实验10-病毒血凝和血凝抑制试验--课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ppt课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ppt课件,*,实验九,质粒电泳,病毒的血凝和血凝抑制,1,ppt课件,实验九质粒电泳病毒的血凝和血凝抑制1ppt课件,原理,与蛋白质分子类似，核酸 也是两性解离分子。在,pH3.5,时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带正电荷，在电场中向负极泳动；,在,pH,值为,8.08.3,时，,碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。,用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的,。,2,ppt课件,原理与蛋白质分子类似，核酸 也是两性解离分子。在pH3.5时,载样缓冲液,其中含有的甘油可以使待电泳样品沉在点样孔底部，避免样品漂浮,其中含有的溴酚蓝（某些还含有二甲苯青）可以作为电泳速度度的指示分子，溴酚蓝的迁移位置大约相当于,200 bp,左右的线性,DNA,分子的迁移位置。,3,ppt课件,载样缓冲液其中含有的甘油可以使待电泳样品沉在点样孔底部，避免,溴化乙锭,溴化乙锭含有一个可以嵌入,DNA,堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与,DNA,的结合无特异性。当染料分子插入后，导致与,DNA,结合的染料呈现荧光，,DNA,吸收,254nm,处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收,302nm,和,366nm,的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的,590nm,处发射出来。,溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（,DNA,或,RNA,）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。,有一些低毒产品替代：,sybr green、sybr gold,、,gene finder,4,ppt课件,溴化乙锭溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环,电泳准备,用透明胶封固玻璃板两头，在板一端放置电泳梳子。,用,1,TAE,buffer,配制琼脂糖凝胶,(0.24g Agaros/32ml 1TAE,buffer),，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。待溶液冷却至,60,，加入适量,Goldview(,或溴化乙锭,),至微红，混匀。,将温热的,琼脂糖凝胶,倒入胶模中，凝胶厚度在,5-7mm,之间。,在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有,1TAE,buffer,的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使缓冲液没过胶面。,5,ppt课件,电泳准备用透明胶封固玻璃板两头，在板一端放置电泳梳子。5pp,DNA,电泳,取,9l,的,DNA,样品与,1l,的,10*,样品缓冲液（甘油，溴酚蓝，,DNA,稳定剂）,混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品孔中。,盖上电泳槽并通电，使,DNA,向阳极移动。,当,溴酚蓝,在凝胶中移出适当距离（根据,DNA,的大小、,1kb,和,3kb,左右的指示剂来判断）后，切断电源，取出玻璃板，在紫外灯下观察，并拍照记录结果，估测质粒分子量的大小。,6,ppt课件,DNA电泳6ppt课件,7,ppt课件,7ppt课件,质粒,DNA,3,条带不是超螺旋、线性和开环这三条带。,碱法抽提得到质粒样品中不含线性,DNA,，其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。,8,ppt课件,质粒DNA3条带不是超螺旋、线性和开环这三条带。8ppt课件,9,ppt课件,9ppt课件,一 实验目的,1:,学会通过鸡胚接种增殖的病毒的收集,2:,掌握病毒血凝和血凝抑制试验的基本原理和基本操作,3,：理解病毒血凝和血凝抑制试验的应用,病毒的血凝和血凝抑制,10,ppt课件,一 实验目的病毒的血凝和血凝抑制10ppt课件,二 实验原理,1:,红细胞凝集,某些病毒（如流感病毒，新成疫病毒，麻疹病毒等）拥有血凝素糖蛋白，可与人或某些动物的红细胞表面的相应受体结合，从而呈现红细胞凝集现象。在此，病毒与红细胞是配体与受体的关系，而不是颗粒性抗原与相应抗体作用的凝集反应。,这种凝聚多种病毒都具有，不是完全特异的,11,ppt课件,二 实验原理11ppt课件,2:,红细胞凝集抑制,当病毒被相应抗体中和后，则丧失了凝集红细胞的功能，即病毒的红细胞凝集特性被抑制。,3:,利用已知抗体，可通过红细胞凝集抑制试验鉴定某些具红细胞凝集特性的病毒，同样也可利用已知病毒抗原，通过红细胞凝集抑制试验来测定抗体水平，从而评价疫苗的免疫效果，或动物是否受到病毒感染,血凝抑制试验是抗原抗体的特异性血清实验,12,ppt课件,2:红细胞凝集抑制12ppt课件,4,红细胞的解脱现象,某些具红细胞凝集特性的病毒还拥有神经氨酸酶活性，其可使病毒从红细胞上解脱下来，因此，血凝试验的时间太长，可能会在高浓度孔见到类似阴性的反应结果，实验过程中必须控制好时间。,13,ppt课件,4 红细胞的解脱现象13ppt课件,三 实验操作,(,一,),病毒的鸡胚接种与培养,(,二,),病毒尿囊液的收集,37,度培养,72,小时的鸡胚,-,放置于,4,度冰箱,致死鸡胚,-,消毒气室,-,用镊子打开气室,-,打开壳膜,-,用移液器或吸管收集尿囊液于,1.5,毫升离心管,-5000,转,离心,5,分钟,以去除细胞沉淀,-,上清液供血凝 和 血凝抑制试验作用,.,(,三,),制备,1%,浓度的鸡红细胞,采集新鲜的抗凝血,以生理盐水洗,3,次,每次离心,5,分钟,转速为,4000,转,最后用生理盐水配制成,1%,浓度,.,14,ppt课件,(,四,),红细胞凝集试验,1,、,50l,的生理盐水加入,96,孔微量板,A,、,B,行的,1-12,孔。,2,、,被检病毒液,50l,分别加入,A,、,B,行（一行为标准病毒，一行为自己收集的病毒）的第一孔，然后倍比稀释至第,11,孔，弃去,50l,，,12,孔为阴性对照。,3,、加,50l,的,1%,鸡红细胞,于每一孔，按病毒的低浓度至高浓度加入。,4,、混匀、室温静止,30min,。,5,、确定红细胞,100%,凝聚的病毒的最高稀释度，为,HA,滴度。,15,ppt课件,(四)红细胞凝集试验15ppt课件,6,、血凝效价（,HA,）的确定,将板直立，首先观察红细胞阴性对照，应呈逗点状。红细胞凝集孔呈颗粒状附于孔底。能凝集红细胞的最高稀释度即为血凝效价。,16,ppt课件,6、血凝效价（HA）的确定16ppt课件,(,五,),4,单位病毒液的配制,以出现红细胞凝集现象的最高稀释度为,1,个单位,将原病毒液稀释成,4,倍于最高稀释度的病毒液,即为,4,单位病毒液,.,例如,:,出现红细胞凝集现象的最高稀释度是,2,的,9,次方,(,病毒的血凝效价为,2,的,9,次方,),那么, 4,单位病毒液就为,2,的,7,次方,.,17,ppt课件,(五) 4单位病毒液的配制17ppt课件,(,六,),病毒的红细胞凝集抑制试验,1,、加生理盐水,50l,于,96,孔板的一排的,1-12,孔。,2,、加,标准血清,50l,于一排第一孔，倍比稀释到第,11,孔，弃,50l,。,3,、将,50l,病毒的,4,个血凝单位抗原加至,1,到第,11,孔。,4,、然后加,50l,的,1%,鸡红细胞至各孔，混匀，室温静置,30min,。,5,、观察结果，确定血清的,HI,效价。血凝被抑制的抗体最高稀释度即为血清抗体的血凝抑制效价（,HI,效价）。,18,ppt课件,(六)病毒的红细胞凝集抑制试验18ppt课件,实验报告,实验目的,实验原理,实验步骤,结果与分析,思考题,某一病毒能够引致血凝，是否可以判定它是何种病毒？如果不行，应该再要进行什么实验？为什么？,下次实验,血清学试验（凝聚试验和,ELISA)p163,171,19,ppt课件,实验报告实验目的19ppt课件,