细菌感染的病原学诊断课件

*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章 细菌感染的病原学诊断,褚云卓,8/27/2024,1,第三章 细菌感染的病原学诊断褚云卓9/3/20231,本章内容,第一节 标本的采集和处理原则,第二节 细菌的形态学检查,第三节 细菌的分离培养和鉴定,第四节,细菌的非培养检测方法,8/27/2024,2,本章内容第一节 标本的采集和处理原则9/3/20232,第一节 标本的采集和处理原则,一、标本采集的一般原则,1早期采集,2无菌采集,3根据目的菌的特性用不同的方法采集,4采集适量标本,5安全采集,8/27/2024,3,第一节 标本的采集和处理原则一、标本采集的一般原则9/3/,第一节 标本的采集和处理原则,二、标本的处理,1. 对环境敏感的细菌如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血杆菌等应保温并立即送检,2. 其他所有的标本采集后最好在2h之内送到实验室,3. 若不能及时送检，标本应置于一定环境中保存,4. 一般情况下，用于细菌培养的标本保存时间不应超过24h,8/27/2024,4,第一节 标本的采集和处理原则二、标本的处理9/3/2023,.病人标本中可能含有大量致病菌，必须注意安全防护,.标本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必须包装好，防止送检过程中倒翻或碰破流出,.对于烈性传染病标本运送时更要特别严格，必须按规定包装，由专人运送,.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器运送,8/27/2024,5,.病人标本中可能含有大量致病菌，必须注意安全防护9/3/2,第二节 细菌的形态学检查,1.包括不染色标本检查法和染色标本检查法,2.镜检可以了解有无细菌及大致的菌量,3.根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类,4.,通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义,8/27/2024,6,第二节 细菌的形态学检查1.包括不染色标本检查法和染色标本,第二节 细菌的形态学检查,一、不染色标本,1.细菌不经染色直接镜检，主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况,2.常用的方法有压滴法和悬滴法,有动力：可看到细菌自一处移至另一处，有明显,的方向性位移,无动力：细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无,位置的改变,8/27/2024,7,第二节 细菌的形态学检查一、不染色标本9/3/20237,第二节 细菌的形态学检查,3.有些病原菌通过不染色标本的动力检查可作出初步鉴定,如疑似霍乱患者，镜下观察到来回穿梭似流星状运动的细菌，,制动试验阳性，可初步推断为“疑似O1群霍乱弧菌”。,8/27/2024,8,第二节 细菌的形态学检查3.有些病原菌通过不染色标本的动力,第二节 细菌的形态学检查,二、染色标本,（一）常用染料,1碱性染料：碱性复红、结晶紫、美蓝等,2酸性染料：有伊红、刚果红等,3复合染料（中性染料）及荧光染料：复合染料有瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青）等；荧光染料有荧光标记的抗体,8/27/2024,9,第二节 细菌的形态学检查二、染色标本9/3/20239,第二节 细菌的形态学检查,（二）常用的染色方法,1革兰染色（gram stain）,革兰阳性球菌 革兰阴性杆菌,8/27/2024,10,第二节 细菌的形态学检查（二）常用的染色方法9/3/202,第二节 细菌的形态学检查,2抗酸染色,（acid-fast stain）,可将细菌分为两大类：,即-抗酸性细菌,-非抗酸性细菌,8/27/2024,11,第二节 细菌的形态学检查2抗酸染色9/3/202311,第二节 细菌的形态学检查,3荧光染色,（1）荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。,（2）主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。,8/27/2024,12,第二节 细菌的形态学检查3荧光染色 9/3/202312,第二节 细菌的形态学检查,4.鞭毛染色,可观察到菌体上有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。,5.异染颗粒染色,用于白喉棒状杆菌染色。,8/27/2024,13,第二节 细菌的形态学检查4.鞭毛染色9/3/202313,第二节 细菌的形态学检查,6.芽胞染色：,绿色部分,为芽胞,8/27/2024,14,第二节 细菌的形态学检查6.芽胞染色：9/3/202314,第二节 细菌的形态学检查,7.,墨汁染色:,一般用于新型隐球菌检查,8/27/2024,15,第二节 细菌的形态学检查7.墨汁染色:9/3/202315,第三节 细菌的分离培养和鉴定,一、,培养基的种类和选择,培养基的组成成分、培养基种类、培养基的选择,二、分离及培养,细菌的分离、细菌培养方法,三、生化反应和鉴定,碳水化合物的代谢试验,蛋白质和氨基酸的代谢试验,碳源和氮源利用试验,8/27/2024,16,第三节 细菌的分离培养和鉴定一、培养基的种类和选择9/3/,第三节 细菌的分离培养和鉴定,一、培养基的种类和选择,培养基（culture medium）,是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。,8/27/2024,17,第三节 细菌的分离培养和鉴定一、培养基的种类和选择9/3/,第三节 细菌的分离培养和鉴定,(一)培养基的组成成分,1营养物质,蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖类、醇类、血液、,无机盐类、鸡蛋和动物血清生长因子,2凝固物质,琼脂、明胶、卵白,3抑制剂和指示剂,8/27/2024,18,第三节 细菌的分离培养和鉴定(一)培养基的组成成分9/3/,第三节 细菌的分离培养和鉴定,（二）培养基种类,1基础培养基（based medium）,2营养培养基（nutrient medium）,3鉴别培养基（diferential medium）,4选择培养基（selective medium）,5特殊培养基（special medium）,8/27/2024,19,第三节 细菌的分离培养和鉴定（二）培养基种类9/3/202,第三节 细菌的分离培养和鉴定,1基础培养基,含有基础生长所需的基本营养成分，最常用的是肉浸液，俗称肉汤（broth），主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。,8/27/2024,20,第三节 细菌的分离培养和鉴定1基础培养基9/3/2023,第三节 细菌的分离培养和鉴定,2营养培养基（nutrient medium）,最常用的是血琼脂平板、巧克力血平板等,8/27/2024,21,第三节 细菌的分离培养和鉴定2营养培养基（nutrien,第三节 细菌的分离培养和鉴定,3鉴别培养基（diferential medium）,糖发酵管、克氏双糖铁琼脂（KIA）、伊红-镁蓝琼脂和动力-吲哚-尿素（MIU）培养基等。,8/27/2024,22,第三节 细菌的分离培养和鉴定 3鉴别培养基（difere,第三节 细菌的分离培养和鉴定,4选择培,（selective medium）,SS琼脂使致病的沙门菌、志贺菌容易分离到,8/27/2024,23,第三节 细菌的分离培养和鉴定4选择培9/3/202323,第三节 细菌的分离培养和鉴定,5特殊培养基,（special medium）,疱肉培养基、,巯基乙醇酸纳培养基,8/27/2024,24,第三节 细菌的分离培养和鉴定5特殊培养基9/3/2023,第三节 细菌的分离培养和鉴定,（三）培养基的选择,根据标本来源和可能存在的病原菌，确定选用各种分离培养基。伊红美蓝/麦康凯用于筛选革兰阴性杆菌。,8/27/2024,25,第三节 细菌的分离培养和鉴定（三）培养基的选择9/3/20,第三节 细菌的分离培养和鉴定,（三）培养基的选择,从血液、骨髓中分离病原菌用血液增菌培养基,8/27/2024,26,第三节 细菌的分离培养和鉴定（三）培养基的选择9/3/20,第三节 细菌的分离培养和鉴定,1平板划线分离法,2斜面接种法,3液体接种法,二、分离及培养,（一）细菌的分离,4穿刺接种法,5倾注平板法,6涂布接种法,8/27/2024,27,第三节 细菌的分离培养和鉴定1平板划线分离法二、分离及培,第三节 细菌的分离培养和鉴定,（二）细菌培养方法,1需氧培养法,2二氧化碳培养法,3厌氧培养法,8/27/2024,28,第三节 细菌的分离培养和鉴定（二）细菌培养方法9/3/20,第三节 细菌的分离培养和鉴定,三、生化反应和鉴定,（一）碳水化合物的代谢试验,1. 糖（醇、苷）类发酵试验,是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要,8/27/2024,29,第三节 细菌的分离培养和鉴定三、生化反应和鉴定9/3/20,第三节 细菌的分离培养和鉴定,2氧化发酵试验（O/F试验）,主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴,别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型,或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的,鉴别。,8/27/2024,30,第三节 细菌的分离培养和鉴定2氧化发酵试验（O/F试验,第三节 细菌的分离培养和鉴定,3半乳糖苷酶试验（ONPG试验）,迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为,阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验,主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。,8/27/2024,31,第三节 细菌的分离培养和鉴定3半乳糖苷酶试验（ONP,第三节 细菌的分离培养和鉴定,4七叶苷水解试验,主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别。,5甲基红试验,主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌。,6VP试验,本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的,细菌，后者通常为阴性。,8/27/2024,32,第三节 细菌的分离培养和鉴定4七叶苷水解试验9/3/20,第三节 细菌的分离培养和鉴定,2吲哚(靛基质)试验,主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验,1,明胶液化试验,主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。,8/27/2024,33,第三节 细菌的分离培养和鉴定2吲哚(靛基质)试验（二）蛋,第三节 细菌的分离培养和鉴定,3硫化氢试验,培养基：醋酸铅培养基,应用：主要用于肠杆菌,科中属及种鉴别,8/27/2024,34,第三节 细菌的分离培养和鉴定3硫化氢试验9/3/2023,第三节 细菌的分离培养和鉴定,4,尿素分解试验,主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。,5,苯丙氨酸脱氨酶试验,主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗菲登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。,6,氨基酸脱羧酶试验,主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,8/27/2024,35,第三节 细菌的分离培养和鉴定4尿素分解试验9/3/202,第三节 细菌的分离培养和鉴定,（三）碳源和氮源利用试验,1,枸橼酸盐利用试验,用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。,2,丙二酸盐利用试验,肠杆菌科中属间及种的鉴别。,8/27/2024,36,第三节 细菌的分离培养和鉴定（三）碳源和氮源利用试验9/3,第三节 细菌的分离培养和鉴定,（四）各种酶类试验,1,氧化酶试验,主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别。,2,过氧化氢酶试验（触酶试验）,用于革兰阳性球菌的初步分群。,8/27/2024,37,第三节 细菌的分离培养和鉴定（四）各种酶类试验9/3/20,第三节 细菌的分离培养和鉴定,3,硝酸盐还原试验,本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球菌等试验也为阳性。,8/27/2024,38,第三节 细菌的分离培养和鉴定 3硝酸盐还原试验9/3/,第三节 细菌的分离培养和鉴定,4,脂酶试验,主要用于厌氧菌的鉴别。,5,卵磷脂酶试验,主要用于厌氧菌的鉴定。,6,DNA,酶试验,在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生,DNA,酶，在肠杆菌科中沙雷氏菌和变形杆菌,产生此酶。,8/27/2024,39,第三节 细菌的分离培养和鉴定4脂酶试验9/3/20233,第三节 细菌的分离培养和鉴定,8,CAMP,试验,在链球菌中，只有,B,群,链球菌,CAMP,试验阳性，,故可作为特异性鉴定。,7,凝固酶试验,作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。,8/27/2024,40,第三节 细菌的分离培养和鉴定8 CAMP试验7 凝固,第三节 细菌的分离培养和鉴定,（五）抑菌试验,1,O/129抑菌试验,用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属,对O/129敏感，而气单胞菌属耐药。,2,杆菌肽试验,用于A群链球菌与非A群链球群的鉴别。,3,奥普托欣（Optochin）试验,主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。,8/27/2024,41,第三节 细菌的分离培养和鉴定（五）抑菌试验9/3/2023,第四节 细菌的非培养检测方法,一、免疫学检测,抗原检测、抗体检测,二、分子生物学检测,核酸杂交、聚合酶链反应、生物芯片技术,三、细菌毒素的检测,内毒素、外毒素,四、动物实验,8/27/2024,42,第四节 细菌的非培养检测方法一、免疫学检测9/3/2023,第四节,细菌的非培养检测方法,一、免疫学检测,（一）抗原检测,免疫荧光技术是利用免疫学特异性反应与荧光,示踪技术相结合的显微镜检查手段。既保持了血清,学的高特异性，又极大地提高了检测的敏感性，在,细菌鉴定方面占有重要地位。常用的方法有直接,法、间接法和免疫荧光菌球法。,8/27/2024,43,第四节 细菌的非培养检测方法一、免疫学检测9/3/2023,第四节,细菌的非培养检测方法,一、免疫学检测,（二）抗体检测,抗体的量常随感染过程而增多，表现为效价的,升高。因此用已知的细菌或其特异性抗原检测病人,血清中有无相应抗体及其效价的动态变化，可作为,某些传染病的辅助诊断。主要适用于抗原性较强的,致病菌和病程较长的感染性疾病。,8/27/2024,44,第四节 细菌的非培养检测方法一、免疫学检测9/3/2023,第四节,细菌的非培养检测方法,二、分子生物学检测,（一）核酸杂交,DNA,可进行,变性、复性、杂交。我们利用这一特性，制备特定序列,DNA,片段，进行标记后用作探针，在一定条件下，按照碱基互补配对原则与标本中已变性的细菌,DNA,进行杂交，通过检测杂交信号确定是否发生杂交反应，从而鉴定标本中有无相应的病原菌基因。,8/27/2024,45,第四节 细菌的非培养检测方法二、分子生物学检测9/3/20,第四节,细菌的非培养检测方法,二、分子生物学检测,（一）核酸杂交,1. 探针的种类,（1）全染色体,DNA,探针,（2）染色体克隆片段,DNA,探针,（3）质粒,DNA,探针,（4）rRNA基因探针,（5）寡核苷酸探针,8/27/2024,46,第四节 细菌的非培养检测方法二、分子生物学检测9/3/20,第四节,细菌的非培养检测方法,2核酸杂交在临床细菌检测中的应用,（1）细菌分类鉴定,（2）细菌快速鉴定,（3）细菌耐药性的检测,（4）细菌毒素的检测,（5）细菌流行病学调查,8/27/2024,47,第四节 细菌的非培养检测方法 2核酸杂交在临床细菌检测,第四节,细菌的非培养检测方法,（二）聚合酶链反应,（ polymerase chain reaction,PCR ）,1. 特异性DNA体外扩增技术,2. 特异、灵敏、快速、操作简便,3. 广泛应用于细菌的鉴定,8/27/2024,48,第四节 细菌的非培养检测方法（二）聚合酶链反应9/3/20,第四节,细菌的非培养检测方法,PCR在临床细菌检测中的应用,1. 细菌的快速检测,2. 细菌毒素的检测,3. 细菌耐药性的检测,4. 细菌流行病学调查,8/27/2024,49,第四节 细菌的非培养检测方法PCR在临床细菌检测中的应用9,第四节,细菌的非培养检测方法,（三）生物芯片技术,1. 通过微加工技术和微电子技术在固体芯片,表面构建微型生物化学分析系统。,2. 对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的,准确、快速、大信息量的检测。,3. 常用的生物芯片分为二大类：即基因芯片和,蛋白芯片。,8/27/2024,50,第四节 细菌的非培养检测方法（三）生物芯片技术9/3/20,第四节,细菌的非培养检测方法,三、细菌毒素的检测,（一）内毒素,内毒素的测定，主要用于确诊病人是否发生,革兰阴性细菌感染。另外，还可用于检测注射用,液和生物制品有无内毒素污染。,方法：鲎试验。,8/27/2024,51,第四节 细菌的非培养检测方法三、细菌毒素的检测9/3/20,第四节,细菌的非培养检测方法,（二）外毒素,外毒素的测定可用于待检菌的鉴定，,同时可区分产毒株与非产毒株。,方法：,1. 体内毒力试验,2. 体外毒力试验,8/27/2024,52,第四节 细菌的非培养检测方法（二）外毒素9/3/20235,第四节,细菌的非培养检测方法,四、动物实验,1. 用途：,（1）分离和鉴定病原微生物,（2）测定细菌的毒力,（3）制备免疫血清,（4）建立致病动物模型,（5）动物的血液是配制细菌,培养基必须的实验材料,（6）用于生物制品或一些药物的安全、毒性、疗效检验,2. 常用的接种方法：,皮下注射、皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射和脑内注射等。,8/27/2024,53,第四节 细菌的非培养检测方法四、动物实验9/3/20235,