mL,酱油于50mL烧杯中，加入5g活性炭和40mL的蒸馏水，在电炉上加热至80左右，保持半小时后过滤至,100mL,容量瓶中，用蒸馏水将滤渣清洗数遍后转移容量瓶中，定容至刻度线备用。,5,（2）标准曲线的绘制及样品测定,各种试剂加到比色管后混匀，于水浴锅上沸水浴15min，取出冷却至室温后加水至10mL刻度线，静置15min后，在570nm处测定吸光值，以,氨基酸含量,为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。,单位：mL,6,4.结果计算,氨基酸（,g/mL）=,CK,V, 100,式中： C从标准曲线上查得的氨基酸含量，g,K稀释倍数,V测定时取样量，mL,7,5. 注意事项,（1）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，最大吸收波长在440nm处。,（2）有颜色的样品必需经脱色处理至无色后方可使用。,8,