SNP分子标记的原理及应用解读课件

,Related Documents,Click to edit Master text,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Related Documents,Click to edit Master text,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Related Documents,Click to edit Master text,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,、,SNP分子标记的原理及应用,、SNP分子标记的原理及应用,1,SNP 的概念,单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。,它包括单碱基的转换, 颠换、 插入及缺失等形式,。,SNP 的概念 单核苷酸多态性(Single Nucleot,2,SNP 的特点,（1）,密度高,SNP在人类基因组的平均密度估计为 11000 bp , 在整个基因组的分布达 310,6,个。,（2）,富有代表性,某些位于基因内部的SNP 有可能直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此, 它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。,（3）,遗传稳定性,与微卫星等重复序列多态性标记相比, SNP 具有更高的遗传稳定性。,（4）,易实现分析的自动化,SNP标记在人群中只有两种等位型(allele) 。这样在检测时只需一个“ + - ”或“全无”的方式,这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动化。,SNP 的特点,3,种族遗传学,Tang 等研究了来自世界五个地区(中国、马来、高加索、印度和非洲) 人群的,MDR1,基因的单倍体和连锁不平衡特征,发现具有e12/ 1236T2e21/,2677T2e26/ 3435T 亚型的单倍型mh5 在非洲人群以外的四种人群中高度表达,而具有e12/ 1236C2e21/ 2677G2e26/ 3435C 亚型的单倍型mh7 在非洲人群中占了1/ 3 以上,进一步证明了种族间的表形差异。,SNP 的,应用,种族遗传学SNP 的应用,4,疾病易感性研究,原理：SNPs 被认为是一种稳定遗传的早期突变,与疾病有着稳定的相关性。当一个遗传标记的频率在患者明显超过非患者时,即表明该标记与疾病关联,通过比较分析两者的单倍型和研究连锁不平衡性,可将基因组中任何未知的致病基因定位。,Horikawa 等应用SNPs作为遗传标记通过基于连锁不平衡的相关分析,在墨西哥裔美国人群和北欧人群中发现了一个DM 易感基因,该基因第三个内含子上的A/ G多态性(SNP43) 同2 型糖尿病(2 型DM) 连锁,该位点为纯合子G的个体患2 型DM 的风险增加,这是目前为止所发现的第一个与2 型DM 相关的SNP ,预示了SNP 在DM 相关基因研究中的重要作用。,疾病易感性研究,5,药物基因组学研究,SNPs 可以精细地反映个体的遗传差异,SNPs 位点与个体的药物反应进行相关分析,从而确定基因在药物作用中的功能和意义。这样既可以根据患者的遗传特性设计治疗方案,实现“个性化治疗”,提高药效，降低药物的毒副作用,又可以在临床试验阶段为特定的药物选择合适的受试者,提高效率,减少费用。,药物基因组学研究,6,遗传育种的应用,检测水稻SNP，研究优良性状与SNPs的关联关系，指导育种。,遗传育种的应用,7,SNP,的,检测方法,基于以下9 种基本原理:,以,结构,为基础;,1.1,限制性片段长度多态性法,（,RFLP,）,;,1.2,单链构象多态性法,（,SSCP,）,;,1.3,变性梯度凝胶电泳,（,DGGE,）,;,等位基因特异PCR,（,AS-PCR,）,;,RT-PCR;,等位基因特异性杂交;,引物延伸法,-单碱基延伸法,;,DNA直接测序法,;,飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测;,变性高效液相色谱 ( DH PLC )法,；,SNP的检测方法基于以下9 种基本原理:,8,1.1,RFLP法,原理：,利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。,1.1 RFLP法原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，,9,1.2,单链构象多态性(SSCP),原理：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。,在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。,特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。,1.2 单链构象多态性(SSCP)原理：单链DNA 在中性条,10,1.3,变性梯度凝胶电泳（DGGE）,原理：是利用长度相同的双链 DNA片段解链温度不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开的电泳技术。,1.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）原理：是利用长度相同的双,11,2.,等位基因特异 PCR ( AS-PCR),原理：,根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3末端与 SNP位点的碱基互补(或相同) ,另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS,-,PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而确定基因型的 SNP。,2. 等位基因特异 PCR ( AS-PCR)原理：根据 S,12,3.,RT-PCR,实时荧光PCR 技术( RT-PCR )一种通过检测PCR 过程中和PCR 之后产生的荧光信号来区分等位基因类型的SNP 检测技术, 同时基于荧光能量转移原理( FRET) 。每检测一个SNP 位点需要一条探针, 其3 端连有淬灭剂基团, 5 端连有荧光剂基团, 最终与SNP 位点完全匹配时探针结构被破坏, 从而发出荧光而被检测。,3. RT-PCR实时荧光PCR 技术( RT-PCR )一,13,SNP分子标记的原理及应用解读课件,14,定量分析,高灵敏,TaqMan,Gene Expression Master Mix,定性分析,高特异性,TaqMan,Genotyping Master Mix,ABNew Master Mix,定量分析 定性分析ABNew Master Mix,15,4.,等位基因特异性杂交,等位基因特异性杂(Allele specific hybridization ,ASH),根据核苷酸探针和互补的目的片段进行杂交，完全匹配和有错配两种情况下杂交复合体稳定性的不同而将SNP 位点检测出来。,等位基因特异核苷酸片段分析( ASO) ，基因芯片和动态等位基因特异性杂交( DASH) 等。,4. 等位基因特异性杂交等位基因特异性杂(Allele sp,16,SNP分子标记的原理及应用解读课件,17,5.,引物延伸法,-单碱基延伸法,5.引物延伸法-单碱基延伸法,18,单重SNaPshot数据,单重SNaPshot数据,19,多重SNaPshot反应原理,多重SNaPshot反应原理,20,SNaPshot操作流程,SNaPshot操作流程,21,SNaPshot,Multiplex试剂盒,SNaPshotMultiplex Ready Reaction Mix,一管做,10,个位点,对照,: 30,个反应,6条对照引物: 20A, 28G/A, 36G, 44T, 52C/T, 60C,对照模板DNA: Ampliconfrom CEPH DNA,0.01 0.4 pmol纯化的PCR模板,Matrix Standard DS-,02,dR110, dR6G, dTAMRA, dROX, LIZ,SNaPshotMultiplex试剂盒SNaPshot,22,质粒,SNaPshot PCR,纯化,电泳样本制备,电泳,PCR,产物,纯化,软件分析,质粒SNaPshot PCR纯化电泳样本制备电泳PCR产物纯,23,SNaPshot PCR,SNaPshot PCR,24,SNaPshot PCR产物纯化,Seal plate & incubate,乙醇沉淀法,:,11 个步骤, 1 小时,Add reagents,Centrifuge,Empty plate,Add reagents,Seal plate & incubate,Analyze,Re-suspend,Dry,Centrifuge,Empty plate,Seal plate,SNaPshot PCR产物纯化Seal plate & i,25,加样,震荡 30 分钟,分析,离心,封口,BigDye XTerminator Purification Kit,加样震荡 30 分钟分析离心封口BigDye XTermi,26,6.,DNA测序法,直接测序是最容易实施的SNP检测方法。,原理: 通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较, 以确定所研究的碱基是否变异, 其检出率可达100%。,特点：可以得到SNP 的类型及其准确位置等SNP分型所需要的重要参数。,6.DNA测序法直接测序是最容易实施的SNP检测方法。,27,SNP分子标记的原理及应用解读课件,28,7.,飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测,原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物共价结合后, 在硅芯片上进行引物的退火,延伸反应, 突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。,7.飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测 原理,29,SNP分型的方法多种多样，MassARRAY分子量阵列技术是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具，通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDITOF质谱技术相结合，实现基因分型检测。,基于MassARRAY 分子量阵列平台的iPLEX GOLD技术可以设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验设计非常灵活，分型结果准确性高。特别适合于对全基因组研究发现的结果进行验证，或者是有限数量的研究位点已经确定的情况。,SNP分型的方法多种多样，MassARRAY分子量阵列技术是,30,MassARRAY技术原理:,先通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基,，,在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止。根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量。,将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而,检测出SNP位点信息。,MassARRAY技术原理:先通过PCR扩增目标序列，然后加,31,SNP分子标记的原理及应用解读课件,32,SNP分子标记的原理及应用解读课件,33,SNP分子标记的原理及应用解读课件,34,SNP分子标记的原理及应用解读课件,35,SNP分子标记的原理及应用解读课件,36,SNP分子标记的原理及应用解读课件,37,优势,（1）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一分子量，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本身出错的概率非常低；,（2）质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何pmol级别的物质都能被检测出来；,（3）通量高：几秒就能检测完一个反应孔；,（4）操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规PCR仪器；,（5）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应；,（6）便宜：引物不带荧光标记，普通长度（3条引物总长80bp左右），此外在一个反应孔内能完成4个或更多的反应，即通常所说的4重反应；,（7）兼容性强：质谱仪还能在核酸的其它方向，以及蛋白质组学、微生物鉴定等领域也能应用。,（8）质谱技术是“一管式操作”，即反应体系在生化学实验过程中始终在一个试管内反应，没有多次转移，这样就减少被污染的概率。,优势（1）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一分子量，不涉,38,8.,变性高效液相色谱( DHPLC),原理：目标核酸片段,PCR,扩增，部分加热变性后，含有突变碱基的,DNA,序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来,从而达到分离的目的。,SNPs,的有无最终表现为色谱峰的峰形或数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的碱基。,特点：使用高效液相色谱检测,SNPs,具有检测效率高，便于自动化的优点，对未知,SNPs,的准确率可达,95%,以上。但,DHPLC,检测对所用试剂和环境要求较高,容易产生误差,不能检测出纯合突变。,8.变性高效液相色谱( DHPLC)原理：目标核酸片段PCR,39,SNP分子标记的原理及应用解读课件,40,SNP分子标记的原理及应用解读课件,41,SNP分子标记的原理及应用解读课件,42,