第八章免疫学检测方法课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,免疫学技术是利用抗原抗体特异性反应的原理建立的各种检测与分析技术，以及建立这些技术的各种制备方法。,第八章 免疫学检测方法,免疫学技术是利用抗原抗体特异性反应的原理建立的各种检测与分析,1,第八章免疫学检测方法课件,2,第八章免疫学检测方法课件,3,检测技术种类,一、,免疫学检测,免疫凝集试验,免疫沉淀试验,酶联免疫试验,荧光免疫技术,免疫电镜技术,免疫印迹试验,检测技术种类 一、免疫学检测,4,第八章免疫学检测方法课件,5,细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应中，将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素,。,凝集法测定哈维氏弧菌抗体的效价,管号,1,2,3,4,5,6,7,磷酸盐缓冲液,0.9,0.9,0.9,0.9,0.9,0.9,1.0,兔抗,X,菌血清,0.1,0.1(1),0.1(2),0.1(3),0.1(4),0.1(5),0.0,1.,稀释抗体,2.,玻片凝集法,用,1ml,移液枪取,6,号离心管中的溶液一滴滴在载玻片的一端，另一端加一滴磷酸盐缓冲液，然后分别加一滴准备好的,X,菌液。,牙签混匀，至于显微镜下观察，看是否有凝集块的形成。,后取,5,、,4,1,号管的溶液逐个重复,1,、,2,步骤。,取有凝集块变为无凝集块时,那个有凝集反应的试管作为抗体的效价。,细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应中，将参与反,6,第八章免疫学检测方法课件,7,第八章免疫学检测方法课件,8,第八章免疫学检测方法课件,9,沉淀凝集反应,沉淀凝集反应,10,第八章免疫学检测方法课件,11,第八章免疫学检测方法课件,12,第八章免疫学检测方法课件,13,第八章免疫学检测方法课件,14,双向免疫扩散沉淀线示意图,双向免疫扩散沉淀线示意图,15,琼扩反应,琼扩反应,16,第八章免疫学检测方法课件,17,第八章免疫学检测方法课件,18,中和实验,中和实验,19,荧光免疫技术,荧光免疫技术又称荧光抗体技术。它将免疫化学和血清学的高度特异性和敏感性与显微技术的高度精确性相结合，为免疫学、临床组织化学及实验室诊断提供了一项其它方法尚不能取代的、并有其独特风格的技术。目前，该技术已广泛应用于细菌、病毒、原虫以及真菌等的鉴定和相应病的诊断，血清抗体的检查，病理组织学抗原、抗体和补体的鉴定及定位，免疫复合物病理的研究，细菌、病毒与细胞之间抗原关系的研究等方面。其主要优点在于：特异性强，速度快，敏感性高；其缺点在于：非特异性染色问题尚未解决，结果判定的客观性不足，技术程序也比较复杂。,荧光免疫技术 荧光免疫技术又称荧光抗体技术。它将免,20,1,、原理,荧光免疫技术是一种以荧光物质作为标记物的免疫分析技术，荧光物质的分子在特定条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态而极不稳定，其迅速回到基态时，以电磁辐射形式释放出所有的光能，发射出波长较照射光长的荧光。荧光免疫技术可分为荧光免疫组织化学技术和荧光测定技术。荧光抗体技术属于前者，它是利用某些荧光素通过化学方法与特异性抗体结合，形成的免疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此借助荧光显微镜检测或定位被检抗原。其又可分为直接荧光抗体法、间接荧光抗体法和补体荧光抗体法。,1、原理 荧光免疫技术是一种以荧光物质作为标记物,21,荧光色素,异硫氰酸荧光素（,FITC,）,四乙基罗丹明（,RB200,）,四甲基异硫氰酸罗丹明（,TMRITC),荧光色素异硫氰酸荧光素（FITC）,22,1,、荧光抗体染色方法 直接法 间接法,2,、荧光抗体技术的应用 在细菌学诊断中的应用 在病毒感染诊断中的应用 其它方面的应用,1、荧光抗体染色方法 直接法,23,间接荧光抗体法（,IFAT,）操作步骤如下：,（,1,）单层血细胞滴片，室温晾干，放入丙酮中固定,10min,。室温晾干。（,2,）以小白鼠抗血清（或杂交瘤细胞上清液）为第一抗体，加在血细胞抗原上。,37,湿盒中孵育,45min,。（,3,）,0.01M PBS,洗三次，每次,5min,。（,4,）加第二抗体,IgG-FITC,，,37,湿盒中孵育,45min,。（,5,）,0.01M PBS,洗三次，每次,5min,。（,6,）甘油封片，荧光镜下观察，拍照。,间接荧光抗体法（IFAT）操作步骤如下：（1）单层血细胞滴,24,间接免疫荧光法检测对虾白斑症病毒病,间接免疫荧光法检测对虾白斑症病毒病,25,间接免疫荧光法检测淋巴囊肿病毒,间接免疫荧光法检测淋巴囊肿病毒,26,第八章免疫学检测方法课件,27,第八章免疫学检测方法课件,28,第八章免疫学检测方法课件,29,直接,ELISA,直接ELISA,30,间接,ELISA,间接ELISA,31,间接酶联免疫吸附试验,操作步骤如下：,（,1,）分别以不同单抗为第一抗体，加在血细胞抗原上。,37,湿盒中孵育,60min,。,（,2,）,0.01M PBS,洗三次，每次,5min,。,（,3,）加,AP-IgG,为第二抗体，,37,湿盒中孵育,45min,。,（,4,）,0.01M PBS,洗三次，每次,5min,。,（,5,）加,NBT/BCIP,底物缓冲液发色,10min,，,（,6,）出现颜色加终止液终止反应。,（,7,）用酶标分析仪在,405nm,处测定各孔的吸光度，计算,P,N,（样品光吸收值与阴性对照的值），判定,ELISA,反应结果。大于,2.1,时可判断为阳性。以最大显色至阳性的显色孔,50%,反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价,。,间接酶联免疫吸附试验,32,第八章免疫学检测方法课件,33,图,DOT BLOT,方法筛选结果图。,图 DOT BLOT方法筛选结果图。,34,免疫组织化学方法定扇贝血细胞分布,免疫组织化学方法定扇贝血细胞分布,35,细胞免疫化学法检测病毒感染,细胞免疫化学法检测病毒感染,36,四、,Western blot,是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。,原理及步骤,样品,聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白,（,SDS-PAGE ),转移（印迹）于硝酸纤维素膜,加抗体检测某种特异性蛋白质,四、Western blot 是蛋白水平检测，研究基因表达与,37,West Blot,West Blot,38,图：淋巴囊肿病毒与抗血清的,Western blotting,结果,图：淋巴囊肿病毒与抗血清的Western blotting结,39,第八章免疫学检测方法课件,40,免疫电镜技术,免疫电镜技术（,immune electron microscopic technique,）是一种将免疫学技术与电子显微镜技术相结合的血清学方法，能使抗原在分子水平上进行定位。它实际上是将细胞水平的荧光抗体技术的基本原理应用于分子水平上。这一技术的发明使抗原和抗体的定位研究达到了亚细胞或分子水平。主要有以下几种技术。,铁蛋白抗体法,酶标记抗体法,重金属标记抗体法,免疫电镜技术免疫电镜技术（immune electron m,41,图 胶体金标记免疫电镜结果,(A) (D) bar = 200 nm; (B) (C) bar = 100 nm,图 胶体金标记免疫电镜结果(A) (D) bar = 20,42,胶体金免疫技术,胶体金是氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸等作用下的水溶液，具有高电子密度，并能与多种大分子发生物理吸附，因此，不但所有的大分子物质都可被金标记，而且标记后大分子物质活性不发生改变。,当抗原和金标抗体反应时，肉眼可见红色或粉红色斑条（点）,在显微镜下观察，抗原抗体结合处为黑褐色的颗粒。,胶体金免疫技术胶体金是氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸等作用下,43,斑点免疫金渗滤法（,DIGFA,）的应用,与研究进展,是,20,世纪八十年代发展起来的一种免疫学检,测方法，具有简便、快速、准确等优点。目前在,医学检验中主要应用于检测,HBsAg,、,HCG,和,HIV,等。,44,斑点免疫金渗滤法原理,：,NCM,为固相载体,-,通过渗滤,-,抗原与抗体在膜上快速反应,-,标记的胶体金堆积显色。,胶体金,抗体,抗原,NCM,吸水垫,胶体金抗体抗原NCM吸水垫,45,临床应用：,间接法测抗体：,NCM,抗原,-,样品抗体,-,金标抗抗体显色,夹心法测抗原,：,NCM,多抗,-,样品抗原,-,金标单抗显色。,临床应用：,46,直接法检测抗原,NCM,病毒,-,金标单抗显色,DIGFA,步骤简化、时间缩短。,47,DIGFA,检测操作程序,2l,检测样品,-NCM-,直径,2mm,点,-,晾干；,100l,封闭液，渗入；,100l,的金标抗体，渗入；,100l,的,0.01M PBS-T,（含,0.05%Tween-20,），渗入；,检测结果：,红色斑点的为阳性，无红色斑点的为阴性,。,阳性代表检测样品中有病毒，阴性则无。,DIGFA检测操作程序,48,DIGFA,检测结果,红色斑点的为病毒阳性,无红色斑点的为病毒阴性。,The result of DIGFA, red dot shows there is WSSV, otherwise, there is no WSSV.,DIGFA检测结果, 红色斑点的为病毒阳,49,免疫金标层析法的应用与研究进展,免疫金层析法快速诊断试纸条是,20,世纪,90,年代以来在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术,医学：,乙肝表面抗原、心肌肌钙蛋白,T,、,HCG,兽医：,猪瘟抗体,食品：,克伦特罗（瘦肉精）、氯霉素,其他：,饲料中的磺胺类药物残留物、转基因产品,免疫金标层析法的应用与研究进展 免疫金层析,50,检测试纸的原理是：采用夹心免疫层析原理，即由金标单抗同检测样品液中的抗原反应，形成由金标单抗,-,抗原复合物，当该复合物层析至硝酸纤维素膜上预先包被在检测线上的另一种单抗处时，此处的抗体会识别该复合物中抗原，反应的结果便形成了金标单抗,+,抗原,+,包被单抗的夹心结构，最终是金标单抗上的胶体金颗粒在此固定并累积出现肉眼可见的红色线，未反应的金标单抗则仍继续层析前行,当到达点预先包被在质控线羊抗鼠抗体处时，金标单抗被其结合住，从而在此处也出现由胶体金颗粒固定并累积而显现出肉眼可见的红色线，结果是：检测线显示红色表示样品阳性；检测线不显示红色，表示样品阴性。质控线显示红色，表示试纸有效；质控线处不显示红色，说明试纸失效，即或是金标单抗、或是羊抗鼠抗体失活，检测结果无效。,检测试纸的原理是：采用夹心免疫层析原理，即由金标单抗同检测样,51,该试纸条构成,:,载体板,7,；在该载体板,7,的两端部，分别设有加样端,4,吸水层和手持端,1,吸水层；在该载体板,7,中部段设有硝酸纤维膜的检测层,2,，在该检测层,2,与加样端,4,吸水层交界处，设有载有金标单抗,E,的玻璃纤维层块,3,，该层块,3,一端部分设置在加样端,4,吸水层之下，其另一端部分设置在检测层,2,之上；在与该层块,3,延续的检测层,2,上设有检测线,6,和质控线,5,，该检测线,6,和质控线,5,处分别包被有抗病毒单抗和羊抗鼠,IgG,。,该试纸条构成:载体板7；在该载体板7的两端部，分别设有加样端,52,用吖啶酯直接标记抗体,(,抗原,),，与待测标本中相应的抗原,(,抗体,),发生免疫反应后，形成固相包被抗体,-,待测抗原,-,吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（,H,2,O,2,）和,NaOH,使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。,由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。,直接化学发光免疫分析,用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原,53,发光,Y,Y,Y,磁微粒,被测抗原,+,抗体,+,带丫啶酯标记物抗体,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,冲洗后,-,夹心法,（,1,）,加入,H,2,O,2,（,pH10,）,直接化学发光的机理,发光YYY磁微粒被测抗原+抗体+带丫啶酯标记物抗体YYYYY,54,磁,微粒,模式图,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,特点,已结,合,的抗原和抗体,与未,结合部分,的,易,分离,磁微粒,技术,磁微粒模式图YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY,55,五、聚合酶链反应（,polymerase chain reaction,PCR,）,PCR,是模拟体内,DNA,复制条件，应用,DNA,聚合酶反应，特异性扩增某一,DNA,片段的技术。体外程序化的,DNA,合成技术。,Kary B. Mullis,五、聚合酶链反应（polymerase chain reac,56,第八章免疫学检测方法课件,57,PCR,PCR,58,ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC,TTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAA,Step3 : Extension,延伸,72C,CGTAGTAGCA,GCTGCTACGTAG,Taq Polymerase,Taq Polymerase,TAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC,GCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA,ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAG,59,原 理：,1),合成待扩增区域两端已知序列，与模板,DNA,互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；,2),反应体系：,DNA,模板，,dNTP,，,Taq DNA,聚合酶，,buffer,3),反应程序：,变性,( 9495,o,C),复性,延伸,( 3755,o,C) ( 7072,o,C ),72,o,C,延伸,10min,30-35cycles,DNA,扩增,100,万倍,原 理：1) 合成待扩增区域两端已知序列，与模板D,60,PCR,扩增,PCR扩增,61,PCR,特点及应用,：,优点：,（,1,）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速；,（,2,）微量的模板,DNA,即可扩增大量产物。,应用：,（,1,）基因组,DNA,分析；,（,2,）遗传物质的鉴定；,（,3,）遗传病的诊断。,缺点：,（,1,）需靶,DNA,序列的信息；,（,2,）产物短小，,DNA,复制不精确。,PCR特点及应用：,62,原位杂交技术,是一种能够从形态学上证明特异性的,DNA,和,RNA,存在于制备的个别细胞，组织部分，单细胞或染色体中的技术。,原理是含有互补序列（探针）的被标记的单链,DNA,或,RNA,片段在适当的条件下与细胞的,DNA,或,RNA,杂交形成稳定的杂交体。,原位杂交技术是一种能够从形态学上证明特异性的DNA和RNA存,63,间接标记：将半抗原（如生物素或地高辛）附着于探针上，然后用标记的结合蛋白（如亲和素）检测或者用特异性的抗体检测靶探针杂交体。,间接标记：将半抗原（如生物素或地高辛）附着于探针上，然后用标,64,冰冻切片,4,多聚甲醛固定,酸处理,蛋白酶,K,消化,后固定,预杂交,碱变性,加入变性探针，,38,杂交,12,16 h,漂洗,显色,中性红衬染,脱水，封片,原位杂交,冰冻切片4多聚甲醛固定酸处理蛋白酶K消化后固定预杂交碱变性,65,预杂交（,65,，,2 h,）,加入碱性磷酸酶标记的抗,DIG,抗体,样品变性,点样,固定,杂交过夜,洗膜,平衡膜,显色,观察结果,斑点杂交法（,Dot-Blot,）,预杂交（65，2 h ）加入碱性磷酸酶标记的抗DIG抗体,66,通过原位杂交技术检测感染,LCDV,牙鲆的囊肿细胞、肾、肠和鳃。阳性部位有蓝色沉积物（箭头所示），,bar = 50 m,。,通过原位杂交技术检测感染LCDV牙鲆的囊肿细胞、肾、肠和鳃。,67,