UT对PQ中毒后损伤肺成纤维细胞的修复作用研究课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,内容介绍,研究背景,1,2,3,预计结果与展望,4,立项依据与创新,实验技术及过程,Company Logo 内容介绍研究背景123预计结果与,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,研究背景,-,百草枯简介,?,百草枯,(paraquat,PQ),，,20%,，,250mL,装；是一种有机杂环,类广谱非选择性接触性除草,剂及脱叶剂。,?,PQ,对人畜具有较强毒性，人,口服致死量约为,1,3g,。,?,中毒后致急性肺损伤及肺纤,维化改变为其特异表现,?,缺少特效解毒剂和能够在血,液或组织中与,PQ,结合的螯合,剂，,PQ,中毒的病死率高达,60%,80%,。,Company Logo 研究背景-百草枯简介?百草枯(p,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,研究背景,-,乌司他丁简介,?,乌司他丁,(Ulinastain,UT),，,本品是从健康成年男性新鲜,尿液中分离纯化出来的一种,糖蛋白,，由,143,个氨基酸组成，,相对分子质量,约,6700,。本品,属,蛋白酶抑制剂,，对胰蛋白,酶、,-,糜蛋白酶等,丝氨酸蛋,白酶,及粒细胞弹性蛋白酶、,透明质酸酶、巯基酶、纤溶,酶等多种酶有抑制作用。另,具有稳定溶酶体膜，抑制溶,酶体酶的释放，抑制,心肌抑,制因子,（,MDF,）产生，清除,氧自由基及抑制炎症介质释,放的作用。,Company Logo 研究背景-乌司他丁简介?乌司他丁,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,研究背景,-,肺成纤维细胞,?,正常情况下，,MRC-5,存在,精确调控，分泌的细胞外,基质（,ECM,）处于动态平,衡。,?,胶原蛋白是主要的,ECM,蛋,白，占肺干重,1/5,（、,）。,?,肺损伤后，,MRC-5,及胶原,蛋白过度合成，参与病理,修复。,?,胶原蛋白的生成和沉积将,导致肺纤维化,Company Logo 研究背景-肺成纤维细胞?正常情况,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,肺成纤维细胞,炎症介质,百草枯,细胞因子,力学刺激,缺氧,肺成纤维细胞,Company Logo 肺成纤维细胞炎症介质百草枯细胞因,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,研究背景,-,结缔组织生长因子（,CTGF,）,?,CTGF,属于,TGF-,家族，作为,TGF-,的下游因子，,主要促进细胞增殖、粘附，,ECM,异常沉淀,?,早期即刻蛋白，主要表达于活化的肺纤维细胞，,见于肺纤维变性早期，晚期极弱。,?,可作为纤维化病变早期诊断标志物。,?,促纤维化作用呈剂量依赖，可被抗,CTGF,抗体拮,抗。,Company Logo 研究背景-结缔组织生长因子（CT,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,研究背景,-,细胞力学特性,?,力学特性（粘弹性）是细胞的一种本质属性，细胞所处的,生理,/,病理状态、组织环境和力环境不同，所表现的力学,特性也不尽相同。,?,解释一些组织器官的生理、病理变化以及解释疾病的发病,与治疗机理等具有重要的意义。,?,目前为止，国内外尚未见有关百草枯中毒过程中肺成纤维,细胞生物力学特性变化的报道。,Company Logo 研究背景-细胞力学特性?力学特性,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,前期工作,课题组在这方面已有一定的工作基础。部分工作人员，曾,在吉林省科技发展计划项目（,20100138,）百草枯致中毒,性肺纤维化发病机理的力学生物学研究的支持下，研究了,百草枯致中毒后短时间内肺成纤维细胞的,CTGF,的表达、,细胞增殖情况及细胞粘弹性的变化等，实验结果表明百草,枯影响了细胞的生物学特性和生物力学特性。并已发表文,章,2,篇。,1. Guohui Wang,，,Yongpeng Xie,，,Dan Shi,，,Nan Zhang. The Effects,ofmechanical stimulation on proliferation and CTGF expression of human,lung fibroblast. The 4th International Conference on Image and Signal,Processing, (2011,年,10,月发表，,EI,收录,),2. Guohui Wang,，,Yongpeng Xie,，,Nan Zhang. The Study of CTGF Expression,of Lung Fibroblasts After Treated by Paraquat,，第十六届亚太呼吸年会,.( 2011,年,11,月发表，,SCI,收录,),Company Logo 前期工作课题组在这方面已有一定的,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,人胚肺成纤维细胞,MRC-5,Olympus,倒置相差显微镜,:,培养皿中细胞正常生长，形态呈长梭形。,Company Logo 人胚肺成纤维细胞MRC-5Oly,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,百草枯处理前后,MRC-5,细胞显微图片,A,：正常,MRC-5,细胞,B,：,50mg/LPQ,培养液处理后,C,：,100mg/LPQ,培养液处理后,D,：,200mg/LPQ,培养液处理后,Company Logo 百草枯处理前后MRC-5细胞显微,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,PQ,对,MRC-5 CTGF,表达的影响,各组细胞,CTGF,浓度比较（,*,P,0.05,）,Company Logo PQ对MRC-5 CTGF表达的,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,PQ,对,MRC-5,生物力学特性影响,肺成纤维细胞在,30mm,水柱负压下吸入长度随时间变化情况,Company Logo PQ对MRC-5生物力学特性影响,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,PQ,对,MRC-5,生物力学特性影响,?,经过,PQ,处理后,MRC-5,细胞的粘,弹性各项参数均明显小于正常,MRC-5,细胞,?,也就是说经过,PQ,处理后的,MRC-5,生物力学特性降低，变,得较“软”,?,在经过,100mg/L,和,200mg/L,百草枯处理后,MRC-5,粘弹性要,小于,50mg/L,?,而,100mg/L,和,200mg/L,百草,枯处理组之间细胞的粘弹性无,明显差异,各组细胞粘弹性参数比较,Company Logo PQ对MRC-5生物力学特性影响,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,实验目的,通过实验研究乌司他丁对百草枯中毒,后损伤肺成纤维细胞的修复作用，得,到乌司他汀对百草枯致肺损伤的治疗,效果及治疗原理。,Company Logo 实验目的通过实验研究乌司他丁对百,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,实验内容,应用乌司他汀注射液处理经不同浓度百草枯损伤的肺,成纤维细胞，检测细胞,CTGF,的表达及细胞的粘弹性，,说明乌司他汀对百草枯中毒后损伤肺成纤维细胞的修,复作用，研究乌司他汀对百草枯致肺损伤的治疗效果,并解释其治疗原理。,Company Logo 实验内容应用乌司他汀注射液处理经,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,试验器材,?,仪器及材料,?,细胞：,人胚肺成纤维细胞,MRC-5,，中科院细胞库。,?,试剂：,胎牛血清培养基、胰蛋白酶、,CTGF,ELISA,试,剂盒。,?,主要仪器：,二氧化碳培养箱、,高低速离心机、微管,吸吮系统,、流式细胞仪、,ELx-800 NB,酶标仪及配,套洗板机等。,Company Logo 试验器材?仪器及材料?细胞：人胚,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,微管吸吮系统,k,2,k,1,L,b,a,p,本实验我们采用微,管吸吮技术检测肺成,纤维细胞在一定负压,下吸入长度随时间的,变化，结合标准线性,固体粘弹性模型得到,了正常及百草枯处理,后肺成纤维细胞的生,物力学特性（粘弹性,参数），研究百草枯,对人肺成纤维细胞生,物力学特性的影响。,Company Logo 微管吸吮系统k2k1Lbap,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,试验方法,1.,用含不同浓度百草枯的细胞培养液（,50mg/L,、,100mg/L,、,200mg/L,）处理常规培养的肺成纤维,细胞,12h,。,12h,后换含乌司他丁的细胞培养液继续,培养，在乌司他丁处理后,0h,、,12h,、,24h,、,36h,、,48h,获取细胞进行检测。,2.,通过,PCR,技术及酶联免疫吸附试验技术检测肺成纤,维细胞,CTGF,的表达。,3.,结合标准线性黏弹性模型，采用微管吸吮技术测试,细胞的力学特性（粘弹性参数）,Company Logo 试验方法1.用含不同浓度百草枯的,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,技术流程图,肺成纤维细胞的常规培养,不同浓度百草枯处理细胞,12h,不同浓度乌司他汀处理细胞,0h,、,12h,、,24h,、,36h,、,48h,获取细胞,PCR,及,ELISA,法检,测,CTGF,的表达,微管吸吮技术检测,细胞粘弹性,乌司他汀对百草枯中毒后损伤肺成纤维细胞的修复作用,及治疗肺损伤的机理,Company Logo 技术流程图肺成纤维细胞的常规培养,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,拟解决的技术难题,第二,第三步,第一,选择合适的力学刺,激（波形、拉伸幅,度、频率、时间）,，模拟在体肺细胞,的力学环境，对人,胚肺成纤维细胞进,行体外力学环境培,养；,选用合适的百草,枯剂量处理人胚,肺成纤维细胞；,并选择合适的乌,司他汀治疗剂量,处理中毒的人胚,肺成纤维细胞。,对实验结果从生物,学,-,医学,-,力学角度,进行综合分析,Company Logo 拟解决的技术难题第二第三步第一选,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,拟采集数据结果,UT,对,PQ,处理后,MRC-5,增殖的影,响,UT,对,PQ,处理后,MRC-5 CTGF,表达的,影响,UT,对,PQ,处理后,MRC-5,生物力学特性影,响,Company Logo 拟采集数据结果UT对PQ处理后M,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,创新点,?,a.,从细胞层次来研究乌司他汀治疗百草枯致,肺损伤的效果及治疗原理。,?,b.,根据细胞,CTGF,的表达及细胞粘弹性的变化,来说明细胞的损伤及修复情况。,?,c.,从力学,-,生物学角度来说明乌司他汀对百草,枯致肺损伤的治疗效果及治疗原理。,Company Logo 创新点?a.从细胞层次来研究乌司,C,o,m,p,a,n,y,L,o,g,o,预期结果,通过实验证明乌司他汀将对损伤的肺成纤维细,胞有修复作用，影响细胞,CTGF,的表达，改变,细胞的粘弹性，对百草枯致肺损伤有较好的治,疗效果，课题结束将发表高质量论文,2-3,篇。,Company Logo 预期结果通过实验证明乌司他汀将对,themegallery,themegallery,