Westernblotting蛋白免疫印迹实验课件

,生物实验培训,理论学习,课堂演示,一对一带教 个人实操,爱苏生物,口腔快检,基因检测,科研服务,健康管理,广 东 爱 苏 生 物 科 技 有 限 公 司,蛋白免疫印迹,（,Western Blot,）,生物实验培训系列之三,蛋白免疫印迹生物实验培训系列之三,WB,的基础,一,目 录,2,实验步骤与结果分析,三,实验室常见问题解答,四,试剂与设备,二,WB的基础一目 录2,目 录,3,1.WB,的概念,2.WB,的应用,3.WB,的原理,4.WB,的特点,WB,的基础,一,实验步骤与结果分析,三,实验室常见问题解答,四,试剂与设备,二,目 录31.WB的概念 WB的基础一,1.1,蛋白免疫印迹的概念,是,将电泳分离后,的总,蛋白质从凝胶转移到固相支持物,NC,膜或,PVDF,膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测,技术。,4,1.1 蛋白免疫印迹的概念是将电泳分离后的总蛋白质从凝胶转移,1.2,蛋白免疫印迹的应用,基因,在蛋白水平的表达,研究,例： 吴德平,王颖等.立氏立克次体蛋白抗原基因的表达和重组蛋白抗原,的免疫印迹分析,J,.中国人兽共患病学报,2009,25,(,10,),:,931-934,.,抗体,活性,检测,例：胡纪文，马东礼.免疫印迹法检测血清幽门螺杆菌抗体的应用价值,J,.,热带医学杂志,2013,13,(,8,),:,952-956,.,疾病,早期,诊断,例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期,诊断中的应用,J,.,中国人兽共患病杂志,1993,9,(,3,),:26,-29,.,5,1.2 蛋白免疫印迹的应用基因在蛋白水平的表达研究5,1.2,蛋白免疫印迹的应用,检测样品中特异性蛋白质是否存在,例：李桂波.利用免疫印迹法钓取PC3M细胞中与人前列腺癌高转移,相关特异性短肽结合蛋白的研究,D,.吉林,:,吉林大学,2007.,对特异性蛋白质进行半定量分析,例：,6,1.2 蛋白免疫印迹的应用检测样品中特异性蛋白质是否存在6,1.3 WB,的原理,WB,采用的是聚丙烯酰氨凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。,通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白质进行着色。,通过分析着色的位置和着色的深度获得特定的蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。,7,1.3 WB的原理WB采用的是聚丙烯酰氨凝胶电泳，被检测物是,1.4 WB,的特点,WB,是,在蛋白质电泳分离和抗原、抗体检测基础上发展起来的检测蛋白质的技术,SDS-PAGE,凝胶电泳：高分辨率,抗原,抗体反应：特异性,转膜：灵敏度,8,1.4 WB的特点WB是在蛋白质电泳分离和抗原、抗体检测基础,目 录,9,1.,试剂,2.,耗材,3.,设备,WB,的基础,一,实验步骤与结果分析,三,实验室常见问题解答,四,试剂与设备,二,目 录91.试剂 WB的基础一,2,.1,试剂,甲叉双丙烯酰胺,TrisHCL,SDS,10,2.1 试剂甲叉双丙烯酰胺TrisHCLSDS10,丙烯酰胺,过硫酸铵,TEMED,2,.1,试剂,11,丙烯酰胺过硫酸铵TEMED2.1 试剂11,RIPA,裂解液,SDS-PAGE loading Buffer,封闭液,ECL,显影液,2,.1,试剂,12,RIPA裂解液SDS-PAGE loading Buffer,2.1,试剂配置,聚丙烯酰胺储存液：,29g,丙稀酰胺、,1gN,N-,亚甲叉双丙稀酰胺 、加,H,2,O,至,100mL,。,注意事项,:,应以温热的去离子水配制,储于棕色瓶，,4,避光保存。,严格核实,pH,不得超过,7.0,，因光催化或碱催化可以发生脱氨基反应。,使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。,13,2.1 试剂配置聚丙烯酰胺储存液：13,2.1,试剂配置,分离胶缓冲液,(1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):,18.15gTris,和,48mL1mol/LHCL,混合加水稀释到,100mL,终体积。,浓缩胶缓冲液,(0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):,6.05gTris,溶于,40mLH,2,O,中，用约,48mL1mol/LHCL,调至,pH6.8,加水稀释到,100mL,终体积。,注意事项,:,过滤后,4,保存。,这两种缓冲液必须使用,Tris,碱制备，再用,HCL,调节,pH,值，而不用,Tris-HCL,。,转移缓冲液：,2.9g,甘氨酸、,5.8gTris,碱、,0.37gSDS,，并加入,200mL,甲醇,，加水至,总量,1L,。,14,2.1 试剂配置分离胶缓冲液(1.5mmol/LTris-H,2.1,试剂配置,SDS-PAGE,蛋白上样缓冲液,:,pH6.8,的,0.5mol/LTris,缓冲液,8mL,，甘油,6.4mL,，,10%SDS 12.8mL,，巯基乙醇,3.2mL,，,0.05%,溴酚蓝,1.6mL,，,H,2,O32mL,混匀备用。按,1:1,或,1:2,比例与蛋白质样品混合，沸水煮,3min,，混匀后再上样，一般为,20-25L,，总蛋白量,100g,。,Tris,缓冲盐溶液,(TBS):,20mmol/LTris/HCL(pH7.5),，,500mmol/LNaCl,。,Tris-,甘氨酸电泳缓冲液,:,30.3gTris,，,188g,甘氨酸，,10gSDS,，用蒸馏水溶解至,1000mL,，临用前稀释,10,倍。,15,2.1 试剂配置SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液:15,2,.2,耗材,移液枪,/,枪头,滤纸,蓝,盖玻璃瓶,量筒,容量瓶,离心管,烧杯,96,孔板,PVDF,膜,海绵垫,16,2.2 耗材移液枪/枪头离心管16,2,.3,设备,垂直电泳仪,化学发光成像系统,台式离心机,17,2.3 设备垂直电泳仪化学发光成像系统台式离心机17,2,.3,设备,高压灭菌锅,电子天平,电热恒温鼓风干燥箱,18,2.3 设备高压灭菌锅电子天平电热恒温鼓风干燥箱18,2,.3,设备,磁力搅拌器,4,、,-20,冰箱,19,2.3 设备磁力搅拌器4、-20冰箱19,目 录,20,1.,实验步骤,2.,结果分析,3.,注意事项,WB,的基础,一,实验步骤与结果分析,三,实验室常见问题解答,四,试剂与设备,二,目 录201.实验步骤 WB的基础一,3.1,实验步骤,蛋白样品制备,蛋白含量测定,21,3.1 实验步骤蛋白样品制备蛋白含量测定21,3.1.1,蛋白样品制备,在六孔板中,，,按照一个孔添加,150,L,的比例添加适量,RIPA,裂解液，用枪吹打均匀以充分接触细胞。,样品放置冰上,30min,（中间混匀,5-6,次）直至裂解完全。,充分裂解后，,10000-14000g,离心,3-5,分钟，取上清，即可进行后续的,PAGE,、,Western,和免疫沉淀等操作,22,裂解液用量说明：,通常,6,孔板每孔细胞加入,150L,裂解液，若细胞密度非常高可以适当加大裂解液用量至,200L,或,250L,。,3.1.1 蛋白样品制备在六孔板中，按照一个孔添加150L,a).,配制,BCA,工作液：根据标准品和样品数量，按,50,体积试剂,A,1,体积试剂,B,配制适量,BCA,工作液，充分混匀。,b).,将标准品、待测样品和工作液按下表加入到,96,孔板中，混匀。,23,管号,试剂,(,L,),空白管,标准管,测定管,2,13,23,3x3,43,53,63,蛋白质标准,液,(,1mg/mL),0,1,2,4,6,8,10,蒸馏,水,(,L,),10,9,8,6,4,2,0,待测样,(,L,),10,BCA,工作液,(,L,),200,200,200,200,200,200,200,200,3.1.2,蛋白含量测定,a).配制BCA工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂,3.1.2,蛋白含量测定,c).,混匀后，,在,37,烘箱,中温浴,30min,，,冷却至室温,。,d).,酶标仪,562nm,波长下测定吸光度。,e).,以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制,标准曲线。,f).,用测定孔平均光吸收值在标准曲线上查出相应的蛋白质含量,。,24,3.1.2 蛋白含量测定c).混匀后，在37烘箱中温浴30,3.1.3,聚丙烯酰氨凝胶电泳,所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间原有的电荷差异。,25,上样缓冲液,的,作,用,SDS,能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构,在强还原剂（,-,巯基乙醇）作用下，使半胱氨酸之间的二硫键断裂,蛋白质,(,SDS-,蛋白质复合物,),-,3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳所带的负电荷大大超过了蛋白质分,3.1.3,聚丙烯酰氨凝胶电泳,PAGE,胶的聚合原理：甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸铵的作用下聚合，形成胶。,分子筛效应,26,3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳PAGE胶的聚合原理：甲叉双丙,清洗玻璃板,配胶,上样,电泳,停止电泳,27,玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶,配分离胶，加入,TEMED,后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板,3/4,位置时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。,（加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）,当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入,TEMED,后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拨出。,（插梳子时要使梳子保持水平。）,用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。,（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）,3.1.3,聚丙烯酰氨凝胶电泳,清洗玻璃板配胶上样电泳停止电泳27玻璃板对齐后放入夹中卡紧，,清洗玻璃板,配胶,上样,电泳,停止电泳,28,测完蛋白含量后，计算含,50mg,蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋白加入,4,：,15*Loading Buffer,于离心管，,100,水中煮,5min,使蛋白变性。放置冰上,3min,，离心,15min,，,13000rpm,，,4,。,加足够的,1*,电泳缓冲液后开始准备上样。,（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）,用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。,（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。,）,3.1.3,聚丙烯酰氨凝胶电泳,清洗玻璃板配胶上样电泳停止电泳28测完蛋白含量后，计算含50,清洗玻璃板,配胶,上样,电泳,停止电泳,浓缩胶,80V,电压跑,20,分钟，可多跑几分钟；分离胶,180V,电压跑至底端。,纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在,Marker,下方切角做标记，将胶泡在清水中。,29,3.1.3,聚丙烯酰氨凝胶电泳,清洗玻璃板配胶上样电泳停止电泳浓缩胶80V电压跑20分钟，可,3.1.3,聚丙烯酰氨凝胶电泳,30,清洗玻璃板,配胶,上样,电泳,停止电泳,3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳30清洗玻璃板配胶上样电泳停止,3.1.4,转膜,剪,PVDF,膜，并提前切个角，甲醇中泡约,30,秒，在放入蒸馏水中,2min,。,将膜、海绵、滤纸一起泡入,1,*转膜液中，平衡至少,5min,。（转膜液可,回收）,打开电转印夹，在黑色面一次放入海绵垫、三层滤纸、凝胶、,PVDF,膜、三层滤纸、海绵垫,31,转膜条件：,45V,，,1.5h,3.1.4 转膜剪PVDF膜，并提前切个角，甲醇中泡约30秒,3,.1.5,封闭,用,1TBS,漂洗一次。加入封闭缓冲液,置于振荡培养箱中进行封闭,(26,80rpm/min, 2-4h),。,32,3.1.5 封闭用1TBS漂洗一次。加入封闭缓冲液,置于振,3,.1.6,一抗杂交,弃封闭液，加入用,Western,一抗稀释液稀释的一抗杂交溶液,置于,4,杂交过夜或在振荡培养箱中进行杂交,(26,80rpm/min,1h),33,3.1.6 一抗杂交弃封闭液，加入用Western一抗稀释液,3,.1.7,二,抗杂交,回收一抗杂交液，用,TBST,洗膜,3,次,(,置于振荡培养箱中,26,80rpm/min,10min/,每次,),弃,TBST,，加入用封闭缓冲液稀释的二抗杂交溶液,置于振荡培养箱中进行杂交,(26,80rpm/min,1h);,34,3.1.7 二抗杂交回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次(置于,WB,显色的分类,放射自显影,底物化学发光,ECL,底物荧光,ECF,底物,呈色,DAB,35,WB显色的分类放射自显影底物化学发光ECL底物荧光ECF底物,放射自显影,原理：利用放射性核素发射的射线，使感光材料中的卤化银等感光，显出影像后进行放射性标记物的定位和定量测量的技术。,特点：灵敏度高、分辨率好、保存时间长久，但由于实验所用方式性物质对人体有辐射作用。,应用：多用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。,放射自显影原理：利用放射性核素发射的射线，使感光材料中的卤化,底物化学发光ECL,原理,:,化学发光是在一些特殊的化学反应中吸收了反应释放的化学能,而处于电子激发态的反应中间体或反应产物由激发态回到基态时所产生的一种光辐射,化学发光分析是根据化学反应产物的光辐射(化学发光)确定物质含量的一种痕量分析方法。,特点,:,灵敏度高和线性范围宽，不需要任何光源。,底物化学发光ECL原理:化学发光是在一些特殊的化学反应中吸收,底物荧光ECF,原理：是利用的荧光染料（如Cy2 ,Cy3, Cy5）标记二抗，标记荧光染料的二抗分别对应相应的目的蛋白，以此实现通过检测荧光染料的信号强度，实现种蛋白信号的检测，以进行精确的定量分析。,荧光检测Western Blot本来不是检测的主流方法，不过荧光法检测允许在同一张转印膜上用不同颜色的荧光底物同时检测不同的目标。,底物荧光ECF原理：是利用的荧光染料（如Cy2 ,Cy3,底物DAB呈色,原理：二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物，反应产物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被广泛地用于蛋白印迹（Western Blot,WB)、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)、斑点印迹(Dot blot)和生物芯片(Biochip)等的染色和显色反应。用之进行对底物显色即被称为底物DAB呈色法。,此技术成本低，操作也较简单是常用的western blot成像分析技术之一，不过由于其灵敏度稍低，在目的蛋白表达量较少的情况下可能没有理想的结果应慎用。,底物DAB呈色原理：二氨基联苯胺（Diaminobenzid,3,.1.8,显影检测,弃二抗溶液，用,TBST,洗膜,3,次（置于振荡培养箱中，,26,，,80rpm/min, 10min/,每次）；,ECL,工作液的配制：等体积混合,Detection reagent 1,和,Detection reagent 2,，,现配现用,。,根据膜的大小，按每,10,平方厘米膜加,1mL,ECL,工作液，滴加,ECL,工作液工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置,1,分钟。,利用化学发光系统,采集图像和进行图像分析。,40,3.1.8 显影检测弃二抗溶液，用TBST洗膜3次（置于振荡,3.2,结果分析,41,3.2 结果分析41,3,.3,注意事项,42,电泳结束后，应及时用清洗干净玻璃板，清洗时应使用海绵擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板,；并及时,冲洗电泳槽，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀,；,注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的叠放位置，以保证正确的转印方向；,注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的相对大小，以免造成短路；,转印结束后，应及时取出转印膜，并立即用,TBST,漂洗,1-2,遍，并立即加入封闭液，这样可以避免膜上的杂质残留或膜变干导致背景高的问题；,3.3 注意事项42电泳结束后，应及时用清洗干净玻璃板，清洗,WB,的基础,一,目 录,43,实验步骤与结果分析,三,实验室常见问题解答,四,试剂与设备,二,WB的基础一目 录43,常见问题解答,没信号,膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品也无条带：实验失败？抗体失效,？重新,进行实验，重新稀释抗体,；,膜,一片空白，没有任何条带，阳性对照样品有条带：实验样品降解？实验样品无该蛋白的表达？转膜效率过低,？重新,进行实验，复核查找上述原因，以寻找,对策。,背景过高,目的,条带以外的区域有信号，如果是片状，甚至整块膜，一般是封闭不好，膜变干，一抗非特异杂交或二抗的非特异杂交导致；如果是条纹状，一般是由于膜上有压痕导致，如果是点状，一般是膜上有杂质，或泡膜时膜没有充分浸泡；转膜效率,过低,。,44,常见问题解答没信号膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品也无,常见问题解答,一,抗效价低：提高一抗稀释比例，提高杂交时间，减少洗膜次数，提高曝光时间，提高上样量,；,转,膜效率低：检测转膜试剂和耗材，优化转膜条件；,在,目的带以外的信号条带为杂带，一般由于一抗的特异性不好所导致，如果目的带比杂带信号强，可通过减低一抗的稀释比例，并缩短杂交时间解决；如果目的带比杂带信号弱，在不减低一抗的稀释比例的前提下，缩短杂交时间；并提高,TBST,缓冲液的,NaCl,的浓度提高到,500nM,；,杂,带如果与目的带的位置相距较远，可以不优化实验，直接裁剪即可，杂带如果与目的带的位置相距较进，应调整胶浓度，并延长电泳,时间,。,有杂带,目的带弱,45,常见问题解答一抗效价低：提高一抗稀释比例，提高杂交时间，减少,两块玻璃板,之间灌胶,胶为什么总是不平,?,46,玻璃未洗净,过硫酸铵和,TEMED,加量过多可导致胶凝固过快而使胶不平,加入试剂后未摇匀，导致局部聚合剂浓度过高，聚合较快而使胶不平,加入不均匀，应注意手法,灌胶后应进行压胶,(,可用水或正丁醇,),温度会影响胶聚合，若受热不均匀，也会影响胶聚合不均匀。,两块玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?46玻璃未洗净过硫酸,为什么会有“微笑”和“倒微笑”这样的效果呢？,47,微笑,是因为灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。,“,倒微笑“也称“皱眉”现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象,；中间,部分和两端受热不一样而致成了“倒微笑”可能是因为两端的胶凝的不好，加,APS,和,TEMED,后应该混合均匀。,为什么会有“微笑”和“倒微笑”这样的效果呢？47,Western-blot,制胶时好多泡泡怎么办,？,48,玻璃板需用洗洁精洗后再用双蒸水冲洗，晾干,配胶时应沿管壁缓缓加入各成分，用手轻轻摇匀；若用枪头吹打需缓慢且不要打到头,倒胶时，用枪沿一侧缓缓加入，不要打到底，以免带入气泡,封胶时，可用,200L,枪加水，减小压力，以免把胶冲起,室温制胶时，由于温差及凝胶聚合反应放热可产生气泡,分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子,Western-blot制胶时好多泡泡怎么办？48玻璃板需,问答时间,49,问答时间49,WB,标准实验,-,试剂耗材与设备,试剂：,SDS,RIPA,裂解液,丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,TEMED,ECL,显影液,封闭液,TrisHCL,过硫酸铵,SDS-PAGE loading Buffer,50,耗材：,离心管,烧杯,96,孔板,PVDF,膜,海绵垫,移液枪,/,枪头,滤纸,蓝盖玻璃瓶,量筒,容量瓶,设备：,台式离心机,化学发光成像系统,垂直电泳仪,电热恒温鼓风干燥箱,电子天平,高压灭菌锅,磁力搅拌器,4,、,-20,冰箱,WB标准实验-试剂耗材与设备试剂：50耗材：设备：,WB,标准实验,-,试剂配置,聚丙烯酰胺储存液：,29g,丙稀酰胺、,1gN,N-,亚甲叉双丙稀酰胺 、加,H,2,O,至,100ml,。,分离胶缓冲液,(1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):,18.15gTris,和,48mL1mol/LHCL,混合加水稀释到,100mL,终体积。,浓缩胶缓冲液,(0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):,6.05gTris,溶于,40mLH,2,O,中，用约,48mL1mol/LHCL,调至,pH6.8,加水稀释到,100mL,终体积。,转移缓冲液：,2.9g,甘氨酸、,5.8gTris,碱、,0.37gSDS,，并加入,200mL,甲醇，加水至总量,1L,。,51,WB标准实验-试剂配置聚丙烯酰胺储存液：51,SDS-PAGE,蛋白上样缓冲液,:,pH6.8,的,0.5mol/LTris,缓冲液,8mL,，甘油,6.4mL,，,10%SDS 12.8mL,，巯基乙醇,3.2mL,，,0.05%,溴酚蓝,1.6mL,，,H,2,O32mL,混匀备用。按,1:1,或,1:2,比例与蛋白质样品混合，沸水煮,3min,，混匀后再上样，一般为,20-25L,，总蛋白量,100g,。,Tris,缓冲盐溶液,(TBS):,20mmol/LTris/HCL(pH7.5),，,500mmol/LNaCl,。,10xTris-,甘氨酸电泳缓冲液,:,30.3gTris,，,188g,甘氨酸，,10gSDS,，用蒸馏水溶解至,1000mL,。,临,用前稀释,10,倍。,52,WB,标准实验,-,试剂配置,SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液:52WB标准实验-试剂配置,WB,标准实验流程,在六,孔板中，按照一个孔添加,150,L,的比例添加适量,RIPA,裂解液，用枪吹打均匀,以充分接触细胞。,样品放置冰上,30min,（中间混匀,5-6,次）直至裂解完全。,充分裂解后，,10000-14000g,离心,3-5,分钟，取上清，即可进行后续的,PAGE,、,Western,和免疫沉淀等操作,53,样品制备,WB标准实验流程在六孔板中，按照一个孔添加150L的比例添,WB,标准实验流程,54,含量测定,管号,试剂,(,L,),空白管,标准管,测定管,2,13,23,3x3,43,53,63,蛋白质标准,液,(,1mg/ml,),0,1,2,4,6,8,10,蒸馏,水,(,L,),10,9,8,6,4,2,0,待测样,(,L,),10,BCA,工作液,(,L,),200,200,200,200,200,200,200,200,配制,BCA,工作液：根据标准品和样品数量，按,50,体积试剂,A,1,体积试剂,B,配制适量,BCA,工作液，充分混匀。,将标准品、待测样品和工作液按表,1,加入到,96,孔板中，混匀。,在,37,烘箱,中,温浴,30min,，冷却至室温。,酶标仪,562nm,波长下测定吸光度。,以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。,用测定孔平均光吸收值在标准曲线上查出相应的蛋白质含量,WB标准实验流程54含量测定管号空白管标准管测定管132,清洗玻璃板,配胶,上样,电泳,玻璃板,对齐放,入夹中卡紧,，垂直,卡在架子上准备灌胶,配分离胶，加入,TEMED,立即,摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板,3/4,位置，胶,上加一层水，液封,后胶,凝的更快。,（加水液封时要很慢，否则胶会被,冲变形）,当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入,TEMED,后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩,胶后,将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将,其拔出,。,（插梳子时要使梳子保持,水平）,用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。,（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）,测完蛋白含量后，计算含,50mg,蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋白加入,4,：,15*Loading Buffer,于离心管，,100,水中煮,5min,使蛋白变性。放置冰上,3min,，离心,15min,，,13000rpm,，,4,。,加足够的,1*,电泳缓冲液后开始准备上样。,（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）,用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。,（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。）,停止电泳,浓缩胶,80V,电压跑,20,分钟，可多跑几分钟；分离胶,180V,电压跑至底端。,纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在,Marker,下方切角做标记，将胶泡在清水中。,55,WB,标准实验流程,聚丙烯酰氨凝胶电泳,清洗玻璃板配胶上样电泳玻璃板对齐放入夹中卡紧，垂直卡在架子上,Component,Volume,ddH,2,O,3.3ml,30%,丙烯酰胺溶液,4.0 ml,Tris-HCl(1.5M,pH8.8),2.5ml,10%SDS,0.1ml,10%AP,0.1ml,TEMED,0.004ml,Total,10ml,12%,分离胶配方,Component,Volume,ddH,2,O,2.7ml,30%,丙烯酰胺溶液,0.67 ml,Tris-HCl(1.0M,pH6.8),0.5ml,10%SDS,0.04 ml,10%AP,0.04 ml,TEMED,0.004 ml,Total,4.0ml,5%,浓缩胶配方,WB,标准实验,流程,56,ComponentVolumeddH2O3.3ml30%丙烯,剪,PVDF,膜，并提前切个角，甲醇中泡约,30,秒，在放入蒸馏水中,2min,。,将膜、海绵、滤纸一起泡入,1,*转膜液中，平衡至少,5min,。（转膜液可回收。）,打开电转印夹，在黑色面一次放入海绵垫、三层滤纸、凝胶、,PVDF,膜、三层滤纸、海绵垫,57,WB,标准实验流程,转膜,一抗杂交,封闭,用,1TBS,漂洗一次。加入封闭缓冲液,置于振荡培养箱中进行封闭,(26,80rpm/min, 2-4h),。,弃封闭液，加入用,Western,一抗稀释液稀释的一抗杂交溶液,置于,4,杂交过夜或在振荡培养箱中进行杂交,(26,80rpm/min,1h),转膜条件：,45V,，,1.5h,剪PVDF膜，并提前切个角，甲醇中泡约30秒，在放入蒸馏水中,58,WB,标准实验流程,二抗杂交,回收一抗杂交液，用,TBST,洗膜,3,次,(,置于,振荡培养箱中，,26,，,80rpm/min,，,10min,/,每次,),弃,TBST,，加入用封闭缓冲液稀释的二抗杂交溶液,置于振荡培养箱中进行杂交,(26,，,80rpm/min,，,1h),显影检测,弃二抗溶液，用,TBST,洗膜,3,次（置于振荡培养箱中，,26,，,80rpm/min, 10min/,每次）；,ECL,工作液的配制：等体积混合,Detection reagent 1,和,Detection reagent,2,现,配现用。,根据膜的大小，按每,10,平方厘米膜加,1ml ECL,工作液，滴加,ECL,工作液工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置,1,分钟。,利用化学发光系统,采集图像和进行图像分析。,58WB标准实验流程二抗杂交回收一抗杂交液，用TBST洗膜3,谢谢聆听！,59,谢谢聆听！59,