EB病毒检测技术进展及临床应用课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,2021/2/4,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/2/4,1,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/2/4,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/2/4,*,EB病毒检测技术进展及临床应用,EB病毒检测技术进展及临床应用EB病毒检测技术进展及临床应用概述Epstein-Barr病毒（EBV）,疱疹病毒科，亚科，嗜淋巴细胞病毒属，,1964年由Epstein、Barr等人首次在非洲儿童的恶性淋巴瘤组织培养中发现。,EBV是是传染性单核细胞增多症的病原体，也是一种重要的肿瘤相关病毒，与鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增殖症等多种肿瘤的发生密切相关，被列为致癌性病毒之一。2021/2/42,EB病毒检测技术进展及临床应用EB病毒检测技术进展及临床应用,概述,Epstein-Barr,病毒（,EBV,）,疱疹病毒科，,亚科，嗜淋巴细胞病毒属，,1964,年由,Epstein,、,Barr,等人首次在非洲儿童的恶性淋巴瘤组织培养中发现。,EBV,是是传染性单核细胞增多症的病原体，也是一种重要的肿瘤相关病毒，与鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增殖症等多种肿瘤的发生密切相关，被列为致癌性病毒之一。,2021/2/4,2,概述Epstein-Barr病毒（EBV）2021/2/42,概述,传播途径：,EBV,感染主要通过唾液接触传播，也可通过血液传播；,人感染,EBV,后建立终身潜伏感染，人群感染率超过,90%,。,1-6,岁儿童、,14-20,岁青少年及年轻成年人高度易感，发展中国家,EBV,感染多发生在儿童早期。,2021/2/4,3,概述2021/2/43,病原学,疱疹病毒科，,疱疹病毒亚科，淋巴隐病毒属，人疱疹病毒,4,型,球形双链,DNA,病毒，基因组平均大小约为,172 kb,2021/2/4,4,病原学疱疹病毒科，疱疹病毒亚科，淋巴隐病毒属，人疱疹病毒4,2021/2/4,5,2021/2/45,2021/2/4,6,2021/2/46,EBV,致病机制,原发,EBV,感染时，,EBV,先是在,口咽部上皮细胞内增殖,，然后感染附近的,B,淋巴细胞,，受到感染的,B,淋巴细胞进入血液循环可以造成全身性感染。,EBV,原发感染后，大多数无临床症状，尤其是,6,岁以下幼儿大多表现为隐性或轻型发病，但在儿童期、青春期和青年期 ，约,50%,的原发性感染均表现为,IM,。,2021/2/4,7,EBV致病机制原发EBV感染时，EBV先是在口咽部上皮细胞内,EBV,在人体,B,细胞建立潜伏感染，,EBV,只表达潜伏抗原（包括,EBNA-1,、,EBNA-2,、,EBNA-3A,、,EBNA-3B,、,EBNA-3C,、,EBNA-LP,、,LMP-1,、,LMP-2,及,EBER,），受感染者将成为终身带毒者。,在机体免疫功能下降和某些因素触发下，潜伏的,EBV,可以被再激活，引起病毒复制及临床疾病。,EBV,致病机制,2021/2/4,8,EBV在人体B细胞建立潜伏感染，EBV只表达潜伏抗原（包括E,EBV,常见相关疾病,传染性单核细胞增多症,（,Infectious mononucleosis,IM),慢性活动性,EB,病毒感染,（,Chronic active EBVinfection,，,CAEBV,）,EB,病毒相关性嗜血细胞综合征,（,EBV-associated hemophagocytic syndrome, EBVAHS),Burkitts,淋巴瘤 何奇金淋巴瘤,2021/2/4,9,EBV常见相关疾病传染性单核细胞增多症2021/2/49,EBV,感染的抗原表达,EBV,溶解性感染期，,可表达：,早期抗原（,EA,）：,EA/R,和,EA/D,（具,DNA,多聚酶活性）；,EA,出现表明,EBV,活跃增殖，,EA,抗体出现在感染早期,；,衣壳蛋白（,VCA,）,晚期表达的结构蛋白,VCA-IgM,出现在急性感染早期，,VCA-IgG,出现在急性感染期并持续存在,膜抗原（,MA,）：,细胞表面包膜糖蛋白（,MA gp350/220,gp85),，,是,EBV,的中和性抗原,抗,MA-IgM,可用于早期诊断,2021/2/4,10,EBV感染的抗原表达EBV溶解性感染期，可表达：2021/2,EBV,潜伏感染期，,选择性表达早期抗原以及,：,核抗原（,EBNA-1,-2,-LP,-3A,-3B,-3C,）：,为,DNA,结合蛋白，在感染的,B,细胞核内；,EBNA-1,与感染有关，,EBNA-2,与细胞转化和永生化有关；,EBNA,抗体出现在感染晚期。,潜伏膜蛋白,（,LMP-1,-2A,-2B,）：,在感染,B,细胞表面，与细胞恶化有关，,未翻译的转录物,BARF0,和,EBER,EBNA-3,、,EBNA-2,、,LMP-1,是,EBV-CTL CD8+,的主要目标,EBV,感染的抗原表达,2021/2/4,11,EBV潜伏感染期，选择性表达早期抗原以及：EBV感染的抗原表,原发性,EBV,感染过程中首先产生针对衣壳抗原（,capsid antigen, VCA,）,IgG,和,IgM,，在急性感染的晚期，抗早期抗原（,early antigen, EA,）抗体出现在恢复期晚期，抗核抗原（,nuclear antigen, NA,）抗体产生，,抗,VCA-IgG,和抗,NA-IgG,可持续终身,2021/2/4,12,原发性EBV感染过程中首先产生针对衣壳抗原（capsid a,EBV,感染的血清学诊断,2021/2/4,13,EBV感染的血清学诊断2021/2/413,传统检测策略的问题,5%,新近,EBV,感染不出现,CA-IgM,抗体,在罕见的病例中抗,CA-IgM,会持续存在,约,20-30%,的新近感染不出现,EA-IgG,抗体,抗,EBNA-IgG,抗体可能呈现阴性，由于：,-,慢性活动性,EBV,感染,-,细胞免疫被抑制,2021/2/4,14,传统检测策略的问题5%新近EBV感染不出现CA-IgM抗体在,EBV,感染的血清学诊断,抗,VCA-IgM,和,IgG,可以同时出现，通常,IgG,出现较,IgM,晚，但偶尔较,IgM,出现早,1,2,周，抗,VCA-IgM,几周后检测不到,抗,EA-IgG,在发病后,3-4,周后升高，,3,4,月后检测不到,抗,EBNA-1-IgG,在发病后,3,4,周被检测到，持续终身，部分慢性,EBV,感染者检测不到,抗,VCA-IgG,和抗,EBNA-1-IgG,终生持续阳性,2021/2/4,15,EBV感染的血清学诊断抗VCA-IgM和IgG可以同时出现，,EBV,常见相关疾病,2021/2/4,16,EBV常见相关疾病2021/2/416,传染性单核细胞增多症,(IM),infectious mononucleosis,特指由,EBV,感染引起的发热、咽炎和淋巴结肿大的综合征,1889,年被首次描述为“,glandular fever”,1920,年正式定义为,IM,1932,年发现嗜异性凝集实验,1968,年实验室工作人员感染,EBV,，出现,IM,临床症状和嗜异性凝集抗体，明确,EBV,是,IM,的病原,2021/2/4,17,传染性单核细胞增多症(IM)infectious mono,IM,临床表现,25-30%,的青少年和,30,岁的成年人原发感染,EBV,后表现,IM,儿童时期,EBV,感染多为亚临床型或不典型症状,临床症状：发热、淋巴结肿大、扁桃体炎（灰白色渗出）、咽炎、肝脾肿大、眼睑水肿和皮疹、上腭粘膜出血点,皮疹经常发生于使用氨苄西林、阿莫西林和一些,内酰胺类抗生素,1,周后，发生率,90%,并发症：粒细胞减少、血小板减少、脾破裂、扁桃体肥大致气道阻塞、暴发性肝炎、溶血性贫血、再生障碍性贫血、中枢神经系统疾病,2021/2/4,18,IM临床表现25-30%的青少年和10,2.5,copies/g,原位杂交,：检测出,EBER-1,阳性细胞,Southern,杂交,：受累组织或外周血中检测出,EBV DNA,免疫荧光,：检测到抗原（,EBNA,、,LMP,）,感染的,B,、,T,、,NK,细胞、单核,/,巨噬,/,组织细胞检测到,EBNA,、,EBER,、,EBV-DNA,2021/2/4,25,CAEBV的诊断标准(2)血清抗体滴度异常升高2021/2/,EBV,相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症,EBV-associated hemophagocytic lymphohistocytosis EBV-HLH,是一种与EBV感染有关的淋巴增殖伴随吞噬血细胞现象的一类疾病,EBV感染所致CD8+T细胞的异常增殖及其激活巨噬细胞，导致炎症细胞因子大量释放产生高细胞因子血症（细胞因子风暴）是EBV-HLH的主要病例生理特征,临床表现发热、肝脾肿大、黄疸、全血细胞减少、DIC，骨髓和其他组织见嗜血细胞、LDH、铁蛋白、,微球蛋白,EBV-HLH,常见于儿童和青少年,2021/2/4,26,EBV相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症EBV-assoc,抗,EBV,病毒药物,无环核苷拟似剂,acyclovir（阿昔洛韦），ED50,0.3,ganciclovir（更昔洛韦）， ED50,0.05,valaciclovir（缬昔洛韦 ）,无环核苷酸,cidofovir，adefovir,焦磷酸盐 拟似剂,foscarnet（磷甲酸钠）,作用机制,作用病毒DNA多聚酶，抑制病毒复制,2021/2/4,27,抗EBV病毒药物无环核苷拟似剂2021/2/427,EBV,感染的实验室诊断,外周血分类,淋巴细胞,50% WBC,不典型淋巴细胞,10% WBC,（系激活的,CD8+ CTL,）,血清学检查,嗜异性凝集实验（,heterophile test/spot test,）,VCA-IgM,、,IgG,，,EA-IgG,，,EBNA-IgG,病毒学标志,在,PBMC,、血清、全血或感染组织检测,EBV-DNA,、,EBER,、,EBNA,、,LMP,2021/2/4,28,EBV感染的实验室诊断外周血分类2021/2/428,EBV,感染疾病的血清学诊断,诊断,VCA IgM,VCA IgG,EA IgG,EBNA IgG,既往无感染,IM (,急性期,),IM,（恢复期）,/,/,/,既往感染,低,/,慢性活动性感染,/,高,高,/,2021/2/4,29,EBV感染疾病的血清学诊断VCA IgMVCA IgGEA,临床需要回答的问题,是否感染,EBV?,EBV,感染的时相？,是否,EBV,活动性感染？,疾病是否与,EBV,感染相关？,2021/2/4,30,临床需要回答的问题是否感染EBV?2021/2/430,EBV,实验室检测方法,病毒培养,免疫学技术（免疫荧光法，免疫组化技术）,血清学方法（,ELISA,法，化学发光法）,基因诊断技术,2021/2/4,31,EBV实验室检测方法 病毒培养2021/2/431,嗜异凝集抗体试验：也称“,Monospot”,试验。在,EBV,还未确定为,IM,的病因之前，,1932,年引入临床实践诊断,IM,。,当时发现,IM,患者的血清或血浆可以凝集马或绵羊的红细胞。该抗体在病程第,1,2,周出现，持续约,6,个月。,在青少年原发性,EBV,感染中其阳性率可达,80,-90,，约,10,的青少年缺乏对嗜异性抗体的阳性反应。,EBV,实验室检测方法,2021/2/4,32,嗜异凝集抗体试验：也称“Monospot”试验。在EB,EBV,感染的血清学诊断评价,嗜异性抗体（,heterophile antibody,，,HA,）凝集实验（“,spot” test,）,嗜异性抗体（,IgM,）在发病后,7,天内出现，,2-5,周达高峰，可以持续,6-12,个月，偶有,12,个月后以低水平存在,HA,阳性提示原发急性感染，,EBV,再激活感染几乎阴性,阳性率：青少年和成年人,71%-90%,，,2-5,岁儿童,50%,假阴性：发病第,1,周内假阴性率,25%,，,10%,成人始终阴性,假阳性：,2-3%,自身免疫性疾病、,HIV,感染、心内膜炎、,HAV,肝炎,2021/2/4,33,EBV感染的血清学诊断评价嗜异性抗体（heterophile,缺点,需要硬件设备,成本昂贵,优点,敏感性高,特异性强,操作简便,化学发光技术,2021/2/4,34,缺点优点化学发光技术2021/2/434,胶体金是氯金酸,HAuCl,4,的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,简便，快捷，敏感度和特异度较差,2021/2/4,35,胶体金是氯金酸HAuCl4的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，,EBERS,原位杂交试验,EBV,潜伏感染的细胞含有大量的,EBERl,EBER2,（,EBERS,）转录子，其主要功能是抑制干扰素介导的抗病毒效应和凋亡。该转录子不翻译成蛋白质，每个,EBV,潜伏感染的细胞含有大约,10,6,拷贝,EBERS,，被认为,EBV,潜伏感染的最好标志物，因此原位杂交检测肿瘤细胞中,EBERS,是诊断肿瘤是否,EBV,相关的金标准,EBV,实验室检测方法,2021/2/4,36,EBERS原位杂交试验EBV实验室检测方法2021/2/43,EBV,病毒核酸检测,实时荧光定量,PCR,是目前最主要的监测,EBV,载量的方法,鉴别,EBV,健康携带者的低水平复制与,EBV,相关疾病患者高水平活动性感染。,2021/2/4,37,EBV病毒核酸检测实时荧光定量PCR是目前最主要的监测EBV,EBV,载量检测有多种方法，,Real-time PCR,是目前最主要的监测,EBV,载量的方法，有较强的敏感性和特异性。不同的,EBV,疾病进行,Real-time PCR,检测时，需要的标本不同。,EBV,病毒核酸检测,2021/2/4,38,EBV载量检测有多种方法，Real-time,疾病,感染细胞,感染方式,检测病毒定量的最合适标本,血浆,/,血清,单核细胞,全血,传染性单核细胞增多症（,IM,）,B,细胞,浆细胞,溶解性感染,潜伏,理想,不推荐,不推荐,移植后淋巴增殖性疾病（,PTLD,）,B,细胞,潜伏,理想,最合适,慢性活动性,EBV,感染（,CAEBV,）,T,细胞,NK,细胞,潜伏,评价预后,适合诊断,EBV,相关性疾病的病毒,DNA,定量检测,血清游离的,EBV-DNA,提示原发感染或者再激活,健康携带者血清,EBV-DNA,通常检测不到,2021/2/4,39,疾病感染细胞感染方式检测病毒定量的最合适标本血浆/血清单核细,2021/2/4,40,2021/2/440,2021/2/4,41,2021/2/441,2021/2/4,42,2021/2/442,传单的,EBV,感染实验室诊断,血清学检测：,同时满足下列,2,条者可以诊断为,EBV-IM:,1.,下列临床症状中的,3,项：发热、咽峡炎、颈淋巴结肿大、肝肿大、脾肿大；,2.,原发性,EBV,感染的血清学证据，满足下列,2,条中任一项：,（,1,）抗,EBV-CA-IgM,和抗,EBV-CA-IgG,阳性，且抗,EBV-NA-IgG,阴性,（,2,）抗,EBV-CA-IgM,阴性，但抗,EBV-CA-IgG,阳性，且为低亲和力抗体,2021/2/4,43,传单的EBV感染实验室诊断血清学检测：2021/2/443,传单的,EBV,感染实验室诊断,DNA,检测？,:,IM,患者外周血中,EB,病毒载体在,2,周内达到峰值，随后很快下降。,至病程,14,天，多数,EBV-IM,患者血清中已检测不到病毒核酸，病程,22,天后，所有,EBV-IM,患者血清中均检测不到病毒核酸。,IM,患者不推荐进行,EB,病毒载量检测,2021/2/4,44,传单的EBV感染实验室诊断DNA检测？:2021/2/444,慢性活动性,EBV,感染的实验室诊断,EBV,抗体检测,抗体反应类型,EBV,抗体,比例（,%,）,CA-IgG,CA-IgM,EA-IgG,NA-IgG,1,+,-,+,+,54.9,2,+,-,+,-,25.5,3,+,+,+,+,5.9,4,+,+,+,-,5.9,5,+,-,-,+,3.9,6,+,-,-,-,3.9,2021/2/4,45,慢性活动性EBV感染的实验室诊断EBV抗体检测抗体反应类型E,慢性活动性,EBV,感染的实验室诊断,DNA,检测,绝大多数,CAEBV,患者,PBMC,中,EBV-DNA,水平高于,10,2.5,拷贝,/ug DNA,部分,CAEBV,患者血浆,/,血清中,EBV-DNA,阴性,CAEBV,患者血浆,/,血清中,EBV-DNA,水平与病情严重程度和预后有关,2021/2/4,46,慢性活动性EBV感染的实验室诊断DNA检测2021/2/44,EB,病毒相关噬血淋巴组织细胞增生症,EBV-HLH,可以发生在原发性,EBV,感染时期，既往,EBV,感染再激活时期,EBV-HLH,患者血清中,EBV,抗体反应呈多种反应类型，,单纯血清,EBV,抗体检测对,EBV-HLH,的诊断意义不大。,感染类型,EBV,抗体,比例（,%,）,CA-IgG,Ca-IgM,EA-IgG,NA-IgG,再次激活,+,-,+,+,30.8,+,-,-,+,21.8,+,+,+,+,17.9,原发感染,+,+,-,-,16.7,+,+,+,-,12.8,总阳性率（,%,）,100,47.4,48.7,70.5,2021/2/4,47,EB病毒相关噬血淋巴组织细胞增生症EBV-HLH可以发生在原,EB,病毒相关噬血淋巴组织细胞增生症,DNA,检测,:,EBV-HLH,患者外周血单个核细胞和血浆,/,血清均含有很高的,EBV-DNA,载量，结合血清学抗体检测，有助于,EBV-HLH,的诊断。,监测,EBV-HLH,患者血清中,EBV-DNA,载量有助于评估治疗效果。,2021/2/4,48,EB病毒相关噬血淋巴组织细胞增生症DNA检测:2021/2/,小 结,EB,病毒感染率高,传播范围广,且多为隐性感染,临床症状多种多样,临床诊断和治疗较为复杂，,EB,病毒实验室检测在临床诊断中具有重要意义，根据临床需要进行合理分析，选择方便、实用、高效的检测方法，为临床治疗提供依据。,2021/2/4,49,小 结 EB病毒感染率高,传播范围广,且多为隐性感染,Thank you,谢 谢,2021/2/4,50,Thank you 谢 谢2021/2/450,人有了知识，就会具备各种分析能力，,明辨是非的能力。,所以我们要勤恳读书，广泛阅读，,古人说“书中自有黄金屋。,”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，,培养逻辑思维能力；,通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，,培养文学情趣；,通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。,有许多书籍还能培养我们的道德情操，,给我们巨大的精神力量，,鼓舞我们前进,。,人有了知识，就会具备各种分析能力，,