流式细胞术在临床血液学课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,流式细胞术在临床血液学与医学科研中的应用,陈军浩,南京大学医学院附属南京鼓楼医院,1,流式细胞术在临床血液学与医学科研中的应用陈军浩1,概述,General overview,点击输入本栏的具体文字，简明扼要的说明分项内容，请根据您的具体内容酌情修改。,Click to enter the specific text in this column to explain the sub item content briefly. Please modify it according to your specific content.,概述 General overview,流式细胞仪基本工作原理,光路系统,液路系统,电路系统,3,流式细胞仪基本工作原理3,流式细胞仪光路图,4,流式细胞仪光路图4,外周血FSC-SSC点图,5,外周血FSC-SSC点图5,荧光信号（FL1、FL2、FL3）,6,荧光信号（FL1、FL2、FL3）6,滤光片,7,滤光片7,CD8-CD28+,CD8-CD28-,CD8+CD28+,CD8+CD28-,FL1-FL2点图,8,CD8-CD28+CD8-CD28-CD8+CD28+CD8,红系成熟过程抗原表达,9,红系成熟过程抗原表达9,B系成熟过程抗原表达,10,B系成熟过程抗原表达10,T系成熟过程抗原表达,11,T系成熟过程抗原表达11,粒系成熟过程抗原表达,12,粒系成熟过程抗原表达12,单系成熟过程抗原表达,13,单系成熟过程抗原表达13,急性白血病免疫分型,髓系标志：CD13、CD33、CD14、CD117、CD61、胞浆MPO。,B系标志：CD19、CD10、CD22、CD20、胞浆CD22。,T系标志：CD5、CD7、胞浆CD3。,红系标志：CD71、Gly A,非系列标志：CD34、HLA-DR,14,急性白血病免疫分型髓系标志：CD13、CD33、CD14、C,白血病细胞系列不保真性,抗原跨系表达,抗原表达不同步,抗原表达过高、过低,表达异常蛋白KORSA3544(CD66c),15,白血病细胞系列不保真性抗原跨系表达15,CD19白血病细胞伴CD33表达,16,CD19白血病细胞伴CD33表达16,细胞抗原表达过高、过低,17,细胞抗原表达过高、过低17,AML-M0/M1,有低的SSC和FSC。在CD45SSC图上出现在原始细胞位置上，至少表达一个特异性标志如CD13或CD33，但MPO比CD13与CD33更灵敏。也可表达CD7或CD4。HLA-DR、CD34阳性，有些研究表明CD7与CD34共表达在AML且预后差。,流式上M1与M0相似不易区分，M1一般CD13、CD33，但CD34表达可少于M0，可能表达部分CD15。,18,AML-M0/M1有低的SSC和FSC。在CD45SSC图,19,19,AML-M2,M2与M1的主要区别是成熟度增加，原始细胞减少，CD15表达较M1显著，CD34弱于M1。,CD45-SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45SSC图有助于确定blasts比例。,20,AML-M2M2与M1的主要区别是成熟度增加，原始细胞减少，,21,21,AML-M3,高颗粒性，表现为较高的SSC，多数情况HLA-DR阴性或表达很少，CD34少于M2、一般CD13弱于CD33，大多表达CD117。,M3v低颗粒性，表现为较低的SSC。,22,AML-M3高颗粒性，表现为较高的SSC，多数情况HLA-D,23,23,24,24,AML-M4/M5,两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（），CD45-SSC图上，不成熟细胞出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLA-DR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13。,25,AML-M4/M5两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD3,26,26,27,27,AML-M6,特征不明显，HLA-DR，CD34、CD13、CD33、CD19、CD22、CD5、CD7等均阴性，CD45SSC图显示主要为CD45阴性区域为红系成份，高表达CD71。,28,AML-M6特征不明显，HLA-DR，CD34、CD13、C,29,29,AML-M7,巨核细胞白血病，在AML中少于1。一般CD61（Gpa）和/或CD41（Gpb-a）阳性，特别而注意由于血小板粘附在blasts上造成的假阳性，,30,AML-M7巨核细胞白血病，在AML中少于1。一般CD61,31,31,B-ALL,32,B-ALL32,B-ALL,33,B-ALL33,淋巴细胞增生性疾病,34,淋巴细胞增生性疾病34,浆细胞白血病,35,浆细胞白血病35,浆细胞白血病,36,浆细胞白血病36,T-细胞白血病,37,T-细胞白血病37,T-细胞白血病胞浆CD3阳性,38,T-细胞白血病胞浆CD3阳性38,慢性淋巴细胞白血病,39,慢性淋巴细胞白血病39,套细胞淋巴瘤,40,套细胞淋巴瘤40,边缘带B细胞淋巴瘤,41,边缘带B细胞淋巴瘤41,42,42,吞噬、加工、递呈抗原,43,吞噬、加工、递呈抗原43,细胞吞噬功能检测,DEX （ Dextrans，右旋糖苷）。,37，DEX-FITC与活细胞共孵育10min。,洗去细胞外多余的DEX-FITC。,流式细胞仪检测FL1荧光强度的变化。,44,细胞吞噬功能检测DEX （ Dextrans，右旋糖苷）。4,细胞吞噬功能检测,45,细胞吞噬功能检测45,细胞吞噬功能检测的意义,单核吞噬细胞系统是机体的最初防御系统，有清除或吞噬异物的能力。本试验可评价此系统的功能。,癌症患者细胞吞噬功能减低。,研究免疫抑制药物对细胞的作用。,46,细胞吞噬功能检测的意义单核吞噬细胞系统是机体的最初防御系统，,呼吸爆发,ConA,AA,PAF,IL-8,fMLP,酪氨酸激酶,表面受体,G蛋白,NADPH,oxidase,O,2,-O,2,-,47,呼吸爆发ConAPAF酪氨酸激酶表面受体G蛋白NADPHO2,中性粒细胞呼吸爆发,肝素抗凝血。,调理后的细菌为刺激剂；PMA为强刺激剂；fMLP为弱刺激剂。,37，刺激后细胞与二氢罗丹明（DHR）123孵育。,流式细胞仪检测FL1荧光强度。,48,中性粒细胞呼吸爆发肝素抗凝血。48,中性粒细胞呼吸爆发,49,中性粒细胞呼吸爆发49,呼吸爆发的意义,慢性肉芽肿症（chronicgranulomatous disease,CGD），患者的中性粒细胞和单核细胞吞噬细菌后不能产后呼吸爆发，不能杀灭摄入的致病菌。,超氧阴离子可造成正常组织损伤。如类风湿关节炎。,50,呼吸爆发的意义慢性肉芽肿症（chronicgranuloma,APC与T细胞的作用,51,APC与T细胞的作用51,移植前后CD3阳性T细胞CD4/CD8细胞的表达,52,移植前后CD3阳性T细胞CD4/CD8细胞的表达52,移植前后CD3阳性T细胞CD8/CD28的表达,53,移植前后CD3阳性T细胞CD8/CD28的表达53,移植前后CD4阳性细胞CD45RA/CD45RO的表达,54,移植前后CD4阳性细胞CD45RA/CD45RO的表达54,人淋巴细胞CD154的表达,55,人淋巴细胞CD154的表达55,Th 1/Th2细胞检测（三色法）,正常人 MS患者,56,Th 1/Th2细胞检测（三色法） 正常人,Th1/Th2细胞检测（四色法）,57,Th1/Th2细胞检测（四色法）57,特异性抗原激活淋巴细胞,58,特异性抗原激活淋巴细胞58,移植后免疫检测,CD25较基础值高出10%，表明即将或已经发生排斥。,HLA-DR增加10%，且不伴有CD25增加，提示巨细胞病毒感染。,CD4/CD8小于0.2必须停用免疫抑制剂。,59,移植后免疫检测CD25较基础值高出10%，表明即将或已经发生,捕获微球,细胞因子,检测抗体,流式细胞术检测可溶性抗原,60,捕获微球细胞因子检测抗体流式细胞术检测可溶性抗原60,M:1-6分别代表：IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-a、INF-,61,M:1-6分别代表：IL-2、IL-4、IL-5、IL-10,流式细胞术CBA,可溶性细胞因子检测，自上而下依次为：IL-2，IL-4，IL-6，IL-10， TNF-a ，IFN-v,62,流式细胞术CBA可溶性细胞因子检测，自上而下依次为：IL-2,MHC四聚体模式图,每条MHC接有一个生物素,链亲和素结合四个生物素,微球蛋白维持MHC正确构象,肽提供特异性结合,四聚体较单体与CTL结合稳定,63,MHC四聚体模式图每条MHC接有一个生物素63,Basic Pentamer Staining Protocol,Red cell lysing solution - 5 mins,MHC Pentamer,(e.g. R-PE),anti-CD8 mAb,(e.g. FITC),30 - 45,(,temp dependent),2,x washes,+,CD8,Pentamer,20,64,Basic Pentamer Staining Protoc,MHC四聚体技术的意义,四聚体复合物法具有精确的肽特异性。,阳性细胞数量与CTL功能密切相关。,分选出正染组细胞扩增，其阳性率由4%上升为90%；负染组仍为阴性。,HBV肝内出现大量非HBV特异性淋巴细胞浸润。,免疫接种效果监视。,65,MHC四聚体技术的意义四聚体复合物法具有精确的肽特异性。6,效应细胞对靶细胞的杀伤作用,预先用CFSE染色K562靶细胞（发绿色荧光）。,效应细胞与靶细胞相互作用。,用碘化吡啶（PI）染色混合的细胞。,活细胞拒染PI。死细胞膜透性增加，PI进入胞内与DNA着色，呈红色。,66,效应细胞对靶细胞的杀伤作用预先用CFSE染色K562靶细胞（,效应细胞对靶细胞的杀伤检测,67,效应细胞对靶细胞的杀伤检测67,细胞DNA含量分析,碘化吡啶与DNA结合发出红色荧光。,荧光强度与DNA含量正比。,S期细胞DNA正在合成。,G0/G1期细胞DNA为G2/M期的一半。,异倍体细胞出现提示恶性细胞。,68,细胞DNA含量分析碘化吡啶与DNA结合发出红色荧光。68,流式细胞术分析细胞DNA含量,69,流式细胞术分析细胞DNA含量69,BrdU掺入实验,BrdU是类似于胸腺嘧啶脱氧核苷，在细胞增殖时可掺入DNA链中。,用酸/碱/酶使DNA链解开。,荧光素标记的抗BrdU单抗孵育。,加入PI。,流式细胞仪检测。,70,BrdU掺入实验BrdU是类似于胸腺嘧啶脱氧核苷，在细胞增殖,BrdU掺入实验,71,BrdU掺入实验71,CFSE观察细胞增殖,CFSE (Carboxyfluorescein Succinimidyl ester) 是脂溶性染料，可以被细胞膜摄取。,在488nm激发波长，发出绿色荧光。,细胞有丝分裂后，染料平均分配到两个子代细胞中。,流式细胞仪检测，荧光强度下降。,72,CFSE观察细胞增殖CFSE (Carboxyfluores,CFSE标记的ECV304细胞共聚焦显微镜,73,CFSE标记的ECV304细胞共聚焦显微镜73,荧光染料CFSE作为细胞标记,74,荧光染料CFSE作为细胞标记74,T细胞CFSE染色后PMA刺激,75,T细胞CFSE染色后PMA刺激75,多参数CFSE染色B细胞增殖,76,多参数CFSE染色B细胞增殖76,流式细胞术计数淋巴细胞亚群,77,流式细胞术计数淋巴细胞亚群77,单个核细胞诱导树突状细胞,78,单个核细胞诱导树突状细胞78,单个核细胞诱导树突状细胞,79,单个核细胞诱导树突状细胞79,外周血中DC1、DC2检测,DC1增强免疫应答能力。,DC2主要参与免疫调理。,外周血中DC的确认标准为：,Lin-（CD3、CD14、CD20、CD19、CD56、CD16）、HLA-DR+,DC1为髓样DC，表达CD11c。,DC2为淋巴样DC，表达CD123。,80,外周血中DC1、DC2检测DC1增强免疫应答能力。80,外周血中DC1、DC2检测,81,外周血中DC1、DC2检测81,HBV患者DC1、DC2变化,82,HBV患者DC1、DC2变化82,间充质干细胞表面标志,83,间充质干细胞表面标志83,研究间质干细胞的意义,具有很强的自我更新能力、多向分化潜能，还具有相当强的可塑性。,支持、改善造血微环境。,免疫调节，诱导免疫耐受。,基因治疗载体细胞。,作为研究细胞增殖分化的细胞模型巨大的临床应用前景,84,研究间质干细胞的意义具有很强的自我更新能力、多向分化潜能，还,凋亡检测,Fas(CD95)/FasL检测。,Bcl-2、COX-2、CX43等检测。,磷脂酰丝氨酸 (PS)在细胞外膜上的检测。,线粒体膜电位变化的检测。,TUNEL检测。,DNA Ladder 检测。,85,凋亡检测Fas(CD95)/FasL检测。85,流式细胞术分析细胞DNA含量,86,流式细胞术分析细胞DNA含量86,Annexin-V/PI检测细胞凋亡,87,Annexin-V/PI检测细胞凋亡87,JC-1染色线粒体膜电位,88,JC-1染色线粒体膜电位88,7-AAD染色检测细胞凋亡,89,7-AAD染色检测细胞凋亡89,研究化疗药物协同作用,90,研究化疗药物协同作用90,胞浆钙离子检测,钙离子是将信号由胞膜转入胞浆必需的。,胞浆钙离子增高，表示细胞对刺激产生了应答。,胞浆钙离子可以是胞外进入的，也可以是内部释放的。,流式细胞仪结合荧光物质可以观察此现象。如fluo-3-AM。,91,胞浆钙离子检测钙离子是将信号由胞膜转入胞浆必需的。91,细胞胞浆钙离子测定,92,细胞胞浆钙离子测定92,CpG-ODN的免疫刺激作用,CpG基序（motif）或者称为免疫刺激序列（immunostimulatory aequences,ISS）是指非甲基化胞嘧定鸟嘌呤（CpG）两侧具有特定碱基的双脱氧核苷酸序列。,来源于细菌DNA，也可人工合成，高效、安全。,通过,TLR-9,刺激免疫细胞，发挥作用。,靶细胞为DC,2,和B淋巴细胞。,93,CpG-ODN的免疫刺激作用CpG基序（motif）或者称为,实验方法,CpG2006、2216由上海生物工程技术服务有限公司合成，全硫代化修饰。,对照组为含10%FCS的RPMI1640培养外周血PBMC，细胞量10,7,，37、5%CO,2,、48小时。,实验组加入CpG2006或CpG2216，终浓度均为1umol/mL，余同上。,94,实验方法CpG2006、2216由上海生物工程技术服务有限公,对照组淋巴细胞CD69表达,95,对照组淋巴细胞CD69表达95,CpG2006诱导细胞CD69表达,96,CpG2006诱导细胞CD69表达96,CpG2216诱导细胞CD69表达,97,CpG2216诱导细胞CD69表达97,CpG-ODN诱导T、B淋巴细胞CD69表达,CD69表达率（%）,T淋巴细胞 B淋巴细胞,98,CpG-ODN诱导T、B淋巴细胞CD69表达CD69表达率（,CpG诱导B淋巴细胞CD80与CD86表达,99,CpG诱导B淋巴细胞CD80与CD86表达99,CpG诱导B淋巴细胞CD80与CD86表达,CD80 CD86,图,CD80CD86,CD80、CD86表达率（%）,100,CpG诱导B淋巴细胞CD80与CD86表达CD80,对照组B淋巴细胞MHC-与MHC-表达,101,对照组B淋巴细胞MHC-与MHC-表达101,CpG2006诱导B淋巴细胞MHC-与MHC-表达,102,CpG2006诱导B淋巴细胞MHC-与MHC-表达102,CpG2216诱导B淋巴细胞MHC-与MHC-表达,103,CpG2216诱导B淋巴细胞MHC-与MHC-表达103,CpG诱导B淋巴细胞MHC分子表达,MHC-MHC-,图2、C,MHC表达量（MFI）,104,CpG诱导B淋巴细胞MHC分子表达 MH,对照组单个核细胞周期分析,105,对照组单个核细胞周期分析105,提问与解答环节,Questions and answers,提问与解答环节,结束语,CONCLUSION,感谢参与本课程，也感激大家对我们工作的支持与积极的参与。课程后会发放课程满意度评估表，如果对我们课程或者工作有什么建议和一件，也请写在上边，来自于您的声音是对我们最大的鼓励和帮助，大家在填写评估表的同时，也预祝各位步步高升，真心期待着再次相会！,结束语CONCLUSION感谢参与本课程，也感激大家对我,感谢观看,The user can demonstrate on a projector or computer, or print the presentation and make it into a film,感谢观看,