微生物基因组学课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物基因组学,微生物基因组学,一、概述,1,、微生物基因组学：是在微生物全基因测序的基础上，对单个基因或,多个基因的作用、功能以及它们之间的相互关系,的一门学科。,2,、微生物基因组学是人类基因组学的一部分：,1994,年美国首先发起微生物基因组研究计划，称为,MGP,计划（,microbial genomic project, MGP,），它是人类基因组计划的一个重要组成部分。,一、概述1、微生物基因组学：是在微生物全基因测序的基础上，对,3,、微生物基因组学的主要研究内容,从研究工作的内容而言,结构基因组学,功能基因组学,比较基因组学,从工作顺序而言,微生物基因序列的测定,微生物基因组的注释,微生物基因组的功能研究,3、微生物基因组学的主要研究内容从工作顺序而言,二、微生物基因组的序列测定,测序目的 研究基因组的前提和基础。,测序策略,1.,应根据待测序列的长度、要求测序的精确度和现有的条件来制定测序策略。,2.,测序类型分为两类,:,确认性测序 从头测序,二、微生物基因组的序列测定,大规模基因组测序的几个支撑技术,Sanger,双脱氧末端终止法,PCR,技术,1,、克隆,2,、水生栖热菌,(,Thermus aquaticus,) 3,、罗氏制药,DNA,自动测序仪的发展,AppliedBiosystems,美国应用生物系统公司,生物信息学分析软硬件设施,大规模基因组测序的几个支撑技术 Sanger双脱氧末,DNA,测序有几种方法，但到目前为止最常用的,是,20,世纪,70,年代中期发明的链终止（,Sanger,法）,Sanger is the only chemist to have received two Nobel Prizes in Chemistry, the first as the sole recipient in 1958 for his work on insulin, and the second in 1980, shared with Paul Berg and Walter Gilbert, for the sequencing of nucleic acids.,DNA测序有几种方法，但到目前为止最常用的Sanger is,“,双脱氧末端终止”的含义,“双脱氧末端终止”的含义,Sanger,双脱氧末端终止法测序原理,Sanger 双脱氧末端终止法测序原理,自动化测序,荧光染料标记物的发明：,使链终止法用于自动化测序，用不同的荧光色彩标记,ddNTP,，如,ddATP,标记红色荧光，,ddCTP,标记蓝色荧光，,ddGTP,标记黄色荧光，,ddTTP,标记绿色荧光。由于每种,ddNTP,带有各自特定的荧光颜色，而简化为由,1,个泳道同时判读,4,种碱基。,自动化测序荧光染料标记物的发明：,微生物基因组学课件,微生物基因组学课件,第一代测序技术：,Sanger,等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和,Gilbert,等发明的化学降解法。,第二代测序技术,循环阵列合成测序法,第三代测序技术,（单分子测序，直接测序）,近期出现的,Helicos,公司的,Heliscope,单分子测序仪、,Pacific Biosciences,公司的,SMRT,技术和,Oxford Nanopore Technologies,公司正在研究的,纳米孔单分子技术,， 被认为是第三代测序技术。,测序技术展望,非光学显微镜成像：将核苷酸的空间线性排列方式可视化。,第一代测序技术：Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和,美国,X,奖基金会,2006,年,10,月,4,日宣布设立一项金额高达,1000,万美元,的奖金，激励科学家“多快好省”地绘制出人类基因图谱。,规则：在,30,天内以高精确度测序,100,个百岁老人基因组样本，并覆盖,98%,的基因组，每个基因组的测序费用控制在,1000,美元,或以下。,美国X奖基金会2006年10月4日宣布设立一项金额高达100,微生物基因组测序的策略,1.,随机测序法 即不考虑方向性，随机对靶,DNA,进行测序，最后采用计算机拼装而得到完整的序列信息。该方法又包括两种方法。,鸟枪法 它包含有三种消化法,限制性内切酶消化法超声波处理法胰,DNA,酶消化法,微生物基因组测序的策略,人工转座子法,转座子是具有跳跃功能的,DNA,元件，是细菌或酵母染色体上的特定基因区，利用转座酶可使转座子随机插入靶,DNA,。,优点：,一次体外反应即可形成大量转座子的插入。,可以在其上加入更有利于,DNA,测序（或制图）的基因元件。,人工合成的转座子两头带有特殊的引物位点，所以插入位点的两侧序列可有效迅速地得以确定。,人工转座子法,一段,DNA,顺序可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用，此过程称,转座,。,转座子,(transposons),在原核生物与真核生物基因组中存在着可从一个染色体位点转移到另一位点的一些,DNA,序列。（文献上有时形象地称其为是跳跃基因，,jumping gene,）。,一段DNA顺序可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一,1951. Barbara McClintock,提出转作和跳跃基因的概念,DNA,1967,年,Shapiro,才在,E.coli,中发现了转座因子,1951. Barbara McClintock 提出转作和,微生物基因组学课件,2.,定向测序法,是指特定地从目的片段的某一端开始测序，直至把靶片段测完。定向测序法包括引物测序法和定向缺失测序法。,引物测序法,即在第一次测序结果的基础上，设计新的寡核苷酸，来充当下一次测序反应的引物，并依次类推，从而循序渐进获得靶,DNA,的全部序列。,2.定向测序法,定向缺失法,定向缺失法是将一个靶,DNA,变成若干套嵌套的缺失突变体，使靶序列中远不可测的区段逐渐落入可用通用引物进行测序的方法。,定向缺失法,微生物基因组学课件,作图法测序与序列组装,作图法测序与序列组装,两种大规模基因组测序策略的比较,两种大规模基因组测序策略的比较,24,目前常用的人造染色体载体,细菌人工染色体载体（,BAC,）,酵母人工染色体载体（,YAC,）,黏粒载体（,cosmid,）,P1,人工染色体载体（,PAC,）,24目前常用的人造染色体载体细菌人工染色体载体（BAC）酵母,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Ap,r,TRP1,ARS1,YAC,载体的复制元件和标志基因,YAC,载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列,酵母染色体的复制子,酵母染色体的着丝粒序列,酵母系统的选择标记,大肠杆菌的复制子标记,YAC,载体的装载量为,250 - 400 kb,pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELo,酵母人工染色体（,Yeast artificial chromosomes,简称,YAC,），是一种能够克隆长达,400Kb,的,DNA,片段的载体，含有酵母细胞中必需的端粒、着丝点和复制起始序列。,酵母人工染色体（Yeast artificial chrom,细菌人工染色体（,Bacterial artificial chromosome,，,BAC,）是指一种以,F,质粒（,F-plasmid,）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆,150kb,左右大小的,DNA,片段，最多可保存,300kb,个碱基对。,细菌人工染色体（Bacterial artificial c,（四）影响测序的因素,不管采用随机测序还是定向测序都可碰到下列影响因素。,1.,计算机的设备 。,2.,靶,DNA,的性质。,3.,完成测序所需的时间 。,4.,采用测序策略。,（四）影响测序的因素,三微生物基因组的注释,（一）概念：在微生物基因测序的基础上，对其基本结构和部件进行认定，以进一步研究其功能。,三微生物基因组的注释,（二）微生物基因组注释的内容,1.,碱基组成分析，即,G+C Mol%,测定。,G+C,含量是物种的一个重要特征，在微生物的分类上具有重要意义，是重要参数之一。,2,开放阅读框的鉴定：,3,编码序列分析,（二）微生物基因组注释的内容,4.tRNA,基因检索：根据特异的三叶草结构来鉴定，可采用专门的分析软件。,5.rRNA,基因检索：利用现有已知,16srRNA,序列来鉴定基因组含的,rRNA,基因。,6.,特殊序列检索,7.,复制原点鉴定,（,1,）鉴定目的 复制原点即微生物基因组,1,号碱基的位置。,（,2,）鉴定原理 复制原点有其特殊的结构。如,E.coli,的复制原点为为一段,245,个,bp,的序列，其中包含有四个核苷酸的,9,聚体,“,TTATCCACT,”,。,（,3,）鉴定方法 可采用特殊的分析软件。,4.tRNA基因检索：根据特异的三叶草结构来鉴定，可采用专门,微生物基因组学课件,8.,同源性基因检索,（,1,）目的 对每一未知基因均进行同源性搜索以确定其基因的初步特性。,（,2,）搜索原理 根据其结构、排列的同源性。,（,3,）搜索方法 采用美国的,BLAST,软件。,8.同源性基因检索,四微生物的基因组图谱,微生物的基因组图谱主要包括两种，即遗传图谱和物理图谱。,(,一,),遗传图谱,1.,概念 是通过突变表型鉴定出来的其基因组上的一系列基因图，包括各个基因在基因组中的排列顺序和精确定位。,四微生物的基因组图谱,2.,建立基因遗传图谱的方法,(1),中断杂交法 即将两个菌株共同培养,并每隔一段时间中断培养,以鉴定其基因型,并以鉴定某些基因的转化顺序和位置。,(2),噬菌体转导试验,PI,噬菌体是普遍性转导噬菌体。它可在供体菌的,DNA,断裂时，误将,DNA,片段包装于自身而带入受体菌的基因组中，并形成稳定的转导子。也可将紧密联锁的几个基因也转导过去（此为共转导）。,2.建立基因遗传图谱的方法,（二）物理图谱,1,物理图谱的概念：是在,DNA,分子上指出限制性内切酶的限制性位点、数目及其限制性片段大小与排列顺序的图谱，又叫限制性图谱。,2,构建微生物基因物理图谱的意义,（,1,）用于基因克隆；,（,2,）用于序列分析；,（,3,）用于,southern,杂交和,RFLP,多态性分析。,3,构建物理图谱的方法,（,1,）限制性内切酶部分消化法 （,2,）双酶消化法 （,3,）内外切酶混合消化 （,4,）分子杂交 （,5,）,Southern,十字杂交法,（二）物理图谱,五、微生物基因组功能分析,1,、根据目的基因组的性状而推测可能的基因组功能。,如致病岛的,G+C mol%,与细菌本身的,G+C mol%,有很大差异。致病岛或耐药岛等。,2,、根据已知的数据库进行同源性搜索。,美国,NIH,的,GenBank,；欧洲的分子生物学实验数据库（,FMBL,）日本的,DNA,数据库,(DDBJ),3,、利用不同条件、不同作用因素的影响而鉴定未知基因的功能。,如用过氧化氢酶处理沙门氏菌而获得该菌的对,H,2,O,2,氧化应激反应的基因。,4,、采用基因敲除的方法来推测或确定基因的功能。,五、微生物基因组功能分析,六、研究基因组功能的意义,1, 加速致病基因的研究,2, 寻找灵敏而特异性的病原分子标记,病原微生物的特异性,DNA,序列可以作为分子标记用于疾病的诊断。,3, 促进新药的发现和疫苗的发展,（,1,）促进新药的发现 （,2,）疫苗的研究,4, 促进微生物分类的发展,六、研究基因组功能的意义,5.,提高对人类相关基因功能的认识,（,1,）一些人类的遗传性疾病，如结肠癌、肝豆状核变性、肾上腺脑白质营养不良等，在细菌的基因组分析中，也存在类似的蛋白物。,（,2,）可以利用微生物做模拟，去检测高等生物的基因性状和功能。,（,3,）从基因水平去揭发人类疾病与病原微生物之间关系，如发病机理，人类与病原微生物之间相互作用的基因机理等。,5. 提高对人类相关基因功能的认识,七、微生物基因组功能学研究现状,（一）微生物基因组序列测定,1.,病毒的基因组序列测定,2.,原核细胞微生物的序列测定,1994,年美国发起微生物基因组计划，实质上就是以细菌基因组计划为开始的生物工程（不包括病毒）。,3.,真核细胞微生物的序列测定,1996,年第一个完成酿酒酵母的测序，至目前为止，已有数种真菌测序完毕，尚有,246,中正在测序之中。,七、微生物基因组功能学研究现状,（二）微生物基因组测序碱基数,1.,病毒基因碱基数：最小的病毒，如乙肝病毒，只有,3kb,碱基数，而最大的痘病毒则有,300kb,碱基数。,2.,细菌基因组的碱基数：细菌基因组的碱基数同样差异很大，小至支原体为,50,万,bp,，大至黄色粘球菌为,900,万,bp,。,3.,真菌的碱基数：目前测定的微孢子虫为,300,万,bp,。,4,人类的碱基数为,31.647,亿,bp,。,（二）微生物基因组测序碱基数,（三）微生物的基因组数,1.,病毒的基因组数 由数个至数百个。,2.,细菌的基因组数 由数百个至数千个。如百脉根中间根瘤菌为,8000,个基因组。,3.,真菌的基因组数 基本上同细菌。如酿酒酵母为,6000,个。,附：人类基因组数为,2-2.5,万个，线虫,2,万个，果蝇,1-1.5,万个。,（三）微生物的基因组数,人类基因组计划,HGP(Human Genome Projects),凯克,加州大学,人类基因组计划 HGP(Human Genome Proje,2000,年,6,月,26,人类基因组工作草图绘制成功。,2000,年,3,月 果蝇。,12,月拟南芥基因组的完整图谱。,2001,年,: HGP,和美国塞莱拉公司将各自测定的人类基因组工作框架图分别发表在,Nature,和,Science,上。,2002,年，,12,月,Nature,小鼠的基因组。,在人类基因组计划中，包括对五种生物基因组的研究：大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和小鼠，称之为人类的五种“模式生物”。,2000年6月26 人类基因组工作草图绘制成功。,微生物基因组学课件,2000,4,以杨焕明 在,Science,水稻全基因组框架序列图。,基因总数：约为人类的,2,倍；其中,10000,个基因的功能已确定；水稻的,“,垃圾,”,序列多位于基因外，人类的,“,垃圾,”,序列多位于基因内；水稻的基因平均,4500bp,人类基因平均,72000bp,。,拟南芥约有,25000,个基因，,80%,在水稻中都存在，二者之间有关信号传导的基因差别最大。,2000,4 以杨焕明 在Science 水稻全基因组框架序,微生物基因组学课件,微生物基因组学课件,中国家蚕基因组计划项目主持人、中国工程院院士向仲怀,中国家蚕基因组计划主要攻关专家，西南农业大学教授夏庆友正在做测试。,2003,年人类表观基因组计划,(Human Epigenome Project ),于,10,月,7,日正式启动。这是世界上首项针对控制人类基因,“,开,”,和,“,关,”,的主要化学变化进行的图谱绘制工作，它将帮助科学家建立人类遗传与疾病之间的关键联系。,2004,年,10,月国际人类基因组计划合作组织在,Nature,发了杂志上宣布误差小于,10,万分之一的人类基因组完成图已成功绘就。已将原来,15,万个,“,缺隙,”,减少到,341,个。完成图显示人类基因组只含有,2,2.5,万个基因。,2005,年,8,月,在（,Nature,）杂志发表了,水稻基因组“精细图”,，覆盖率达,95.3,，中国对国际水稻基因组计划的贡献率达,20,，共定位了,37,500,个基因，还率先完成了对着丝粒的测序 。,2005,年,9,月,1,日出版的, Nature ,和,9,月,2,日出版的, Science ,杂志，黑猩猩和人类基因组的序列相似性达到,99,；即使考虑到序列插入或删除，两者的相似性也有,96, 。封面文章。,2014,年,10,月,28,日,迄今最古老人类基因组测序完成，来源：,中国科学报,线粒体,2003年人类表观基因组计划(Human Epigenome,（四）微生物基因组的结构和功能的一些特点,1.,病毒基因组的结构和功能特点,（,1,）病毒小，结构简单，与细菌和真核细胞生物相比，其基因组很小，各种病毒间也差异很大，约相差,1,2,个数量级。,（,2,）病毒的基因组,（,3,）多数,RNA,病毒的基因组是连续的，也有一部分,RNA,病毒的基因组是不连续的,（四）微生物基因组的结构和功能的一些特点,（,4,）基因组重叠现象,病毒基因组重叠现象是,Sanger 1977,年研究,E.coli,的噬菌体,174,时发现的。该噬菌体是单链,DNA,分子，有,5375,个核苷酸，可编码,11,种蛋白质，总分子量为,25,万左右，相当于,6078,个核苷酸的编码产物。,病毒基因组重叠现象可以有两种情况：完全重叠 部分重叠,（,5,）病毒的大部分基因编码蛋白质，只有一少部分基因不编码蛋白质，这种不编码蛋白质的基因一般少于,5,。,如,174,噬菌体的不编码的核苷酸为,217,，占总基因数的,4.04,，（,217/5375,），这些不编码的基因多数为基因表达的调控基因。,人类的不编码蛋白的基因为,98,，只有,2,是编码蛋白的基因。,（4）基因组重叠现象,莲人在绿杨津,采 一,玉漱声歌新阙,采莲人在绿杨津，在绿杨津一阙新；,一阙新歌声漱玉,，,歌声漱玉采莲人,。,莲人在绿杨津,微生物基因组学课件,（,6,）在病毒的基因中，功能相当的蛋白质基因或,rRNA,基因往往聚集在基因组的一个或几个特定的部位，形成一个功能单元或转录单元。它们可以一起转录成含有多个,mRNA,的多顺反子，再剪接成单顺反子，再翻译成蛋白质，如腺病毒等。,（,7,）除反转录病毒外，其他病毒均为单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次。反转录病毒基因组则有,2,个拷贝。,（,8,）噬菌体的基因是连续的，而真核细胞的病毒的基因组鲜有内含子。除正链,RNA,病毒外，真核细胞病毒都是转录成,mRNA,前体，再剪切加工，去掉内含子，形成成熟的,mRNA,。,（,9,）病毒适应性基因的丢失,（6）在病毒的基因中，功能相当的蛋白质基因或rRNA基因往往,2.,细菌基因组结构和功能的一些特点,（,1,）细菌的染色体数目 以前认为细菌的染色体数只有一条，经基因组研究后，确定了细菌的染色体数是,1,条以上。,2,细菌基因组的结构是连续的，无内含子，因而转录后不需要剪切就可形成成熟的,mRNA,转录起始前，有,3-10,个,bp,的,SD,序列（即与,tRNA,结合序列）。,2. 细菌基因组结构和功能的一些特点,微生物基因组学课件,3,具有操纵子结构，其中的结构基因为多顺反子。,4,在多数情况下，结构基因在细菌染色体基因组中都是单拷贝的，但编码,rRNA,的基因则是多拷贝的,5,有编码同功酶的同基因（,isogene,）。,6,细菌的基因组不出现基因重叠现象。,7,在,DNA,分子上，具有各种功能的识别区，如复制起始区,(oric),。复制终止区,(Terc),，转录起始区和终止区等。这些区域往往具有特殊的序列，并含有反向重复序列。,8,在基因或操纵子的终末，往往具有特殊的终止序列，它可使转录终止，并使,RNA,聚合酶从,DNA,链上脱落。,3具有操纵子结构，其中的结构基因为多顺反子。,9,毒立岛在细菌中普遍存在。,毒力岛的概念,是指编码细菌毒力基因簇的分子量较大的染色体或质粒,DNA,片段。此概念是,1990,年由,Hacker,等在研究泌尿系统致病性,E,coli,编码毒力的两个相关基因而提出的。毒力岛又叫致病岛或毒力块、毒力盒（,virulence blocks or virulence cassettes,）等,10,细菌基因的单向转移在细菌之间，甚至在古细菌和真细菌之间出现有大量的基因转移。,9毒立岛在细菌中普遍存在。,11,在细菌基因中发现大量的未知基因，在已测序的细菌中，发现约有四分之一的基因为未知基因，有待于确定。,12,适应性基因的缺失,（,13,）细菌,DNA,中,CpG,结构,(,许多基因，尤其是管家基因的启动子区，基因的末端通常存在一些富含双核苷酸“,CG”,的区域，称为“,CpG,岛”（,CpG island,）。,),CpG,结构是细菌,DNA,中胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸结构。是,DNA,刺激机体产生较强免疫应答的结构，是抗核酸免疫的主要抗原。,14,）一批新的功能基因被揭晓,11在细菌基因中发现大量的未知基因，在已测序的细菌中，发,