gP96多肽复合物／树突状细胞疫苗研究课件

gP96,多肽复合物树突状细胞疫苗的实验研究,gP96,多肽复合物树突状细胞疫苗的实验研究,北京大学人民医院胸部微创中心胸外科,博士研究生： 李运,导 师： 王俊 教授,gP96多肽复合物树突状细胞疫苗的实验研究gP96多肽复,研究背景,研究背景,全世界肺癌病例,1910年,200例,1912年,374例,1920年,956例,（美国）,新增肺癌病例,肺癌死亡病例,1997年,178，100,160，400,2002年,169，400,154，900,2003年,171，900,157，200,发病占全部肿瘤发生的15%，死亡占全部因肿瘤死亡病例的29%,全世界肺癌病例1910年,gP96,or,DC,科研工作新问题,单方面要素,两方面要素,gP96,多价性,特异性,（抗原库）,DC,识别抗原,激活细胞免疫,（专职抗原,呈递细胞）,+gP96 or DC科研工作新问题单方面要素两方面,研究内容,研究内容,肺癌组织提取gP96,SDSPAGE凝胶电泳、银染鉴定、Western印迹分析,蛋白定量分析,RT-PCR检测RNA水平表达,免疫组化检测蛋白水平表达,第一部分 gp96多肽复合物提取鉴定,在肺癌组织中表达的研究,肺癌组织gP96提取和鉴定；,肺癌组织和正常组织gP96的表达水平；,目的,流程,肺癌组织提取gP96第一部分 gp96多肽复合物提取鉴定,定量分析测得所提取的gp96蛋白浓度在0.1g/ul左右，相当于50-80ug/g组织。,定量分析测得所提取的gp96蛋白浓度在0.1g/ul左右，,肺癌组织细胞浆中有棕黄色颗粒聚集,正常肺组织中细胞苏木素染色阴性,同一患者标本,Gene,N (xs),T (xs),t value,p value,gp96,0.67250.4713,1.1100.4467,-4.318,0.001,肺癌组织细胞浆中有棕黄色颗粒聚集 正常肺组织中细胞苏木素染色,外周血单个核细胞提取及体外扩增,流式细胞仪鉴定,gP96与树突状细胞共孵育制备疫苗,体外CTL反应，INF-浓度,淋巴细胞表型分析,第二部分 gP96多肽复合物/DC疫苗体外,诱导CTL反应实验研究,外周血来源DC培养和鉴定,gP96多肽复合物/DC疫苗的制备,gP96/DC,体外实验,目的,流程,外周血单个核细胞提取及体外扩增第二部分 gP96多肽复合,培养2-3天后的DC,培养7天后的DC,培养2-3天后的DC 培养7天后的DC,A-1培养前CD1a,-,A-2. 培养后CD1a,+,B-1. 培养前CD86,-,B-2. 培养后CD86,+,C-1. 培养前CD83,-,C-2. 培养后CD83,+,D-1. 培养前CD80,-,D-2. 培养后CD80,+,E-1. 培养前CD14,+,E-2. 培养后CD14,-,CD14,-,；CD80,+,；CD83,+,；CD86,+,A-1培养前CD1a- A-2. 培养后CD1,培养前淋巴细胞的CD3 培养10d后淋巴细胞的CD3,培养前淋巴细胞的CD4、CD8 培养10d淋巴细胞的CD4、CD8,CD3/CD8,T细胞明显增加；CD8,/CD4,细胞比例增加,培养前淋巴细胞的CD3,样本,ELISA反应的OD值(XS),释放IFN-的量（pg/ml）,gp96/DC,2.2440.133,4150.835,gp96,1.6740.162,3066.847,DC,0.1260.011,122.966,样本ELISA反应的OD值(XS)释放IFN-的量（pg,建立动物模型,以制备的疫苗免疫动物并种植肿瘤,观察成瘤率，肿瘤体积，动物生存时间,第三部分 gP96多肽复合物/DC疫苗,动物体内实验研究,gP96/DC在小鼠体内的抑制肿瘤生长作用的研究,目的,流程,建立动物模型第三部分 gP96多肽复合物/DC疫苗 gP,gP96多肽复合物树突状细胞疫苗研究课件,LA795肺癌肿瘤组织,提取Gp96,小鼠外周血,615小鼠肺癌模型,Gp96/DC,，,Gp96，DC,提取DC细胞,观察肿瘤生长情况及对小鼠生存期的影响,LA795肺癌肿瘤组织提取Gp96小鼠外周血615小鼠肺癌模,SCID小鼠,PAa肺癌肿瘤组织,提取Gp96,人外周血,免疫重建小鼠,荷人肺癌免疫重建小鼠,Gp96/DC疫苗,提取DC细胞,观察肿瘤生长情况及对小鼠生存期的影响,SCID小鼠PAa肺癌肿瘤组织提取Gp96人外周血免疫重建小,100%,75%,615小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积（xs cm）,组数,处理,动物数,肿瘤植入后天数,21,28,35,种植,10,2.630.87,6.461.47,8.041.40,GP96,8,0.330.27,0.700.62,1.491.17,DC,8,0.300.22,0.640.49,1.160.92,GP96+DC,8,0.210.22,0.320.30,0.620.30,615-LA795,：与组比较，,P,0.05。,：与组和组比较，,P,0.05,100%75%615小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积（xs,：与组比较，,P,0.05。,：与组和组比较，,P,0.05,615小鼠肿瘤植入后的生存时间,组数,处理,动物数,肿瘤植入后生存天数,种植,10,52,GP96,8,51.5,DC,8,58.5,GP96+DC,8,77,：与组比较， P0.05。615小鼠肿瘤植入后的生存时,SCID-PAa,：与组比较，,P,0.05。,：与组和组比较，,P,0.05,SCID小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积(XScm),组数,处理,动物数,肿瘤植入后天数,21,28,32,重建,16,0.380.12,0.750.30,0.900.33,GP96,8,0.090.06,0.170.06,0.220.11,DC,8,0.080.06,0.150.08,0.240.11,GP96+DC,8,0.030.03,0.080.08,0.120.13,87.5%,100%,SCID-PAa：与组比较， P0.05。SCID,SCID小鼠肿瘤植入后的生存时间,组数,处理,动物数,肿瘤植入后生存天数,重建,16,37,GP96,8,52,DC,8,52.5,GP96+DC,8,62,SCID小鼠肿瘤植入后的生存时间组数处理动物数肿瘤植入后生存,gP96多肽复合物树突状细胞疫苗研究课件,讨 论,讨 论,gP96在肺癌中的表达,基因表达的检测,mRNA水平：原位杂交、Northern Blot、核酸酶保护分析,Real-time RT-PCR、半定量RT-PCR 。,蛋白水平。,方法,比较,原位杂交,仅能提供mRNA在细胞内的定位信息，不能确定mRNA的含量，受人为因素影响大，无法检测极微量的mRNA,Northern Blot,敏感性低，样品用量大，对实验条件要求高，需要应用放射性物质，不适合检测低丰度的mRNA,Real-time RT-PCR,仪器和试剂盒价格昂贵，标准物难以获得,核酸酶保护分析,操作复杂，价格昂贵,半定量RT-PCR,高度敏感、准确、简便、快捷、对仪器要求低、可重复性强、易于掌握,gP96在肺癌中的表达基因表达的检测 mRNA水平：原位杂交,与正常组织相比，肺癌组织中编码gp96的基因在mRNA水平的表达明显增高的。这进一步证实了在罹患肿瘤时，以gp96为代表的HSPs合成明显增加，这是机体受到肿瘤刺激产生的热休克反应，以此来维持细胞内环境的稳定，是机体的一种保护性反应。,半定量RT-PCR法,mRNA水平,gP96,肺癌组织,正常肺组织,免疫组化法,蛋白水平,引物设计,循环次数,操作中注意：,模板,内对照,与正常组织相比，肺癌组织中编码gp96的基因,gP96,的提取,提取gP96的经典方法（Srivastava）：,饱和硫酸铵沉淀,刀豆球蛋白A亲和层析,DEAE离子交换层析,（提取率估计在20-30%，蛋白提取量在15-150ug/g组织 ）,存在的普遍问题：,蛋白提取率低 ，尚无法满足临床需要,解决：,更改其中的试剂或步骤：,去除饱和硫酸铵沉淀过程，离子交换层析柱换用MonoQ或POROS20QE柱,增加组织中gP96含量：,热刺激、缺氧等物理刺激或者通过转基因技术导入gP96cDNA重组真核表达质粒以增加细胞中gP96合成量,gP96的提取 提取gP96的经典方法（Srivastava,DC的来源,来源,培养方法建立,比较,脐带血,1992,肿瘤患者多无法获得,外周血,1994,取材容易，操作简单，DC生成量大，纯度高，可以反复进行，患者痛苦小，便于临床应用，是目前获得DC的较理想的途径。,骨髓,1995,穿刺操作复杂，获得细胞量少，需多点反复操作，可能会增加创伤，给患者造成极大的痛苦,DC的来源来源培养方法建立比较脐带血 1992肿瘤患者多无法,DC的分离和培养,分离纯化DC的方法,物理方法,根据细胞的黏附性进行分离,黏附分离法、尼龙毛分离法和羰基碳分离法等,根据细胞比重进行分离,葡聚糖-泛影葡胺（Ficoll）密度梯度离心、Percoll非连续性/连续性密度梯度离心及E花环沉淀分离等方法,免疫分选,淘洗法、流式细胞技术、磁性细胞分离术等方法,密度梯度离心获取单个核细胞,富集前体DC,细胞因子体外扩增培养,DC的分离和培养分离纯化DC的方法 物理方法 根据细胞的黏附,富集前体DC：去除粒、单核、T、B、NK和巨噬细胞,方法,特点,黏附法,直接黏附法,对细胞干扰小，DC获得率高,间接黏附法,培养体系小，节省细胞因子，细胞损伤大，DC获得率低,单抗法,免疫磁珠和流式细胞技术,需要大量的特殊抗体，细胞损失量大，价格昂贵，,细胞因子,作用,必需,GM-CSF,促进DC增殖，是最基本的因子,IL-4,抑制中性粒细胞和巨噬细胞增殖,争议,TNF-,促进DC成熟，抑制粒细胞产生,Flt3L,促进DC增殖，抑制DC分化,其他,LPS、CD40L、INF-、INF-及IL-1等,富集前体DC：去除粒、单核、T、B、NK和巨噬细胞方法特点黏,方法,备注,形态结构,相差显微镜、电镜,直观,分子表达,CD1a、CD80、CD86、CD40和CD83等，特别是CD83-树突状细胞的标志性分子,准确,功能状态,混合淋巴细胞反应,DC的鉴定,方法备注形态结构相差显微镜、电镜直观分子表达CD1a、CD8,关于动物肿瘤模型,动物模型的优越性：,避免了在人身上进行实验所带来的风险,临床上少见疾病可用动物随时复制出来,研究周期短，节省时间，克服人类某些疾病潜伏期长，病程长和发病率低的缺点,可在人为控制条件下进行实验,可以严格控制实验条件，增强实验材料的可比性,取材方便，可以简化实验操作和样品收集,成本低,有助于更全面地认识疾病的本质,关于动物肿瘤模型动物模型的优越性：避免了在人身上进行实验所带,按产生原因,自发性肿瘤模型,实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下所发生的疾病,诱发性肿瘤模型,使用物理的、化学的和生物的致病因素作用于动物诱发肿瘤,移植性肿瘤模型,人类肿瘤移植动物,按系统范围,疾病的基本病理过程模型,各种疾病共同的一些病理变化过程的模型,各系统疾病模型,与人类各系统疾病相应的模型,按模型种类,整体 模型,离体器官和组织,细胞株,分类,按产生原因 自发性肿瘤模型 实验动物未经任何有意识的人工处置,已建立动物模型的人类肿瘤：,肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胶质瘤等,常用的动物：,小鼠、大鼠、兔、鸡胚等,近交系小鼠：,BALB/c、C57、C3H、615、T739、裸鼠、SCID,小鼠等五十余种,已建立动物模型的人类肿瘤：肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌,SCID小鼠,16号染色体近着丝点处单个隐性基因发生SCID突变,基因重排异常,免疫球蛋白重链,T细胞抗原受体,T、B淋巴细胞前体分化,T、B淋巴细胞,细胞免疫,体液免疫,免疫球蛋白缺如,淋巴细胞严重减少,对体外移植物免疫排斥低,联合缺陷,+,1983,年,Bosma,免疫重建,1988,年,Moiser,骨髓,胸腺,脾,胎肝,外周血淋巴细胞,腹腔,皮下,免疫系统恢复,且具有人类免疫系统的特征,SCID小鼠16号染色体近着丝点处单个隐性基因发生SCID突,与人体内环境极其类似,保证了患者本身的安全,带有人类肿瘤,具有人类免疫系统,研究肿瘤生长的理想动物模型,与人体内环境极其类似带有人类肿瘤研究肿瘤生长的理想动物模型,gP96/DC在体外可诱发强烈的CTL反应,在体内可有效抑制肿瘤生长,gP96+DC-特异性+多价性-避免了肿瘤的免疫逃逸,探寻机制,抗原肽（小分子,）,DC,gP96+抗原肽,CD91,T,淋巴细胞,MHC分子、共刺激分子,粘附分子,gP96/DC在体外可诱发强烈的CTL反应gP96+DC-,体外扩增培养DC,未成熟,DC,凋亡,gP96,成熟DC,直接与T淋巴细胞接触发生作用,未接触肿瘤抗原,不需激活,肿瘤抗原,非专职抗原呈递细胞,抗原特异性免疫耐受,专职抗原呈递细胞,特异性免疫防御反应,体外扩增培养DC未成熟DC凋亡gP96成熟DC直接与T淋巴细,结 论,结 论,gP96/DC，在动物体内可降低肿瘤成瘤率，明显抑制肿瘤生长，延长宿主生存时间,属于个体化治疗方案，是未来原发肿瘤切除后微小转移灶的预防和治疗的有效措施之一,gP96在肺癌组织中RNA和蛋白水平的表达明显高于正常肺组织,gP96/DC疫苗在体外可激发更强烈的CTL反应，刺激T淋巴细胞增殖，CD8+/CD4+细胞比例增加，并使T淋巴细胞IFN-分泌明显增加,gP96/DC，在动物体内可降低肿瘤成瘤率，明显抑制肿瘤生长,