血流感染实验室诊断新进展-(医学)课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,血流感染实验室诊断新进展,北京协和医院检验科,王瑶,2013年4月13日,血流感染实验室诊断新进展北京协和医院检验科,1,内容,什么是血流感染？,血流感染流行病学特点,血培养流程优化,提高阳性率,分析培养结果,减少污染,分子生物学方法检测血流感染,基于PCR的技术,MALDI-TOF MS,PNA-FISH,内容什么是血流感染？,2,概念,感染炎症+病原体,全身炎症反应综合征（SIRS）,体温38C或90次/分,呼吸频率20次/分，或PaCO,2,1210,9,/L或10%,脓毒血症（sepsis）感染+SIRS，血培养可以阳性或阴性,重度脓毒血症（severe sepsis）sepsis+脏器功能障碍、组织灌注不良和低血压,感染性休克（septic shock）,概念感染炎症+病原体,3,概念,败血症（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的临床综合征，是一种严重的全身感染。病原菌主要是细菌，也可为真菌、分枝杆菌等。,菌血症（bacteremia）：细菌在血流中短暂出现的现象，一般无明显毒血症状，在国外文献中常与败血症通用。,血流感染（bloodstream infection, BSI）：败血症和菌血症目前统称为血流感染。,概念败血症（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所,4,血流感染,医院获得性血流感染,原发血流感染,实验室证实血流感染（Laboratory-confirmed Bloodstream Infection, LCBI）,临床血流感染（Clinical Sepsis）,继发血流感染：血培养分离出有意义微生物，而且此微生物与另一部位之院内感染有关。唯不包括血管或血管内导管装置所引起之血流感染。,社区获得性血流感染,血流感染医院获得性血流感染,5,实验室证实血流感染（LCBI）,标准一：从一次或多次血标本中培养出一种一致的,致病菌,，而且培养出的病原体与其它部位的感染无关。,标准二：病人至少具有下列症状和体征之一：发热（38 C ），寒颤或低血压，并致病符合下列之一：,1.从,两次或两次以上不同部位,抽血的标本中培养出,皮肤寄生菌,（如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌）。,2.至少一次从带血管内导管的病人血标本,中培养出,皮肤寄生菌群,（如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌），并且主管医生开始了适当的抗菌药物治疗。,3.血中抗原检测阳性,（如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌或B群链球菌）。与实验室阳性结果一致的症状和体征与其它部位的感染无关。,标准三：年龄38 C ），低温（37 C ），呼吸暂停、脉搏徐缓，并具有下列之一（同上3点略）,实验室证实血流感染（LCBI）标准一：从一次或多次血标本中培,6,临床血流感染（Clinical Sepsis）,具有下列二条件之一者：,具有非其它已知原因所引起的发烧、血压过低（收缩压90mmHg或收缩压低于平常超过40mmHg），少尿（每小时尿量低于30ml）等临床症状任何一项，且符合下列所有条件者：,未做血培养，或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者,其它部位无明显感染者,医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗,1岁以下婴儿 ，具有非其它书籍原因引起的发烧、体温过低、呼吸中止或心跳过缓等临床症状任何一项，且符合下列所有条件者：,未做血培养，或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者,其它部位无明显感染者,医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗,临床血流感染（Clinical Sepsis）具有下列二条件,7,BSI流行病学特点,BSI发病率逐年增加,凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、真菌血流感染发病率逐年上升，革兰阴性菌下降,耐药菌比例逐年增加,社区获得与医院获得血流感染病原谱存在差异,院内BSI患者病死率高,BSI流行病学特点BSI发病率逐年增加,8,美国脓毒血症流行病学,+600%,+300%,+300%,Martin et al, NEJM 2003;348:1546,美国脓毒血症流行病学+600%+300%+300%Marti,9,加拿大CANWORD监测2002-2009,Diag Microbiolo Infect Dis. 2011; 69: 307,加拿大CANWORD监测2002-2009Diag Micr,10,加拿大CANWORD监测2002-2009,Diag Microbiolo Infect Dis. 2011; 69: 307,加拿大CANWORD监测2002-2009Diag Micr,11,美国49医院BSI病原谱,CID. 2004, 39: 309-317,美国49医院BSI病原谱CID. 2004, 39: 309,12,PUMCH2012年834血培养分离株,PUMCH2012年834血培养分离株,13,PUMCH2012年144株BSI大肠埃希菌药敏结果,ESBL 60.2%,PUMCH2012年144株BSI大肠埃希菌药敏结果ESBL,14,PUMCH2012年67株BSI肺炎克雷伯菌药敏结果,ESBL 34.4%,PUMCH2012年67株BSI肺炎克雷伯菌药敏结果ESBL,15,PUMCH2012年61株BSI鲍曼不动杆菌药敏结果,PUMCH2012年61株BSI鲍曼不动杆菌药敏结果,16,PUMCH2012年76株BSI金黄色葡萄球菌药敏结果,PUMCH2012年76株BSI金黄色葡萄球菌药敏结果,17,PUMCH2012年46株BSI草绿色溶血链球菌药敏结果,PUMCH2012年46株BSI草绿色溶血链球菌药敏结果,18,2011CHIF-NET489株BSI酵母菌,2011CHIF-NET489株BSI酵母菌,19,2011CHIF-NET,念珠菌对氟康唑的敏感性,2011CHIF-NET念珠菌对氟康唑的敏感性,20,2011CHIF-NET,念珠菌对伏立康唑的,敏感性,2011CHIF-NET念珠菌对伏立康唑的,21,2011CHIF-NET,其他酵母菌对氟康唑的敏感性,2011CHIF-NET其他酵母菌对氟康唑的敏感性,22,2011CHIF-NET,其他酵母菌对伏立康唑的,敏感性,2011CHIF-NET其他酵母菌对伏立康唑的,23,采血量是影响血培养阳性率的独立相关因素,CLSI M47-A：每位患者采集23套血培养（4060ml）,Surviving Sepsis Campaign Guidelines (Worldwide)：抗菌药物治疗前至少采集2套血培养,英国NHS血培养标准：采集2套血培养,采血量是影响血培养阳性率的独立相关因素CLSI M47-A,24,采血量对血培养阳性率的影响,JCM 2007,采血量对血培养阳性率的影响JCM 2007,25,采血量对血培养阳性率的影响,J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047,采血量对血培养阳性率的影响J. Clin. Microbio,26,J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047,Routine Set Mayo Clinic:,2 BACTEC Aerobic Plus Bottles +,1 BACTEC Anaerobic Lytic Bottle,采血量和阳性率,非条件致病菌,27,J. Clin. Microbiol. 2011, 49(1,在多次血培养中,单次,培养下列细菌阳性,凝固酶阴性葡萄球菌,棒状杆菌,微球菌,丙酸杆菌,芽孢杆菌,如多次培养阳性，可能为条件致病菌，需结合临床分析,血培养污染菌,28,在多次血培养中单次培养下列细菌阳性血培养污染菌28,非条件致病菌,Mayo Clinic,(p0.001),为什么需氧,+,厌氧？,Pathogen No.,两种组合均能检测,不同的病原菌,J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047,29,非条件致病菌Mayo Clinic(p38C or 90/min; 呼吸 20/min; 白细胞12 or 10% 未成熟中性粒细胞,32%患者有1瓶以上CNS阳性，BSI68 %,，,污染12% (p 0.001),没有SIRS症状：BSI 5%,，,污染29% (p 30秒,1%,2%碘酊30秒,或,10%碘伏消毒60秒：,从穿刺点向外画圈消毒,直径3cm,70%酒精脱碘,一步法,葡萄糖酸洗必泰作用30 s,，或,70%异丙醇消毒后自然干燥,，但不适用于2个月以内的新生儿。,降低血培养污染率严格消毒血培养瓶消毒：70%酒精消毒血培,37,急诊血培养污染率与工作量相关,The University of Michigan Health System急诊,血培养大多数由采血员采集，其次为护士和医生,采血员:病人= 1:9，重症区护士:病人= 2:3，其它区域护士:病人=1:4,年病人量82521人，采集血培养者7586人,11.4%至少1瓶阳性，病原菌阳性率8.0%，污染率3.7%,多套培养患者阳性率7.4%，单套培养阳性率5.1%（p0.001），污染率无显著差别（2.2% vs. 2.6%）,Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online,急诊血培养污染率与工作量相关The University o,38,急诊小时工作量,Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online,急诊小时工作量Schuyler Halverson, et,39,繁忙时血培养污染率增加,OR=1.23,OR=0.93,Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online,繁忙时血培养污染率增加OR=1.23OR=0.93Schuy,40,抗菌药物治疗与血流感染死亡率,死亡率,Chest 115 (2): 1999,抗菌药物治疗与血流感染死亡率死亡率Chest 115 (2),41,血培养三级报告制度,血培养,阳性,终报告,革兰染色,传种培养,初步报告,(,直接药敏,),鉴定菌株,电话报告,鉴定标准药敏,42,血培养三级报告制度血培养终报告革兰染色传种培养初步报告 (直,血培养结果回报对治疗的影响,A = Appropriate Therapy(,正确治疗,),I = Inappropriate Therapy(,不正确治疗,),Clin Infec Dis 24:584-602, 1997,血培养结果回报对治疗的影响A = Appropriate,43,血流感染快速分子诊断,分子诊断不受抗菌药物使用的影响,血培养阳性后分子诊断,直接使用血标本进行分子诊断,快速,但不能提供药敏结果,血流感染快速分子诊断分子诊断不受抗菌药物使用的影响,44,血培养阳性瓶分子鉴定,Antigone Kotsaki, et al. Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209,血培养阳性瓶分子鉴定Antigone Kotsaki, et,45,阳性血培养基于PCR的检测,PCR特异性检测,病原特异性PCR,特定耐药基因检测：葡萄球菌,mecA, 肠球菌,van,细菌载量：肺炎链球菌自溶毒A基因,lytA,拷贝数,广谱检测：PCR扩增特定靶位,多态性分析,测序,后续基因检测,种特异性real-time PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis.2011, 24(2):137,阳性血培养基于PCR的检测PCR特异性检测Expert O,46,qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌,Target：,ecfX,gene,血培养系统：BacT/ALERT，87瓶FA、13瓶FN，涂片均显示G-b,对照方法：氧化酶，API 20E,DNA提取：0.5ml肉汤，离心后加裂解液，水煮法,定量PCR：,扩增：Oligonucleotide primers,基因特异性检测：fluorescent-labeled hybridization probes，152bp fragment,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,47,qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌Target：ecfX,qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌,33瓶pae，敏感性和特异性均为100%,1瓶kpn+pae，由于pae (20CFU/ml)kpn (10,8,CFU/ml)，PCR(-),检测限：将ATCC27853 ecfX基因克隆至TOP10,E.coli,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,48,qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌33瓶pae，敏感性和,阳性血培养基于PCR的检测,最常见病原体多重PCR,电泳谱、ELISA杂交、多重Real-time PCR,Hyplex BloodScreen (BAG, Lich, Germany): 多重PCR+ELISA, 4.5-6h完成,Prove-It Sepsis (Mobidiag, Helsinki, Finland)：多重real-time PCR+微阵列分析，检测多种病原及,mecA,，3h完成,多重Real-time PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209.,阳性血培养基于PCR的检测最常见病原体多重PCRExper,49,血培养阳性多重real-time PCR,NEW MICROBIOLOGICA,36, 65-74, 2013,血培养阳性多重real-time PCRNEW MICRO,50,血培养阳性多重real-time PCR,NEW MICROBIOLOGICA,36, 65-74, 2013,血培养阳性多重real-time PCRNEW MICRO,51,血培养阳性PNA FISH核酸荧光原位杂交,血培养阳性肉汤革兰染色PNA FISH,革兰阴性菌：,商品化试剂盒,eco/kpn/pae,Efa/,其它肠球,Sau/scn,Cal/cgl/,其它念珠菌,报道,Salmonella spp.,90min PNA FISH,完成,Appl Environ Microbiol. 2010 ;76:4476,J. Clin. Microbiol. 2013, 51(4):1301,J Clin Microbiol. 2009; 47: 247,52,血培养阳性PNA FISH核酸荧光原位杂交血培养阳性肉汤,MALDI-TOF MS,基质辅助激光解析电离（MALDI）,原理：将样品分散在基质分子中形成结晶后直接进样，当用激光照射结晶时，基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。,基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品带上正电荷或负电荷，成为带电荷的离子,基质会干扰被检测分子质谱峰的大小和浓度；不同类型的分析物选择不同的基质,MALDI-TOF MS基质辅助激光解析电离（MALDI）,53,MALDI-TOF MS,飞行时间（TOF）,原理：离子源产生的离子在加速电场获得动能，当进入高真空无电场飞行管道并在此管道内飞行时，质量较轻的离子飞行速度快，早到达检测器；质量较重的离子飞行速度慢，晚到达检测器。因此依据离子的飞行时间与其质荷比平方根（m/z）成正比的关系，通过测定飞行时间，计算出相应离子的分子量。,MALDI-TOF MS飞行时间（TOF）,54,MALDI-TOF MS操作步骤,MALDI-TOF MS操作步骤,55,MALDI-TOF MS快速鉴定阳性血培养,使用菌落、阳性血培养肉汤鉴定,快速：20分钟(从报警到鉴定出结果）,MALDI-TOF MS(Bruker)+BACTEC(BD):,正确鉴定：193/213阴性菌（包括厌氧菌）(90.61%)，284/319阳性菌(89.02%),80.9%复数菌正确鉴定出一种，7株缓症链球菌鉴定为spn,MALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMrieux):,388个阳性瓶，种正确率91%（包括念珠、厌氧菌）,15瓶复数菌：使用通用库多鉴定出一种，革兰染色后使用阴性或阳性库分析，6瓶鉴定出第二种菌,Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1631,J Clin Microbiol 2010; 48: 1542,56,MALDI-TOF MS快速鉴定阳性血培养使用菌落、阳性血培,MALDI-TOF MS,VITEK MS(bioMrieux),以16s为金标准，980株临床分离株，ID正确率,肠杆菌科97.7%,非发酵菌92%,葡萄球菌属94.3%,链球菌属84.8%,HACEK84%,酵母菌85.2%,J,Clin Microbiol. 2010; 48: 900,57,MALDI-TOF MSVITEK MS(bioMrieu,PCR/ESI MS,广谱PCRESI MS（电喷射质谱）,189阳性血培养和45阴性血培养，种一致率98.7%,6例spn标本方法阴性,提供定量结果评估病原体载量,假阴性率24%：几乎均由混合感染导致,5-6h完成检测,结合PCR的敏感性和ESI MS特异性,可以直接检测标本，不需要培养,Proc Natl Acad Sci. 2005;102:8012,PCR/ESI MS广谱PCRESI MS（电喷射质谱）P,58,血标本分子检测,种特异性、属特异性、广谱、多重PCR、微阵列分析,血培养阴性的苛养菌，如Bartonella spp.巴尔通体, Coxiella burnetii伯氏考克斯体, Mycoplasma spp.支原体, Chlamydia spp.衣原体, Ricketssia spp.立克次体，Tropheryma whipplei,血标本分子检测种特异性、属特异性、广谱、多重PCR、微阵列分,59,商品化分子生物学检测方法:血标本,SeptiFast,(Roche)：multiplex real-time PCR，种属特异性荧光探针，检测重要血流感染致病菌,SepsiTestTM,(Molzym)：eubacterial and panfungal real-time PCR， a 16S and 18S rRNA gene-based universal PCR+ sequencing，几乎可以鉴定所有细菌、真菌,VYOO,(SIRS Lab)：multiplex PCR，检测重要血流感染菌，电泳分离扩增片段,Plex-ID,(Abbott)：eubacterial and panfungal PCR+质谱，几乎可以鉴定所有细菌、真菌,Intensive Care Med. 2011 May, publish online.,60,商品化分子生物学检测方法:血标本SeptiFast(Roc,Septi,Fast,test检测的病原谱,BMJ Open 2012;2:e000392Intensive Care Med (2010) 36:4956,SeptiFast test检测的病原谱BMJ Open 2,61,Septi,Fast,test评估,Intensive Care Med (2010) 36:4956,SeptiFast test评估Intensive Care,62,Septi,Fast,与PCT、CRP相关性,Langenbecks Arch Surg (2012) 397:447455,SeptiFast与PCT、CRP相关性Langenbeck,63,VYOO,检测能力评估,PLoS ONE. 2012,7 : e38916,Sepsis,非感染,SIRS,血培养阳性,血培养阴性，其它标本培养阳性,Sepsis,所有培养阴性,VYOO检测能力评估PLoS ONE. 2012,7 :,64,VYOO,与微生物学一致性为46.2%,仍需改进,PLoS ONE. 2012,7 : e38916,VYOO与微生物学一致性为46.2%PLoS ONE. 2,65,3种商品化PCR检测系统比对,Med Klin Intensivmed Notfmed 2013,3种商品化PCR检测系统比对 Med Klin Intens,66,3种商品化PCR检测系统比对,Med Klin Intensivmed Notfmed 2013,3种商品化PCR检测系统比对 Med Klin Intens,67,分子生物检测血标本,几乎所有与血培养对照的研究，都显示更高的敏感性，但并非所有血培养阳性菌一定能检测出来,不可替代血培养！,相较于血培养，其高敏感性可以更早地开始抗菌治疗，或改变治疗方案,污染导致的假阳性无法排除！,评估血培养阴性的,PCR,阳性结果,分析其它微生物检查结果（如,BALF,，伤口拭子等）,免疫反应指标,Intensive Care Med. 2011 May, publish online.,68,分子生物检测血标本几乎所有与血培养对照的研究，都显示更高的敏,小结,BSI发病率逐年升高，尤其是革兰阳性菌和真菌,BSI病原菌耐药率持续升高,优化血培养流程，提高阳性率，降低污染率,结合临床分析血培养结果,分子生物学技术快速诊断BSI，MALDI-TOF MS、商品化多重PCR检测平台、PNA-FISH成为未来发展方向,血培养不可被分子方法取代！,小结BSI发病率逐年升高，尤其是革兰阳性菌和真菌,69,谢谢！,谢谢！,70,