第七章发酵过程控制-发酵工程课件

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级, 发酵过程的代谢控制,发酵过程控制是发酵的重要部分,控制难点：过程的不确定性和参数的非线性,同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的,发酵过程的代谢控制, 发酵过程的代谢控制发酵过程控制是发酵的重要部分发酵,2,第一节,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,一 发酵过程的种类,分批培养,补料分批培养,半连续培养,连续培养,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次, 发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次一,3,1、 分批发酵,简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次, 分批发酵发酵过程的代谢控制发酵过程工艺控制的目的、研究,4,分批培养中微生物的生长,迟滞期,对数生长期,稳 定 期,死亡期,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次, 定 期死亡,5,微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期,在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。,当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快，比生长速率几近常数。这个时期称为对数生长期,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次, 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握,缺点 产率低，不适于测定动力学数据,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次, 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过,8,2、补料分批培养,在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。,在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次, 在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养,9,补料分批培养的优缺点,优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。,缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次, 在这样一种系统中可以维持低的,10,3、半连续培养,在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。某些品种采取这种方式，如四环素发酵,优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量,。,缺点 代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次, 控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于D，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学,缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次, 控制稀释速率可以使发酵过程最优化。,13,二 发酵过程工艺控制的目的,有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来,目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次, 发酵过程工艺控制的目的有一个好的菌种以后要有一个配合,14,发挥菌种的最大生产潜力考虑之点,菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率,菌代谢与环境的相关性 温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次, 发酵过程研究的方法和层次,1、研究方法,单因子实验,：,对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验,优点 一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。,缺点 如果考察的条件多，实验时间会比较长,各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次, 发酵过程研究的方法和层次1、研究方法单因子实验：对,19,数理统计学方法,：,运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。,优点 同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。,但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次, 发酵过程的中间分析,发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。,这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, 发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析是生产控制的,27,代谢参数按性质分可分三类：,物理参数：,温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等,化学参数：,基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等,生物参数：,菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, 在线检测参数和离线检测参数,在线检测参数,指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；,离线检测参数,指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度。,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, 在线检测参数和离线检测参数发酵过程的代,30,一 发酵过程主要分析的项目,目前发酵过程主要分析项目如下,1、pH,pH与微生物的生命活动密切相关 酶催化活性,pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, 发酵过程主要分析的项目目前发酵过程主要分析项目如下1、,31,2、排气氧、排气CO,2,和呼吸熵,排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率（OUR）。,排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, 反映产生菌的生长繁殖情况,反映产物合成的活力,菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。,糖含量测定包括总糖和还原糖。,总糖,指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖,。,还原糖,指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, mg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。,氨氮,指无机氨中的氮（NH,3,-N）。,氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。,但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。,发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, 显微镜观察,菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, OD,600660,适合于细菌、酵母,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, 在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积累情况,42,二 产物量的测定,（一） 产物量的特殊表示法,1、抗生素效价的表示,抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（U）来表示,效价表示方法：重量折算法,重量单位,类似重量单位,特殊单位,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, 产物量的测定（一） 产物量的特殊表示法1、抗生,43,重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个单位，如青霉素0.6微克1U,重量单位：规定某些抗生素活性部分1g=1u 如链霉素、卡那霉素、红霉素等定义活性部分1g1u,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, 1mg=3700u,多粘菌素B 1mg=10000u,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, 产物量的测定,1、化学法,（1）滴定法,产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可用滴定法,如青霉素在碱性条件下加入过量的I,2,，反应生成青霉噻唑酸碘，用Na,2,S,2,O,3,滴定多余的碘，可计算出青霉素的单位,柠檬酸可以用NaOH滴定来计算柠檬酸产量,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, 产物量的测定1、化学法（1）滴定法柠檬酸可以用NaO,47,（2）比色法,产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓度成正比，可以用比色法测定。,淀粉酶活力测定：在1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（3，5-二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生颜色，它在540nm处所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, 抑菌圈的半径(毫米）,M：抗生素在管中的量（单位）,C：最低抑菌浓度（单位/毫升）,H：培养基的厚度（毫米）,L：管子的高度（毫米）,D：抗生素的扩散系数（毫米/小时）,T：细菌生长到肉眼所用的时间,（小时）,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, 抑菌圈的半径(毫米）发酵过程的代谢控制发酵过程的中间分,53,抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学关系,logM=(1/9.21DT)r,2,+log(C.4DTH),抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径的平方呈正比。此外还受C、H、D、T的影响,但是C、H、D、T是无法测量的，在实际计算中要设法消去,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, D、T大,误差小,截距小 C、D、T、H小，误差小,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, D、T大,误差小发酵过程的,62,logM,r,logM1,r1,r1,r1,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析, You !, You !http:/biotech.ecus,65,发酵工程,精品课程, 微生物培养过程的参数检测,在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据,。,黑箱 灰箱,检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、,双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等,检测代谢中间物，分析代谢流向、RNA检测,一 参数在线检测,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, 微生物培养过程的参数检测黑箱,67,由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特殊要求：,插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）,传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）,传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏）,传感器性能要稳定，受气泡影响小。,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, 电信号,放大 记录显示仪,控制器（与设定参数比较）,发出调节信号 控制器动作,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, 电信号,70,介绍几种常用的在线检测的传感器及其工作原理,pH电极,溶氧电极,它们是基础电极，以它们为基础可以制作各种离子电极和酶电极,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, pH电极发酵过程,71,（一） pH测量,pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物过程控制是一个非常重要的参数。,1、pH的定义,影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，但对于稀溶液为了避免在氢离子活度很小时表达方式上的麻烦,引进pH=-lgH+,H+=0.00001时 用pH5表示,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, pH测量pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物,72,2、pH测量方法,pH试纸曾经是一种广泛采用的方法,优点：方便，易操作,缺点：它主观性较强,质量差异，不同厂家不同批号的pH试纸测出的pH值会有较大的差别，有时甚至达0.51。,对于一些要求较高的场合就适用,pH试纸,pH电极,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, pH试纸曾经是一种广泛采用的方法pH试纸发,73,（1）pH电极测量原理,pH电极实际上是由参比电极与指示电极组成的一个自发电池，该电池的表达式可写为：,参比电极 溶液X 指示电极,该电池的参比电极的输出电位恒定，指示电极的输出电位随被测体系中氢离子活度而变化。因此整个自发电池的电动势就是被测体系中氢离子活度的函数。,E,=E,0,- ln1/ =E,0,-2.303 pH,式中E,0,对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从电位差计的E值可测出pH值。,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, Hg,2,Cl,2,(S) Cl,-,(L) 电极电位产生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：,2Cl,-,+2Hg Hg,2,Cl,2,+2e,-,其电极电位为,Cl/HgCl,Hg,= + ln1/,由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活度有关而不受被测溶液的酸碱度影响,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, SiO-H,+,为主要成分的水合硅胶层，厚度约为10,-4,10,-5,mm,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, 试,水合硅胶层,干 玻 璃 层,水合硅胶层,内参比溶液,1,1, ,2, ,2,1,-,2,以,1,、,2,分别表示试液内与内参比溶液中H,+,离子活度，,1,、,2,分别表示外侧与内侧硅胶层表面H,+,离子活度，,由于水合硅胶层表面与内（内参比溶液）、外（试液）溶液中的H,+,离子从活度大的一方向小的一方迁移，使玻璃膜的外、内侧分别产生相界电位,1,和,2,。,经水浸泡后的玻璃膜截面成为三层结构，如图:,则有：,外侧: ,1,=K,1,+,内侧：,2,=K,2,+,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, 试水合硅胶层 干 玻 璃 层水合硅胶层内,80,可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，故K,1,=K,2,，水合硅胶层表面一价阳离子点已基本被质子占据，故,1,=,2,，于是玻璃膜内、外侧之间的电位差,膜=,1,-,2,=,由于内参比溶液的H,+,活度,2,一定，故玻璃膜电位与待测溶液的H,+,离子活度（pH值）成线性关系。,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, 在25下：但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有,82,玻璃,=,0,+,膜,+,不对称,其中， ,0,与,不对称,对于特定的电极是恒定的，故玻璃电极的电极电位与试液pH值呈线性关系。,（4）玻璃电极的性能,存在不对称电势,不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于膜内外表面状态不完全一样引起的，它与温度、玻璃组成、敏感膜厚度及加工状况等因素有关。不对称电势可以用已知pH值的标准缓冲液来校正,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, +膜+不对称其中， 0 与不对称,83,零电势或等电势点,电极电位为零时的溶液pH值称为零电势pH值，该值取决于内参比溶液的pH值。含有0.025mol/l的 KCl和等摩尔浓度的磷酸混合缓冲液的等电势点为pH=7，在pH7时，玻璃电极的极性发生改变。,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, k降低，测量值偏高,在酸性范围内pH1 k升高，测量值偏低,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, k降低,85,（5）玻璃电极的使用限制,对于蛋白质等粘度较大的测量体系，容易在玻璃电极敏感膜上产生沉积，应设法缩短电极的沉浸时间或设法对电极表面进行清洗，工业测试中常用特制毛刷或超声波清洗电极表面。,强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，如氢氟酸溶液会破坏电极,脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破坏水合硅胶层,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, 隔膜 被测体系 玻璃敏感膜 内参比电极之间达到电导通，组成原电池，其原理与双电极pH计的工作原理完全相同，只是结构更紧凑，使用更方便。,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, 敏化离子选择性电极,以离子选择性电极为基础电极，通过化学反应或生化反应使离子选择性电极的响应得到敏化，叫作敏化离子选择性电极。包括有气敏电极和酶电极等。,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, 敏化离子选择性电极以离子选择性电极为基础电极，通过,89,气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极,在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎水的透气膜，在透气膜和这种离子选择性电极之间充以中间溶液，透气膜不允许溶液中的离子通过，而只允许被测定的气体通过，直到透气膜内外两边该气体的分压相等。,进入透气膜的气体与中间溶液起反应，从而使中间溶液中的某一被离子选择性电极响应的物质的量发生变化，并通过选择性电极电位反映出来，达到间接表征被测气体含量的目的。,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, 1mol/L的NH,4,Cl溶液。氨电极使用的上限为1mol/L,下限为10,-6,mol/L。,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测, HCO,3,-,+H,+,产生的氢离子引起pH的变化，就可以测出溶解CO,2,的浓度。如果CO,2,扩散在水或NaHCO,3,的水溶液中，它们的pH值会依据下列的式子而变化：,发酵过程控制,微生物培养过程的参数检测,