分子病理检测平台原位杂交课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子病理检测平台,-,原位杂交,病理科,1,分子病理检测平台 -,原位杂交原理及实验过程,原位杂交的应用,1.EBER,2.HPV,3. Kappa,和,Lamda,荧光原位杂交的原理及探针类型,荧光原位杂交的应用,1.,实体性肿瘤,2.,淋巴造血系统肿瘤,3.,产前诊断,2,2,原位杂交原理,核酸分子杂交（,nucleic acid hybirdzation,）：,指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配对原则形成双链的过程。杂交双方分别为待检的核酸序列和已知的核酸序列，后者常用核素和非核素示踪标记，称为,探针（,probe,），,杂交后形成异源性双链分子称为,杂交体,。,生命科学的,“钓鱼”,。,3,原位杂交原理核酸分子杂交（nucleic acid hybi,4,4,DNA,将探针置于载玻片上,制片,杂交,变性,检测,在荧光显微镜下观察,5,DNA将探针置于载玻片上制片杂交变性检测在荧光显微镜下观察5,原位杂交原理及实验过程,原位杂交的应用,1.EBER,2.HPV,3. Kappa,和,Lamda,荧光原位杂交的原理及探针类型,荧光原位杂交的应用,1.,实体性肿瘤,2.,淋巴造血系统肿瘤,3.,产前诊断,6,6,普通原位杂交（,ISH,）,用途： 检测,DNA,及,RNA,表达,的情况，辅助病学学诊断,检测项目：,1. EBV,病原,EBER,原位杂交检测,2. HPV,病原体低危,6/11,和高危,16/18,原位杂交检测,3. Kappa,和,lambda,克隆性分析原位杂交法检测,检测结果分析：,仅,为细胞核着色。只有当核分裂时可以出现细胞质阳性着色。,7,普通原位杂交（ISH）用途： 检测DNA及RNA表达的情,1,、,EBER,检测：,潜伏性,EBV,感染与几种情况相关：,鼻咽癌、淋巴组织疾病,（霍奇金淋巴瘤、,Burkitt,淋巴瘤、,NK/T,细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴瘤、肠病,T,细胞淋巴瘤、免疫抑制剂患者淋巴瘤、淋巴样肉芽肿、传染性单核细胞增多症等）。一旦感染,EBV,，受感染者终身带病毒。,EBV,具有感染和转化,B,细胞特性，能使小淋巴细胞转变成永生的类淋巴母细胞的特征。,8,8,9,9,2,、,HPV,检测：,HPV,感染与生殖器疣、宫颈癌相关（,12,个低危型、,15,个高危型）。,HPV,原位杂交检测；低危,HPV6/11,、高危,16/18,型。,10,2、HPV检测：10,3. Kappa,及,Lambda,检测,轻链限制性或者单克隆性可用于区分,B,细胞反应性增殖和肿瘤性增殖。,11,3. Kappa 及Lambda检测11,原位杂交原理及实验过程,原位杂交的应用,1.EBER,2.HPV,3. Kappa,和,Lamda,荧光原位杂交的原理及探针类型,荧光原位杂交的应用,1.,实体性肿瘤,2.,淋巴造血系统肿瘤,3.,产前诊断,12,12,13,13,14,14,15,15,FISH,探针种类,16,FISH探针种类16,FISH,探针种类,17,FISH探针种类17,18,18,19,19,原位杂交原理及实验过程,原位杂交的应用,1.EBER,2.HPV,3. Kappa,和,Lamda,荧光原位杂交的原理及探针类型,荧光原位杂交的应用,1.,实体性肿瘤,2.,淋巴造血系统肿瘤,3.,产前诊断,20,20,荧光原位杂交（,FISH,）,原理,：通过荧光标记的,DNA,探针与细胞核内的,DNA,靶序列杂交,用途,：检测基因异常,1.,基因片段,扩增,2.,基因片段,缺失,3.,基因片段,易位,FISH,技术的,应用,：,1.,靶向药物筛选,2.,危险人群筛查,3.,风险预测分析,4.,辅助诊断,21,荧光原位杂交（FISH）21,FISH,检测项目,1.,实体性肿瘤,Her-2,基因检测，指导,Herceptin,分子靶点的治疗；,EGFR,基因扩增检测，指导肺癌、肠癌分子靶点治疗；,ALK,基因易位检测，指导肺癌分子靶点治疗；,检测尿脱落细胞染色体非整倍性，用于膀胱癌的诊断、复发判断；,检测宫颈癌肿瘤细胞,TERC,基因扩增，判断,CIN,病变的演进风险等。,2.,淋巴造血系统疾病,淋巴瘤诊断分型，检测特异染色体易位，协助淋巴瘤分类；,慢性粒细胞白血病等白血病及多发性骨髓瘤,FISH,检测，判断预后等。,3.,产前诊断,唐氏综合症（,21,三体）等产前染色体数目检测，协助产前诊断。,22,FISH检测项目1.实体性肿瘤22,计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞，细胞核轮廓不清或有重叠的不要分析。,杂交不均匀的区域不要分析。,背景深影响信号判断的区域不要分析。,在分析石蜡切片时，分析的区域应在肿瘤细胞集中的部位（需由病理科医师认定）,如果超过,25,的细胞核内信号太弱，则该区域不要进行分析。,如果超过,10,的细胞质内有信号，则该区域不要进行分析。,结果判读、分析,23,计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞，细胞核轮廓不清或有,FISH,结果观察流程,观察程序：,首先在,HE,染色切片上确认癌细胞区域；,然后在,10,物镜下，于,FISH,标本上找到与,HE,染色切片上相同的组织细胞结构，仔细观察信号；,在,40,物镜下扫描整张切片，观察是否存在表达的异质性，以及标本的质量，满意的标本应是,75%,以上癌细胞核中都有杂交信号；,在,100,物镜下观察癌细胞核的,FISH,结果并进行信号计数和比值计算。,24,FISH结果观察流程观察程序：24,实体肿瘤,FISH,应用,25,实体肿瘤FISH应用25,1.,乳腺癌,Her-2/neu,基因扩增检测,26,1.乳腺癌Her-2/neu基因扩增检测26,27,27,28,28,HER2/CEN-17 1.8-2.2,临界,需重新再进行另外,20,个的细胞计数或重新,FISH,检测，如仍不确定，则建议临床结合,IHC,检测,HER2,蛋白表达情况决定是否使用靶向治疗。,CEN-17,多体性：计数,20,个细胞内绿信号的均值。,CEN-17,均值,3.76,高多体性,29,HER2/CEN-17 1.8-2.2 临界29,石蜡切片（,ASCO/CAP 2013,指南）,计数,至少3,0,个细胞，统计,Ratio,值（,Ratio,值,3,0,个细胞核中,红,/,绿,）。,Ratio2.0,或者,2.0,但,HER-2,信号数为,6.0,，结果为阳性，提示基因扩增；,Ratio,2.0,且,HER-2,信号数,4.0,为阴性结果，提示样本无基因扩增；,Ratio,2.0,且,4.0HER-2,信号数,6.0,时结果为不确定，可以选择增加计数细胞至,100,个,或重做,FISH,实验来判断最终结果。,若红信号明显成簇或成团，判断为扩增。,乳腺癌,HER-2 FISH,评分标准,30,石蜡切片（ASCO/CAP 2013指南）乳腺癌HER-2,31,31,32,32,33,33,34,34,35,35,36,36,2.,胃癌,Her-2/neu,基因扩增检测,37,2. 胃癌Her-2/neu基因扩增检测37,38,38,胃癌,HER-2 FISH,评分标准,胃癌,HER-2,检测指南：,计数,至少3,0,个细胞，统计,Ratio,值（,Ratio,值,3,0,个细胞核中,红,/,绿,）。,Ratio2.2,或者,HER-2,信号簇状，结果为阳性，提示基因扩增；,Ratio,1.8,为阴性结果，提示样本无基因扩增；,Ratio,在,1.8-2.2,时，选择增加计数细胞至,100,个,若,Ratio 2.0,，判断为阳性，若,Ratio 2.0,，判断为阴性。必要时,重做,FISH,实验来判断最终结果。,39,胃癌HER-2 FISH评分标准胃癌HER-2检测指南：39,40,40,3.,肺癌,EML4-ALK,基因融和检测,41,3. 肺癌EML4-ALK基因融和检测41,42,42,43,43,肺癌,EML4-ALK,检测指南：,计数至少,50,个肿瘤细胞,1.,无,ALK,基因断裂的肿瘤细胞中，橘红色和绿色重叠为黄色或者相互粘合（两个信号之间的间隔小于两个信号的直径）；,2.,在,ALK,基因断裂的肿瘤细胞中，橘红色和绿色分离（两个信号之间的间隔大于两个信号的直径），如果,50,个肺癌细胞中至少有,25,个存在分离信号，则为,ALK,FISH,阳性；,3.,在,ALK,基因断裂的肿瘤细胞中，橘红色和绿色分离（两个信号之间的间隔大于两个信号的直径），如果,50,个肺癌细胞中分离信号为,525,个，则需重复计数,50,个细胞，累计,100,个细胞中超过,15,个存在分离信号（,=15%,）则为,ALK,FISH,阳性；,肺癌,EML4-ALK,FISH,评分标准,44,肺癌EML4-ALK检测指南：肺癌EML4-ALK FISH,45,45,46,46,47,47,48,48,49,49,4.,其他实体肿瘤,FISH,应用,1.TOP2A/CSP17 (,乳腺癌,),：指导化疗药物蒽环类应用,2. EGFR/CDP17(,肺癌,),：指导靶向药物应用,3.C-MET(,肺癌,),：指导靶向药物的应用,4.TERC/CSP3,(,宫颈癌,),：判断,CIN,病变的演进风险分级，早诊,5. CSP3/CSP7,、,P16/CSP17(,膀胱癌,),：膀胱癌的早诊、复发判断；,6.PTEN/CEN10,、,FGFR1/CEN8,、,ERG,（前列腺癌）：判断预后、早诊,7.1p36/1p25,、,19q13/19p13,、,N-Myc/2q11,（神经母细胞瘤、神经胶质瘤）：辅助诊断、判断预后、指导化疗方案应用、,8.,PTEN/CEN10,（黑色素瘤）：指导药物治疗、判断预后,9. CCND1/CEN11,、,MDM2/CEN12,（间质瘤）：判断预后,10.SYT(,滑膜肉瘤,),：辅助诊断,11.EWS(,尤文肉瘤,),：辅助诊断,12.FKHR(,横纹肌肉瘤,),：辅助诊断,13.MDM2 (,脂肪肉瘤,),：辅助诊断,50,4. 其他实体肿瘤FISH应用1.TOP2A/CSP17 (,51,51,返回,52,返回52,53,53,54,54,返回,55,返回55,56,56,返回,57,返回57,58,58,返回,59,返回59,60,60,返回,61,返回61,62,62,63,63,返回,64,返回64,返回,65,返回65,返回,66,返回66,返回,67,返回67,返回,68,返回68,血液病,FISH,应用,69,血液病FISH应用69,目前常见的淋巴瘤染色体易位检测,IGH/BCL6 t(3;14)t(3;22) t,（,2,；,3,）染色体易位,-,弥漫性大,B,细胞淋巴瘤,IGH/BCL2 t(14;18)(q32;q21),染色体易位,-,滤泡性淋巴瘤,IGH/MYC t(8;14)(q24;q32),染色体易位,-Burkitts,淋巴瘤,IGH/CCND1 t(11;14)(q13;q32),染色体易位,-,套细胞淋巴瘤,API2/MALT1 t(11;18)(q21;q21),染色体易位,-,粘膜相关淋巴瘤,IGH/MALT1 t(14;18)(q32;q21),染色体易位,-,粘膜相关淋巴瘤,BCR/ABL t(9;22),染色体易位,-,慢性粒细胞性白血病,PML/RAR t(15,；,17)(q22;q21),染色体易位,-,急性早幼粒细胞性白血病,70,目前常见的淋巴瘤染色体易位检测IGH/BCL6 t(3;14,71,71,返回,72,返回72,73,73,返回,74,返回74,75,75,返回,76,返回76,77,77,返回,78,返回78,79,79,80,80,返回,81,返回81,82,82,返回,83,返回83,84,84,返回,85,返回85,产前诊断,FISH,应用,86,产前诊断FISH应用86,87,87,88,88,89,89,谢谢！,90,谢谢！90,