氨基酸与蛋白质的一级结构课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,1,氨基酸与蛋白质的一级结构,1,、氨基酸,2,、肽、肽键与肽链,3,、蛋白质的分离与鉴定,4,、蛋白质一级结构测定,1氨基酸与蛋白质的一级结构1、氨基酸,2,除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。各种氨基酸的区别在于侧链,R,基的不同。从蛋白质中分离出来的所有氨基酸（除甘氨酸外）都是,L-,型的。,-,氨基酸,可变部分,不变部分,氨基酸的种类与结构,2除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。各种氨基酸的区,3,20,种基本氨基酸按侧链极性可分为,3,类：非极性氨基酸、极性但不带电荷的氨基酸、带电荷的氨基酸。,按组成也可分为,3,类：脂肪族氨基酸（,15,）、芳香族氨基酸（,3,）、杂环族氨基酸（,2,）。,氨基酸的种类与结构,320种基本氨基酸按侧链极性可分为3类：非极性氨基酸、极性但,4,氨基酸按,R,基极性分类,非极性氨基酸,:,Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe,Trp, Met,R,基具极性不带电荷的氨基酸,:Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln,R,基带正电荷的氨基酸,:Lys, Arg, His,R,基带负电荷的氨基酸,:Asp, Glu,4氨基酸按R基极性分类 非极性氨基酸:Gly, Ala, V,5,甘氨酸,Gly G,5 甘氨酸 Gly G,6,丙氨酸,Ala A,6,7,缬氨酸,Val V,7 缬氨酸 Val V,8,亮氨酸,Leu L,8 亮氨酸 Leu,9,异亮氨酸,Ile I,9 异亮氨酸 Ile I,10,甲硫氨酸,Met M,10 甲硫氨酸 Met M,11,半胱氨酸,Cys C,11 半胱氨酸 Cys C,12,精氨酸,Arg R,12精氨酸 Arg R,13,赖氨酸,Lys K,13 赖氨酸 Lys,14,天冬氨酸,Asp D,14 天冬氨酸 Asp,15,谷氨酸,Glu E,15 谷氨酸 Glu,16,丝氨酸,Ser S,16 丝氨酸 Ser S,17,苏氨酸,Thr T,17 苏氨酸 Thr,18,天冬酰胺,Asn N,18 天冬酰胺 Asn N,19,谷氨酰胺,Gln Q,19 谷氨酰胺 Gln,20,脯氨酸,Pro P,20 脯氨酸 Pro P,21,组氨酸,His H,21 组氨酸 His,22,苯丙氨酸,Phe F,22 苯丙氨酸 Phe,23,酪氨酸,Tyr Y,23 酪氨酸 Tyr,24,色氨酸,Trp W,24 色氨酸 Trp,25,氨基酸的酸碱性质,两性电离性质：,根据,L-,氨基酸可电离基团的,pK,值，氨基酸在生理,pH,下并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化形式存在，羧基是以离解状态存在。,25氨基酸的酸碱性质两性电离性质：根据L-氨基酸可电离基团的,26,氨基酸的两性电离性质,在不同的,pH,条件下，氨基酸的电离状态 会随之发生变化。,pH,强酸性 中性 强碱性,净电荷,+1 0 -1,正离子 两性离子 负离子,等电点,PI,26氨基酸的两性电离性质pH 强酸性,27,氨基酸的等电点,：,当溶液浓度为某一,pH,值时，氨基酸分子中所含的,-NH,3,+,和,-COO,-,数目正好相等，净电荷为,0,。这一,pH,值即为氨基酸的等电点，简称,p,I,。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。,氨基酸的酸碱性质,27氨基酸的等电点：当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所,28,侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的,p,K,1,和,p,K,2,的算术平均值。,侧链含有可解离基团的氨基酸，其,p,I,值也决定于两性离子两边的,p,K,值的算术平均值。,无论氨基酸侧链是否解离，其,p,I,值均决定于净电荷为零的两性离子两边的,p,K,值的算术平均值。,28侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和p,29,氨基酸分离和分析,基于氨基酸的酸碱性质和极性大小进行分析分离。常用的分析分离方法有：,滤纸层析、薄层层析,分配柱层析,离子交换层析：阴,/,阳离子交换树脂,高效液相层析,电泳分离,29氨基酸分离和分析基于氨基酸的酸碱性质和极性大小进行分析分,30,氨基酸的电泳分离,电泳是指带电颗粒在电场中移动的现象。,氨基酸是两性电解质，在一定,pH,缓冲液的电场中，氨基酸混合物中各组分根据它们所带净电荷的种类和数量不同，以不同速度向不同方向泳动，从而得以分离。,30氨基酸的电泳分离电泳是指带电颗粒在电场中移动的现象。,31,氨基酸的电泳分离,带电颗粒在电场中的泳动速度（电泳迁移率）与分子的净电荷、半径、介质粘度及电压有关。,净电荷可用,pI-pH,来近似计算。,可作电泳固相支持物的有滤纸、淀粉、醋酸纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。,31氨基酸的电泳分离带电颗粒在电场中的泳动速度（电泳迁移率）,32,离子交换层析法分离氨基酸,离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成的不溶性高分子化合物。,阳离子交换树脂含有的酸性基团可解离出,Na,+,或,H,+,，当溶液中含有其它阳离子时，它们可以和,Na,+,或,H,+,发生交换而结合在树脂上；同样，阴离子交换树脂含有的碱性基团可解离出,OH,-,，溶液中的阴离子和,OH,-,发生交换而结合在树脂上。,32离子交换层析法分离氨基酸离子交换树脂是具有酸性或碱性基团,33,分离氨基酸混合物常使用阳离子交换树脂。,交换柱中的树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液上柱，由于各种氨基酸与树脂的亲和力不同，用洗脱液可将各种氨基酸以不同的速度洗脱下来。,在,pH3,左右, pI10, pI6,，,pI3,的氨基酸混合物的分离情况？,33分离氨基酸混合物常使用阳离子交换树脂。,34,氨基酸与树脂间的亲和力，主要决定于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水相互作用。,在,pH3,左右，氨基酸与阳离子交换树脂间的亲和力次序是碱性氨基酸,中性氨基酸,酸性氨基酸。则洗脱顺序是？,34氨基酸与树脂间的亲和力，主要决定于它们之间的静电吸引，其,35,氨基酸与氨基酸之间通过,-,氨基和,-,羧基之间失水形成的酰胺键共价的结合在一起，这样形成的化合物称为肽。,在蛋白质化学中，这种酰胺键称为肽键。,2,、肽、肽键与肽链,35氨基酸与氨基酸之间通过-氨基和-羧基之间失水形成的酰,36,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽，这样就形成了一条线性的链状分子,肽链。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,36由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为,37,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。,通常在多肽链的一端含有一个游离的,-,氨基，称为氨基端或,N-,端；在另一端含有一个游离的,-,羧基，称为羧基端或,C-,端。,氨基酸的顺序是从,N-,端的氨基酸残基开始，以,C-,端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：,Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,37在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为,生物活性肽。如谷胱甘肽,其重要生理功能有清除有害的氧化剂、作为植物体内的电子传递体等。此外，许多重要的激素如舒缓激肽、脑啡肽，某些抗菌素如短杆菌肽,S,也是重要的生物活性肽。,38,生物活性肽。如谷胱甘肽,其重要生理功能有清除有害的氧化剂、作,39,3,、蛋白质的分离与鉴定,研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。,(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；,(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。,(3),分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。,393、蛋白质的分离与鉴定研究蛋白质的结构、性质和功能，首先,40,前处理：,(1),破碎生物组织。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。,(2),根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。,粗分级分离,:,离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。,细分级分离：,可用层析法、电泳法等对蛋白质进行精制。,目标蛋白的鉴定。,40前处理：(1)破碎生物组织。常用的方法有研磨法、超声波法,41,蛋白质的溶解性质与盐析分离,盐溶：低盐浓度范围内，随着盐浓度增加，蛋白质分子表面的带电基团吸附盐离子，水合能力增强，蛋白质溶解度增大。,盐析：当盐浓度达到饱和或半饱和程度，中性盐大量结合溶液中的自由水分子，降低水的活度，同时与蛋白质竞争水分子，破坏蛋白质表面的水化层，使蛋白质的溶解度降低，容易发生沉淀。,41蛋白质的溶解性质与盐析分离盐溶：低盐浓度范围内，随着盐浓,42,盐析时，先将蛋白质混合液调至目标蛋白质的等电点附近，此时溶解度最小，可以达到最佳盐析效果。,常用的中性盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。,42盐析时，先将蛋白质混合液调至目标蛋白质的等电点附近，此时,43,离子交换柱层析法,此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。,阳离子交换树脂适合分离,pI,大于,7,的蛋白质，阴离子交换树脂最适合分离,pI,小于,7,的蛋白质。,若用阴离子交换树脂分离蛋白质，则带负电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带负电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不同浓度的阴离子洗脱液（如,NaCl,溶液进行梯度洗脱，通过,Cl,-,的离子交换作用）可以将带有不同负电荷的蛋白质进行分离。,43离子交换柱层析法此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，,44,44,45,凝胶过滤层析,此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。,45凝胶过滤层析此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由,46,46,47,亲和层析法,这是一种高效分离纯化蛋白质的方法。其原理是,不同的蛋白质分子,对于固定在载体上的,特殊配体,具有,不同的识别和结合能力,。,常用的配体有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。,47亲和层析法这是一种高效分离纯化蛋白质的方法。其原理是不同,48,选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配体，然后应用化学方法将该配体与载体共价连接。将这种连接有配体的载体装入层析柱中，当含有待纯化蛋白质的溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配体发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。,亲和层析法,48 选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配体，然后应,49,49,50,蛋白质电泳,在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质溶液的,pH,值不等于等电点时，蛋白质颗粒均带有不同的电荷。由于不同蛋白质的分子量不同，所带的电荷不同，因而在电场中移动的速度也不相同。,在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（,v,）取决于电场强度,(E),，所带的净电荷,(q),以及与介质的摩擦系数,(f),。,50蛋白质电泳在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的,51,SDS,（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约,1,2,比例结合。,这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的,SDS,而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且电荷密度也大体相同，因此，迁移速度,只与相对分子量有关，与电荷和分子形状无关,。,用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳法,51SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够,52,52,53,将两性电解质,(pH3-9,或其它范围的如,pH5-7),与丙烯酰胺和双丙烯酰胺混合后预电泳，建立均匀连续的,pH,梯度。,蛋白质样品后加样再电泳时会根据它自身的等电点分别向两极移动，最后在凝胶中相应于其等电点处聚焦。,等电聚焦与双向电泳,53将两性电解质(pH3-9,或其它范围的如pH5-7)与丙,54,54,55,55,56,4.,蛋白质一级结构的测定,蛋白质的一级结构包括组成蛋白质的多肽链数目，多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。,其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,564.蛋白质一级结构的测定蛋白质的一级结构包括组成蛋白质的,57,测序的一般策略,(1),测定蛋白质分子中多肽链的数目。,(2),多肽链的拆分。,当蛋白质分子中存在链间或链内的二硫键时，必需拆分二硫键，以获得伸展的肽链。,57测序的一般策略(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。,58,(3),多肽链完全水解进行氨基酸组成分析，,分析每条多肽链的氨基酸组成和各种氨基酸的摩尔数。,(,4,)多肽链断裂成多个肽段。采用两种或多种专一性水解方法将多肽样品断裂成两套或多套肽碎片，并将其分离开来，以获得单一的碎片。,(,5,)测定每个肽碎片的氨基酸序列。,58(3)多肽链完全水解进行氨基酸组成分析，分析每条多肽链的,59,(,6,)确定肽碎片在多肽链中的次序。,利用两套或多套肽碎片的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，推导出整条肽链完整的氨基酸顺序。,(,7,)确定二硫键和酰胺基的位置。,59(6)确定肽碎片在多肽链中的次序。,60,N-,末端分析,:,利用多肽链,N-,末端残基的游离,氨基能与某些化学试剂产生特有的化学反应来进行分析。,二硝基氟苯法（,DNFB,、,FDNB,，,Sanger,试剂）、丹磺酰氯法（,DNS,）,C-,末端分析,末端氨基酸残基的鉴定,60N-末端分析 :利用多肽链N-末端残基的游离 氨基能,61,Sanger,法：在碱性条件下，,2,4-,二硝基氟苯能够与肽链,N-,端的游离,-,氨基作用，生成二硝基苯衍生物（,DNP,）。,在酸性条件下水解，得到黄色,DNP-,氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的,DNP-,氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,丹磺酰氯（,DNS,）法：,在碱性条件下，丹磺酰氯可以与,N-,端氨基酸的游离,-,氨基作用，得到丹磺酰,-,氨基酸。,此法的优点是丹磺酰,-,氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到,1,10,-9,mol,。,61Sanger法：在碱性条件下， 2,4-二硝基氟苯能够与,62,过甲酸氧化法、巯基化合物还原法。,1.,几条多肽链借助非共价键连接在一起，可用,8mol/L,尿素或6,mol/L,盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,2.,几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在,8mol/L,尿素或6,mol/L,盐酸胍存在下，,用过量的,-,巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,二硫键的拆开,62过甲酸氧化法、巯基化合物还原法。二硫键的拆开,63,氨基酸组成分析,常用,6 mol/L,的盐酸在,105-110,条件下封闭水解,24,、,48,和,72,小时。,优点：不容易引起水解产物的消旋化。,缺点：,色氨酸,被完全破坏；,含有羟基的丝氨酸或苏氨酸等有一小部分被分解；,天门冬酰胺,和,谷氨酰胺,的酰胺基被水解。,色氨酸,在碱水解中不受破坏,63氨基酸组成分析常用6 mol/L的盐酸在105-110,64,胰凝乳蛋白酶或糜蛋白酶：,R1=,苯丙氨酸,Phe,、色氨酸,Trp,、酪氨酸,Tyr, R2,脯氨酸,Pro,（速度快）,肽链,水解位点,肽链的部分水解,64胰凝乳蛋白酶或糜蛋白酶：R1=苯丙氨酸Phe、色氨酸Tr,65,胰蛋白酶：,R1=,赖氨酸,Lys,和精氨酸,Arg,侧链，,R2,脯氨酸,Pro,（专一性高）。,CNBr,裂解：,Met,羧基形成的肽键,肽链,水解位点,65胰蛋白酶：R1=赖氨酸Lys 和精氨酸Arg 侧链，R2,66,肽碎片的氨基酸顺序分析,Edman,化学降解法：逐个降解,酶降解法：氨肽酶、羧肽酶,质谱法,根据核苷酸序列推定法,66肽碎片的氨基酸顺序分析 Edman化学降解法：逐个降解,67,Edman,（,苯异硫氰酸酯）法：在温和的碱性条件下，苯异硫氰酸酯与,肽链,N-,端的游离,-,氨基作用，生成,PTC-,多肽。,此法的特点是能够不断重复循环，将肽链,N-,端氨基酸残基逐一进行标记和解离。也可用于肽链,N-,末端分析。,67Edman （苯异硫氰酸酯）法：在温和的碱性条件下，苯异,68,例题,某肽经分析其,N-,末端和,C-,末端分别是,Ala,和,Lys,，用胰蛋白酶水解产生四个小肽，经,Edman,法测定，顺序分别为,Asp-Phe-Leu-Lys,Met-Phe-Ala-Lys,Ala-Arg,Arg;,用胰凝乳蛋白酶水解产生三个小肽，经,Edman,法测定顺序分别为,Ala-Lys-Asp-Phe,Ala-Arg-Arg-Met-Phe,Leu-Lys,。试推断该多肽的一级结构。,68例题某肽经分析其N-末端和C-末端分别是Ala和Lys，,