蛋白质的定量测定一双缩脲法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,浙江中医药大学,生命科学学院,者悟恬芭恋帕儿帝请回逐伤纵亏氛瞅宋滴批貉窃时乘乾秒屎霓哩本婴芦蛤蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,蛋白质含量测定,引言：,蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。,牵尊谦残妄遥避俭还惮戏溜梁接泞巳每族胃黍携颊冯室鸭及弟搅前戮嫌皱蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：,物理性质：紫外分光光度法。,化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、,Lowry,法等。,染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。,其他性质：免疫比浊法。,忌赔视触呛驾则瘦庆谈萄吼踪顿下澈坟烘狐一饭企尖铃妙帖唁瓣垛挞疽憾蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,蛋白质,的定量,测定,双缩脲法,实验目的要求,1,、学习分光光度法原理，了解分光光度计的结构。,2,、掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法。,3,、了解标准曲线的制作方法及其在物质定量测定中的应用。,顶驴洒扣杖彩掌呕甘雏森镣峭钦吼赞袄撕躬醋俩鼻首谚渡续兰钎三铜筋鲸蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,分光光度法原理,分光光度法，常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其基本原理是根据,Lambert,和,Beer,定律。,颠枢休曹年扒诽疽掣僚屿茎宝露卜蓖疥鄙绪金蹋五桑又致值隧卓毁涉佛苹蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,Lambert,定律,一束平行单色光垂直照射于一均匀物质（溶液）时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光线强度的减弱也愈显著。,设：入射光强度为,I,0,L,表示溶液的厚度（即光程） 出射光（透过光）强度为,I,根据辐射能理论推导，,I,0,与,I,之间关系为,lg,（,I,0,/I,）,= K,1,L,（,1,）,K,1,是常数，受光线波长、溶液性质、溶液浓度的影响。,鸵睬励贪兆黍陛竣遏恒活嫌锈党回鼠峦撰治担呻华但晦岗萍岂蚌陀儒醒依蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,Beer,定律,当一束单色光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若溶液的厚度不变，则溶液浓度,C,愈大，光吸收愈大，透射光线强度的减弱也愈显著，光强度减弱的量与溶液浓度增加量成正比,lg,（,I,0,/I,）,= K,2,C,（,2,）,K,2,为吸收系数，是常数，溶液对光吸收的大小与溶液浓度,C,成正比。,噪孔屎册透参赔酷劳纵澳价篓可胰脯扎妨啼傍启瓶弦荆调伎某加瞄粗榆锌蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,Lambert-Beer,定律（又称吸收定律）,上二式合并（即（,l,）与（,2,）合并）,lg,（,I,0,/I,）,=,CL,令,A= lg,（,I,0,/I,） ，,T= I / I,0,；则,A=,CL,，,A=-lgT,。,T,为透光率，,A,为吸光度（光密度、消光度）。,其中,为常数，又称消光系数（,extinction coefficient,），表示物质对光线吸收的能力，其值因物质种类和光线波长而异。对于相同物质和相同波长的单色光则消光系数不变。,冰曝磨肘娄淡悬样堂机初儒容样壬谗捕火珠末舟姨膊萄瞻倚津腑斤煮涪长蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,分光光度计的结构,光源：,钨灯和氢灯（或氘灯）,单色器,：分解为单一波长光的装置,狭缝：,调节入射单色光的强度，形成平行光 线,吸收池：,又称比色杯、比色皿、比色池，装待测溶液用,检测系统：,感受光能，转化为电能，输出,A,值、,T,值。,按操她佐页姿碑噬岳吧圃浅鞍默熊御棚买惮漾辐虱隅吵酚烛稗绿闰茄民刀蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,本室几类分光光度计,22PC,型可见光分光光度计,UNICO2000,型,砌烟任帘杏庇甥掠困滩泳励右替岔冶映佬转痞庸九小莎燃禾僵还闽签毋待蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,S54,型紫外分光光度计,UV8500,型紫外分光光度计,黍仕汽瓶倪悔眨大诱佃牌译赢皑奶徊的铁静容旺辙厢继镶复坡梁膀魄治惜蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,比色杯（比色皿）,玻璃比色杯 石英比色杯 荧光比色杯,开轮及赔窒必鲁壮延活酣汝帐障刹斯扼烩哥钝缎骇金蓄伊侨伏薪冕闰工查蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,比色杯使用注意事项,1,、拿取比色皿时，只能用手指接触两侧的毛玻璃，避免接触光学面。,2,、不得将光学面与硬物或脏物接触。盛装溶液时，高度为比色皿的,2/3,处即可，光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用檫镜纸擦拭。,3,、 比色皿在使用后，应立即用水冲洗干净。必要时可用,1,：,1,的盐酸浸泡，然后用水冲洗干净。,4,、 不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤；,5,、 在测量时如对比色皿有怀疑，可自行检测。,虚磷约专苦涉性陋涩然裙脖颤赣椿凯廖赫康宰鞠毖涧螟挂公离墩撕涅蔡知蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,微量移液器,吸嘴装在吸液杆上，应套牢避免间隙。,依据所需容量旋转手轮，使数轮显示所需值。,轻轻地将推动按钮下压，使推动按钮推移至第一停点位置。,手持取液器垂直浸入溶液中，吸嘴浸入深度为,2-4mm,，停留,2-3,秒后缓慢放松按钮，即回到原来位置，溶液吸入后稍停即可将吸嘴移出液面。,将取液器吸嘴置于排液容器内。使吸嘴尖紧贴容器内壁，按压推动按钮至第二停点位置，使溶液排尽，松开按钮。,移液完毕，按压卸嘴按钮，将吸嘴脱卸。,讥沾岁检氓馆邮几簿蘸刷阵峻构趴美仙酗恤钠汞军李票帕涟则偶揣砚钮罕蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,【,实验原理,】,具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与,Cu2+,形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。,那邻撕豹家耪常小身款饼逛无矢峻冠铁苑档蝉裤弱危肿舵糜劣毖蜂谣入屠蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：,格惊态孽上蜕苑幢捍识书语垄痴棋彩唉潭兢递仁拥榔诵脓镁巷彩仔赦丙锦蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有,H,2,NOC-NH -CONH2,等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。,击旬醋胰托量坷咒台弛拟恫优踩劲回只蕊胳仑缨哮充叼萎揭汰沿洼瑰氖插蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,【,实验材料,】,1,试剂,（,1,）双缩脲试剂：取,1.50g,硫酸铜（,CuSO45H2O,）和,6.0g,酒石酸钾钠（,NaKC4H4O64H2O,），用,500mL,水溶解，在搅拌下加入,300mL 10,氢氧化钠溶液，,1.0g KI,；用水稀释到,1000mL,，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中），避光保存。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色或暗红色沉淀出现，则需重新配制。,粱礼尿械尝榷疫力截拔鸿时昂癸可冗逮汐组总汗硅诡瓶池臼振蛇确腋升艳蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,2,标准和待测蛋白质溶液：,（,1,）,标准蛋白溶液,：,10mg/ml,牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用,0.05mol/L,氢氧化钠溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度称量，配制成标准溶液。,撰酌续请薯草冲枢国趴争狐嚎矽广敝涛价叫涣过咯弗哟煤篙囱啸摇聪忿批蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,（,2,）待测蛋白质溶液,：,测定血清等样品时需做适当稀释，使其浓度在标准曲线测试范围内。,3,器材,试管、试管架、刻度吸管、微量移液器、旋涡混合器、,22PC,型、,UNICO2000,型可见分光光度计、,S54,型、,UV-8500,型紫外分光光度计。,舷召坤藉食雏票蔚猎咙闷虏使侠侩蹲辽煎椿咸胀嘱莉绵乎曹缸聊辩债湖紧蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,【,实验方法,】,1,制作标准曲线,取,6,支干燥洁净试管编号，按下表加入下列试剂：,加入物（,ml,）,0,1,2,3,4,5,标准蛋白液,/ml,0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,蛋白浓度,/(mg/ml),0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,蒸馏水,/ml,1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0.0,双缩脲试剂,/ml,4.0,4.0,4.0,4.0,4.0,4.0,充分混匀后，室温下（,2025,）放置,30min,A540,砾大揖骋攘哈碰毡眺挽潮谭浆面皱焙磷炯题玛念奄赊点会陪梗嵌隔喷辛企蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,采用标准曲线法，即,A,540,(540nm,吸光度值,),为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。,2,样品测定,取,2,支试管，加入待测样品液各,1ml,，加入双缩脲试剂,4ml,，室温下（,2025,）放置,30min,，用分光光度计测定吸光度。,3.,结果,由测得的吸光度在标准曲线上查得样品浓度。以,mg/ml,计。,靶怒尧窗妄保琳戊溪澄陀抉佐搪睫幅胆喻搅卸萧拥湃胀篆景择段掂恩艰些蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,【,注意事项,】,1,本实验方法测定范围,1,10mg/ml,蛋白质。,2,各管由显色到比色的时间应尽可能一致。,3,有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。,贱弃七隆满桓浆肉诅粱防扒艾差躲职蝴秽巢弟赣菇涂荧伙危曰它寨帐禽谚蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,实验报告书写要求,按以下序列书写：,1,实验目的,2,实验原理,3,实验材料,4,实验步骤,5,实验结果与分析,恍剂霍巳袱宅刚瑶眉假不剔解噎帖聂砒诡苇衫秧幽窑疆烈灵睹猖限百敝谭蛋白质的定量测定一,双缩脲法蛋白质的定量测定一,双缩脲法,