第六章荧光光谱法课件

,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,2013.03-2013.06,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,第六章 荧光光谱法,1,2,3,分析方法,荧光分光光度计,基本原理,应用与示例,第六章 荧光光谱法123分析方法荧光分光光度计基本原理应用,要求,掌握基本原理,熟悉仪器基本构造,了解定量方法,要求掌握基本原理熟悉仪器基本构造了解定量方法,FL,物质分子,/,原子吸收光子能量被激发，然后从激发态,最低,振动能级返回到基态,时所发射出的光,Fluorescence,FL Fluorescence,根据物质的荧光谱线位置（波长）及强度进行物质鉴定和物质含量测定的方法,Fluorometry,根据物质的荧光谱线位置（波长）及强度进行物质鉴定和物质含量测,有些物质的分子在用紫外,-,可见光激发时，能发射荧光，由此建立的分析方法,Molecular Fluorometry,有些物质的分子在用紫外-可见光激发时，能发射荧光，由此建立的,6,1.,灵敏度非常高：检出限可达,10,-10,10,-12,g/ml,2.,选择性好,优点,61. 灵敏度非常高：检出限可达10-1010-12g/m,基本原理,分子荧光的产生,荧光光谱的特征,影响荧光强度的因素,基本原理分子荧光的产生荧光光谱的特征影响荧光强度的因素,8,1.,分子的电子能级与激发过程,2.,荧光的产生,分子荧光的产生,基本原理,8 1. 分子的电子能级与激发过程分子荧光的产生基本原理,基态,单重态,单重态,三重态,（,triplet state,）,（,singlet state,）,激发态,M=2S+1=1,（,S=0,）,M=2S+1=3,（,S=1,）,禁阻跃迁,1.,分子的电子能级与激发过程,基本原理,基态单重态三重态（triplet state）（single,10,光致发光的分子能级示意图,各个不同振,-,转能级,基本原理,10光致发光的分子能级示意图各个不同振-转能级基本原理,11,辐射跃迁和无辐射跃迁（热能形式）,电子：激发态 基态,2.,荧光的产生,振动弛豫,内部能量交换,荧光的发射（,辐射,）,外部能量交换,体系间交叉跃迁,磷光的发射（,辐射,）,基本原理,11 辐射跃迁和无辐射跃迁（热能形式）电子：激发态 基,1.,激发光谱和发射光谱,2.,荧光光谱特征,荧光的光谱特征,基本原理,1. 激发光谱和发射光谱荧光的光谱特征基本原理,荧光：先激发后发射,发射光谱,激发光谱,不同激发波长引起某一波长荧光发射相对效率,固定发射波长,扫描激发波长,固定激发波长,扫描发射波长,发射荧光中各波长相对强度,1.,激发光谱和发射光谱,（,excitation spectrum and emission spectrum,）,基本原理,荧光：先激发后发射发射光谱激发光谱不同激发波长引起某一波,14,激发,、,荧光,图形,激发光谱,变,不变,F,ex,图,发射光谱,不变,变,F,em,图,作用：,1.,鉴别荧光物质,2.,选择适当测定波长,基本原理,14激发、荧光图形激发光谱变不变Fex图发射光谱不,15,激发光谱及荧光光谱,A-,激发光谱；,F-,荧光光谱,基本原理,15激发光谱及荧光光谱基本原理,16,斯托克斯位移,荧光光谱形状与,ex,无关,荧光光谱与激发光谱互为镜像,2.,荧光光谱特征,基本原理,16斯托克斯位移2. 荧光光谱特征基本原理,17,溶液荧光光谱中，荧光（发射）光谱波长总大于激发光谱波长的现象,说明在激发与发射之间存在能量损失,1,）斯托克斯位移（,Stokes shift, 1852,年）,振动弛豫,内部转换,基本原理,17 溶液荧光光谱中，荧光（发射）光谱波长总大于激发光谱波长,18,内转换和振动弛豫使振动激发态电子快速降至,S,1,*,的最低振动能级荧光发射光谱只有一个发射带,荧光发射通常发生于,S,1,*,最低振动能级，与激发至哪一个电子激发态无关荧光光谱形态与,ex,无关,2,）荧光光谱形状与,ex,无关,基本原理,18 内转换和振动弛豫使振动激发态电子快速降至S1*的最低振,19,电子基态振动能级分布与激发态相似,E,相同,小峰间,与振动,E,有关，强度与跃迁几率有关,3,）荧光光谱与激发光谱互为镜像,基本原理,19 电子基态振动能级分布与激发态相似 E相同3）荧光光,20,蒽的能级跃迁,基本原理,20蒽的能级跃迁基本原理,21,蒽的激发光谱及荧光光谱,S,0,S,2,*,基本原理,21蒽的激发光谱及荧光光谱S0S2*基本原理,22,1.,荧光产生的条件,2.,影响荧光强度的结构因素,3.,影响荧光强度的外部因素,影响荧光强度的因素,基本原理,22 1. 荧光产生的条件影响荧光强度的因素基本原理,23,1,）荧光寿命（,fluorescence life time,）,1.,荧光产生的条件,除去激发光源后，分子荧光强度降低到激发时最大荧光强度的,1/e,（,37%,）所需的时间,常用,f,表示,荧光物质重要的发光参数之一,f,的计算,-,作图法（,p135,）,基本原理,231）荧光寿命（fluorescence life tim,24,激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用,f,表示：,f,：,01,f,大有荧光发射,2,）荧光效率,（,fluorescence efficiency,）,基本原理,24 激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数,25,例如,:,荧光素钠在水中,f,=0.92,荧光素在水中,f,=0.65,蒽在乙醇中,f,=0.30,菲在乙醇中,f,=0.10,基本原理,25 例如:荧光素钠在水中f =0.92荧光素在水中,26,3,）产生荧光的条件,分子必须有强,UV-Vis,吸收,有一定的荧光效率,能量以无辐射跃迁形式释放（内转换与外转换的速度很快）,无,荧光发射,否则,基本原理,26 3）产生荧光的条件 分子必须有强UV-Vis吸收有一定,27,1,）跃迁类型,2,）共轭效应（长共轭结构）,3,）刚性结构与共平面性效应,4,）取代基效应,2.,影响荧光强度的结构因素,（内部因素）,基本原理,271）跃迁类型2. 影响荧光强度的结构因素（内部因素）基,28,分子结构中存在共轭的,*,跃迁，也就是,K,带强吸收时，才可能有荧光发生,1,）跃迁类型,基本原理,28分子结构中存在共轭的*跃迁，也就是K带强吸收时，,29,电子共轭程度：,荧光强度（荧光效率） 、荧光波长（长移）,eg:,苯 萘 蒽,ex,(nm) 205 268,356,em,(nm) 278 321,404,f,0.11 0.29,0.36,2,）共轭效应（长共轭结构）,基本原理,29电子共轭程度：2）共轭效应（长共轭结构） 基本原理,30,同样的长共轭分子：,分子刚性和共平面性 ，荧光率 ，荧光波长,3,）刚性结构与共平面效应,8-,羟基喹啉,8-,羟基喹啉镁芴,基本原理,30 同样的长共轭分子：3）刚性结构与共平面效应8-羟基喹啉,31,增加分子,电子共轭程度,-,含孤电子对的杂原子基团荧光波长长移, 减弱分子的,电子共轭性,-,吸电子基团荧光减弱甚至熄灭,对,电子共轭体系作用较小对荧光的影响不明显,4,）取代基效应,基本原理,31 增加分子电子共轭程度-含孤电子对的杂原子基团荧,32,1,）温度的影响,2,）溶剂的影响,3,）,pH,值的影响,4,）荧光熄灭剂的影响,5,）散射光的影响,3.,影响荧光强度的外部因素,基本原理,32 1）温度的影响3. 影响荧光强度的外部因素基本原理,33,1,）温度：,温度升高荧光物质的荧光效率和荧光强度下降,原因,-,分子运动速率 碰撞概率 无辐射跃迁,2,）溶剂：,极性,，荧光波长,，荧光强度,原因,-,*,的,E,跃迁几率, 紫外和荧光波长,粘度, ，荧光强度,（和温度有关）,原因,-,分子碰撞概率 无辐射跃迁,基本原理,331）温度： 2）溶剂：原因-*的E 跃迁几率,34,3,）,pH,值的影响,荧光物质本身是弱酸或弱碱有较大影响,4,）荧光熄灭剂：,引起,荧光熄灭,的物质,荧光熄灭（猝灭）指荧光物质分子与溶剂,/,溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象,荧光熄灭的形式：,a.,碰撞,-,荧光自熄灭（溶液浓度过高时）,b.,生成不发光配位化合物,c.,荧光物质氧化,基本原理,34 3）pH值的影响4）荧光熄灭剂：基本原理,35,荧光物质中加入某种熄灭剂后，荧光强度减小与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系,荧光熄灭法（,fluorescence quenching method,）,利用这一性质测定,荧光熄灭剂,的含量,基本原理,35 荧光物质中加入某种熄灭剂后，荧光强度减小与荧光熄灭剂的,36,5,）散射光的影响：,瑞利散射,拉曼散射：产生能量损失的拉曼散射影响最大,-,原因：波长与荧光波长相近,-,措施：选择适当的激发波长,ex,（表,6-1,）,硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱,基本原理,365）散射光的影响： 瑞利散射硫酸奎宁在不同波长激,主要部件,仪器的矫正,荧光分光光度计,主要部件仪器的矫正荧光分光光度计,38,荧光分光光度计,38荧光分光光度计,39,荧光分光光度计由激发光源、激发单色器和发射单色器、样品池、检测器及读出系统组成,荧光分光光度计,主要部件,39荧光分光光度计由激发光源、激发单色器和发射单色器、样品池,40,荧光分光光度计结构示意图,荧光分光光度计,40 荧光分光光度计结构示意图荧光分光光度计,41,1.,激发光源,高压氙灯,强谱线的,连续光谱,连续分布在,250700nm,波长范围内,300400nm,波长之间的谱线强度几乎相等,汞灯,线光谱,高压：近紫外区（,365,398,405,436,546,579nm,）,低压：紫外区（最强,254nm,）,荧光分光光度计,411. 激发光源高压氙灯 强谱线的连续光谱荧光分光光度,42,2.,单色器（,两个,）,激发单色器,置于光源和样品池之间,除去不需要的光线,获得单色激发光,发射单色器,置于样品池和检测器之间选择不同的荧光发射波长,消除杂散光影响,荧光分光光度计,422. 单色器（两个）激发单色器荧光分光光度计,43,3.,样品池,低荧光的玻璃或石英,方形,散射光较少,90,o,测量,消除入射光的背景干扰,荧光分光光度计,433. 样品池低荧光的玻璃或石英荧光分光光度计,44,4.,检测器,主要：光电倍增管,其他：二极管阵列（色谱）、电荷转移（电泳）,冷却,改善信噪比,S/N,荧光分光光度计,444. 检测器主要：光电倍增管荧光分光光度计,45,5.,读出系统,数字电压表,记录仪,微机,荧光分光光度计,455. 读出系统数字电压表荧光分光光度计,仪器的矫正,影响因素众多,以被检出的最低信号表示,标液矫正,-,硫酸奎宁的检出限,/,纯水拉曼峰的,S/N,灵敏度,激发,/,荧光光谱,波长,以汞灯的标准谱线对单色器刻度进行校正,采用双光束光路以参比光束抵消误差,荧光分光光度计,仪器的矫正影响因素众多灵敏度激发/荧光光谱波长以汞灯的标准谱,47,定性分析,定量分析,分析方法,47定性分析分析方法,48,依据：,定性分析,特征光谱,激发光谱,荧光光谱,方法： 对照品对照,类似于紫外,-,可见光谱法，但特征性更强,分析方法,48 依据：定性分析特征光谱激发光谱 荧光光谱方法： 对照,49,1.,荧光强度与浓度的关系,2.,定量分析方法,定量分析,尤其适合于,痕量物质,含量测定,分析方法,49 1. 荧光强度与浓度的关系定量分析尤其适合于痕量物质含,荧光物质,受到激发,发射荧光,吸收光能,释放能量,溶液荧光强度与,吸收光能程度,荧光效率,有关,分析方法,荧光物质受到激发发射荧光吸收光能释放能量溶液荧光强度与,51,1.,荧光强度与浓度的关系,荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度：,L-B,定律：,定量基础,分析方法,511. 荧光强度与浓度的关系荧光强度正比于被荧光物质吸收的,52,荧光强度的灵敏度取决于检测器的灵敏度,改进光电倍增管和放大系统,灵敏度极高,vs,紫外,-,可见分光光度法：,A,(-log(I/I,0,)-,c,关系,放大光强信号时,入射光和投射光同时放大,比值不变,灵敏度不变,分析方法,52荧光强度的灵敏度取决于检测器的灵敏度改进光电倍增管和放大,53,1.,标准曲线法,2.,比例法（对比法、一点外标法）,3.,多组分混合物的荧光分析,4.,差示荧光法,2.,定量分析方法,类似于,UV-Vis,分析方法,53 1. 标准曲线法2. 定量分析方法类似于UV-Vis分,54,FL,与,UV,比较,区段：,UV-Vis,区,适用性：均可用于定性定量，多用于,定量,定量方法：相似,样品性质,:,以,液体,为主,用量：少,分析时间：快,操作难易程度：易,相同点,分析方法,54FL与UV比较 区段：UV-Vis区 相同点 分析方法,55,UV,FL,性 质,分子吸收光谱,分子荧光光谱,应用范围,广,荧光的物质，较少,选择性,不高,高,灵敏度,g/ml,10,-7,10,-10,10,-12,仪器观察角度,透射光,90,谱线数目,1,2,不同点,分析方法,55UV FL性 质 分子吸收光谱 分子荧光光谱 应用范围,56,直接荧光法,制备荧光衍生物,化学引导荧光,荧光熄灭法,胶束增敏荧光分析法,应用与示例,荧光分析法在药物研究中的应用,56直接荧光法应用与示例荧光分析法在药物研究中的应用,57,荧光新技术,激发荧光分析,时间分辨荧光分析,同步荧光分析,应用与示例,57荧光新技术激发荧光分析应用与示例,