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*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第四节、肉毒梭状芽孢杆菌检验,一、肉毒梭状芽孢杆菌的生物学特性,1,、,形态与染色,肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，革兰氏染色阳性，约为,41m,的大杆菌， 多单在，偶见成双或短链，两侧平行，两端钝园，直杆状或稍弯曲，芽胞为卵圆形，大于菌体宽度，位于次极端，使菌体呈匙形或网球拍状，偶有位于中央，常见很多游离芽胞。 有,48,根周生鞭毛，,运动迟缓，,无荚膜。,第四节、肉毒梭状芽孢杆菌检验一、肉毒梭状芽孢杆菌的生物学特性,1,2,、培养特性,最严格的厌氧菌,生长最适温度：,28 ,37 ,：,pH,为,6.87.6,，产毒的最适,pH,为,7.8 8.2,。,产毒培养温度：不同菌型产毒的最适培养温度不完全相同。,C,、,D,型温度高些为宜，,35,培养,3d,即可，而,E,型菌低温度长时间培养效果较好。,对营养要求不高 ：在普通培养基上都能生长。,肉毒梭状芽孢杆菌菌落,在固体培养基表面上，形成类圆形，边缘不整齐，约,3,毫米左右的菌落。菌落半透明，表面一般比较光滑也有的呈颗粒状，界线不明显，向外扩散。呈绒毛网状，常常扩散成菌苔。,2、培养特性最严格的厌氧菌 肉毒梭状芽孢杆菌菌落,2,肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同型，也常见到株间的差异。,3,、肉毒梭菌的生化特性,表,1,各型肉毒梭菌的生化反应,肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同型，也常见到株间的差异。3,3,二、,肉毒梭菌的致病性,肉毒梭菌能产生,外毒素,即肉毒毒素（大分子蛋白），根据毒素的抗原特异性将其分为,A,、,B,、,C,（,1,、,2,） 、,D,、,E,、,F,、,G,七个型别。与毒素型别相对应，肉毒梭菌也分为同样的七个型别。,其中,A,、,B,、,E,、,F,四型毒素对人有不同程度的致病性。,A,型毒素经,60,2,分钟加热，差不多能被完全破坏，而,B,、,E,二型毒素要经,70,2,分钟才能被破坏；,C,、,D,二型毒素对热的抵抗更大些；,C,型毒素要经过,90,2,分钟加热才能完全破坏，不论如何，只要煮沸,1,分钟或,75,加热,5,10,分钟，毒素都能被完全破坏。肉毒毒素对酸性反应比较稳定，对碱性反应比较敏感。某些型的肉毒毒素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。,二、肉毒梭菌的致病性 肉毒梭菌能产生外毒素即肉毒,4,肉毒毒素是一种神经麻痹毒素，主要抑制神经末梢释放乙酰胆碱，引起肌肉松弛麻痹，特别是呼吸肌麻痹导致死亡。, 肉毒毒素的毒性极强，是目前已知在天然毒素和合成毒剂中毒性最强的生物毒素，据称，精制毒素,1,克能杀死,400,万吨小白鼠，一个人的致死量大概,1,微克左右。,肉毒中毒一年四季均可发生。美国以罐头发生中毒较多，日本以水产品较多；我国以发酵食品（如：臭豆腐、豆瓣酱、豆豉等）发生中毒较多。,肉毒毒素是一种神经麻痹毒素，主要抑制神经末梢,5,三、检验方法,1,、检验标准：,GB 4789.12-2003,2,、培养基和试剂,培养基：,庖肉培养基、卵黄琼脂培养基、明胶磷酸盐缓冲液。,试剂：,肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶（活力,1:250,）、革兰氏染色液。 另需实验动物（小白鼠）。,三、检验方法1、检验标准：GB 4789.12-2003,6,3,、,检验程序,检 样,毒素检测,增菌、产毒培养,30,，,5 d,报告,（一）,毒素检测,报告（二）,分离培养,培养检查,毒素检测,报告（三）,增菌产毒培养,30,，,5 d,观察生长性状，,染色镜检,观察菌落性状,染色镜检,报告,(,一,),：,检样中有无肉毒毒素以及有何型肉毒毒素。,(,如仅为了肉毒中毒诊断，即可结束检验,),报告,(,二,),：,对增菌产毒培养物，一方面做生长特性观察，同时检测肉毒毒素。报告检样中有无肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌。（有些样品如土壤、泥沙等基本上不可能含有毒素，则应从培养着手）,报告,(,三,),：,欲获纯菌株，可用增菌产毒培养物进行分离培养，对所得纯菌株进行形态、培养特性等观察及毒素检测，其结果可证明所得纯菌为何型肉毒梭菌。（一般情况下，没有必要从检样中分离纯的菌株，但研究或特殊需要例外）,3、检验程序检 样毒素检测增菌、产毒培养报告毒素检测报告,7,（,1,）、肉毒毒素检测,注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后,24 h,内发病、死亡。,液态或固体样品经过适当处理后离心，取上清液实验,上清液及其胰酶激活处理液,分别进行小白鼠腹腔注射，各,3,只，每只,0.5 mL,，观察,4 d,确证试验,毒力测定,定型试验,（1）、肉毒毒素检测注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在,8,取庖肉培养基五支，煮沸,10min,15min,，做如下处理：,第一支：,急速冷却，接种检样均质液,1 mL,2 mL,；,第二支：,冷却至,60,，接种检样，继续于,60,保温,10 min,，急速冷却；,第三支：,接种检样，继续煮沸加热,10 min,，急速冷却。,第四支：,急速冷却，接种肉毒梭菌菌种。,第五支：,急速冷却，作为空白对照。,以上,5,支试管于,30,厌氧培养,5d,，若无生长，可再培养,10d,。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同上，,阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。,（,2,）、肉毒梭菌的检出（增菌产毒培养试验）,取庖肉培养基五支，煮沸10min15min，做如下处理：（,9,选取证实含有肉毒毒素的增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜的加热处理）接种卵黄琼脂平板，,35,厌氧培养,48 h,。肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样,(,或珍珠层样,),薄层,，但,G,型菌无此现象。,根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，于,30,培养,5d,，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。,（,3,）、分离培养,（,1,）毒素检测：试验方法同上。（,2,）培养特性检查：接种卵黄琼脂平板，分成两份，分别在,35,的需氧和厌氧条件下培养,48 h,，观察生长情况及菌落形态。肉毒梭菌只在厌氧条件下生长而在需氧条件下不生长。,选取证实含有肉毒毒素的增菌产毒培养物（必要时可重复一,10,4,、结果报告,报告,(,一,),：检样含有某型肉毒毒素。报告,(,二,),：检样含有某型肉毒梭菌。报告,(,三,),：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌。,肉毒梭菌检验目标主要是毒素，不论食品中的肉毒毒素检验还是肉毒梭菌检验，均以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据。,4、结果报告报告(一)：检样含有某型肉毒毒素。报告(二)：,11,第五节、副溶血性弧菌检验,一、生物学特性,1,、形态与染色,革兰氏阴性无芽胞多形态杆菌或稍弯曲弧菌,，有时呈棒状、甚至球状、丝状等。单端鞭毛。无芽胞、无荚膜。,第五节、副溶血性弧菌检验一、生物学特性,12,2,、,培养特性,需氧或兼性厌氧,嗜盐，,在,2,%NaCL,培养基中生长最好，无盐或食盐,10%,不能生长。,最适温度,36,，,pH7.57.8,在固体培养基上菌落呈圆形凸起，混浊不透明，表面光滑，较湿润，边缘不整齐。,在血平板上可见溶血环。,2、培养特性需氧或兼性厌氧,13,3,、生化特性,分解,葡萄糖,产酸不产气，不分解乳糖，蔗糖。,H,2,S,（）、,V-P,（）、靛基质（,+,）、精氨酸（）,甲基红（,+,）、赖氨酸（）、溶血,/-,3、生化特性分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖，蔗糖。,14,O,抗原：,O,1,O,13,13,种。,H,抗原：,K,抗原：,K,1,K,71,65,种。,（ 缺编：,K,2,、,K,14,、,K,17,、,K,35,、,K,62,）,血清分型：,所有副溶血性弧菌的,H,抗原均相同，但是,O,抗原和,K,抗原存在差异，以,13,种,O,抗原及,65,种,K,抗原将其分为,13,个群和,845,个型,。,4,、,抗原结构,O抗原：O1O13 13种。4、抗原结构,15,二、致病性,1,、致病因素,侵袭力：,活菌,(10,5,10,7,/g),，可使人致病,.,产生溶血毒素：,耐热性溶血毒素,(THD),和耐热性溶血毒素相关的溶血毒素,(TRH),，此外有的可产生不耐热溶血毒素,(TLH),。,2,、媒介食品,主要是海产品（鱼、虾、蟹、蛤等），含盐量较高的食物亦可带菌。,3,、所致疾病,食物中毒、急性胃肠炎、败血症等。,二、致病性1、致病因素2、媒介食品,16,1,、检验标准：,GB/T 4789.7-2008,副溶血性弧菌检验,2,、培养基和试剂,培养基：,3,氯化钠碱性蛋白陈水,APW),、,硫代硫酸盐,-,柠檬酸盐,-,胆盐,-,蔗糖（,TCBS,）琼脂,3,氯化钠胰蛋白胨大豆,TSA,）琼脂,3,氯化钠三糖铁（,TSI,）琼脂,嗜盐性试验培养基,3,氯化钠甘露醇试验培养基,3,氯化钠赖氨酸脱狡酶试验培养基,3,氯化钠,MR-VP,培养基 我妻氏血琼脂、弧菌显色培养基,试剂：,氧化酶试剂、革兰氏染色液、,ONPG,试剂、,3%,氯化钠溶液、,V-P,试剂、,API20E,生化鉴定试剂盒等。,三、检验方法,1、检验标准：GB/T 4789.7-2008 副溶血性弧,17,3,、检验程序,（,1,）样品处理及培养,定量测定,：样品用,3%,氯化钠蛋白胨水,10,倍连续稀释后取三个稀释度各接,3,支含有该培养基的试管，培养。,定性检测：,用上述,1:10,稀释液增菌培养。,（,2,）分离：,有菌生长的试管分别接种,TCBS,平板或弧菌显色培养基平板上划线分离、培养。,（,3,）纯培养：,挑可疑菌落划线分离。,（,4,）初步鉴定：,生化实验和镜检鉴定。,（,5,）确定鉴定：,生化试验鉴定,。,（,6,）报告,定性检测或定量检测。,（,7,）血清学分型,：（选做）,（,8,）神奈川试验：,3、检验程序（1）样品处理及培养,18,分离：,在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环,，,划线分离。,副溶血性弧菌在,TCBS,琼脂平板上的典型菌落：,圆形、半透明、表而光滑、质感类似口香糖、直径,2mm3mm,的绿色菌落。（,培养基中含溴麝香草酚兰和,H2S,指示剂,，因,副溶血性弧菌,不分解蔗糖、不产,H2S,，为,绿色菌落,）,副溶血性弧菌,混合菌种,分离：在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环，划线分,19,副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上典型菌落特征：,呈圆形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直径,2mm3mm,。,副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上典型菌落特征：,20,初步鉴定：,挑取纯培养的单个可疑菌落，进行副溶血性弧菌的初步鉴定：,副溶血性弧菌：,氧化酶试验：,阳性。,涂片镜检：,G-,，棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。,3,氯化钠三糖铁斜面 ：,底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。,嗜盐性试验：,分别接种于不同氯化钠浓度的胰胨水中培养，在无氯化钠和,10,氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在,7,氯化钠的胰胨水中生长旺盛。,初步鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行副溶血性弧菌的初步,21,生化试验：,分别接种各类生化培养基，培养后观察结果。,或,API20E,生化鉴定试剂盒或,VITEK,全自动微生物检测系统鉴定。,生化性状符合下表要求时，为副溶血性弧菌,。,确定鉴定,:,项目,结果,项目,结果,革兰氏染色镜检,阴性，无芽孢,乳糖,氧化酶,硫化氢,动力,赖氨酸脱梭酶,蔗糖,V-P,葡萄糖,ONPG,甘露醇,分解葡萄糖产气,表 副溶血性弧菌的生化性状,生化试验：分别接种各类生化培养基，培养后观察结果。确定鉴定:,22,定性检测：,报告,25g,（,ml,）样品中是否检出副溶血性弧菌。,定量检测：,根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查,MPN,检索表，报告每克（毫升）副溶血性弧菌的,MPN,值。,报告：,定性检测：报告25g（ml）样品中是否检出副溶血性弧菌。报告,23,神奈川试验：,测试副溶血性弧菌分离株是否存在特定溶血素（与致病性显著相关）。将测试菌点种在我妻氏血琼脂平板上，培养后观察是否有溶血现象。阳性结果为菌落周围呈半透明环的,溶血。,神奈川试验： 测试副溶血性弧菌分离株是否存在特定溶,24,第六节、蜡样芽胞杆菌,（一）生物学特性,1,、形态与染色,革兰氏阳性大杆菌，宽度在,1 m,或,1 m,以上，芽孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。,第六节、蜡样芽胞杆菌（一）生物学特性,25,需氧，最适生长温度,3032,。,在肉汤中混浊生长，有菌膜或壁环，振摇易乳化。,在普通琼脂平板上，菌落灰白色，不透明，边缘不整齐，表面粗糙，呈毛玻璃状或白蜡状。,在血平板上，菌落呈浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有溶血环。,在甘露醇卵黄多粘菌素平板上，菌落呈粉红色，具有白色混浊环,（不发酵甘露醇、产生卵磷脂酶）,2,、培养特性,需氧，最适生长温度3032。2、培养特性,26,能分解葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，水杨苷，产酸不产气。,不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖，山梨醇，木糖,H,2,S,（,-,），尿素酶试验（,-,）卵磷脂酶（,+,），,V-P,试验（,+,），液化明胶。,3,、生化反应,能分解葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，水杨苷，产酸不产气。3、生化反应,27,食品蜡样芽胞杆菌数量,10,6,/g,（,mL,）时常可导致食物中毒，导致中毒的主要原因是其产生的肠毒素 。,肠毒素类型：,耐热性肠毒素：,100,30min,不能被破坏，常在米饭中形成。,不耐热肠毒素：能在各种食物中形成。,临床症状：,食物中毒，分为呕吐型和腹泻型两类。,二、致病性,食品蜡样芽胞杆菌数量106/g（mL）时常可,28,三、检验方法,1,、检验标准；,GB 4789.142003,2,、培养基和试剂,培养基,:,肉浸液肉汤培养基 酪蛋白琼脂培养基,动力,-,硝酸盐培养基 缓冲葡萄糖蛋白胨水,血琼脂培养基 木糖,-,明胶培养基,甘露醇卵黄多粘菌素,(MYP),琼脂培养基、,试剂：,0.5%,碱性复红染色液、革兰氏染色液、,3%,过氧化氢溶液、甲萘胺,-,乙酸溶液、对氨基苯磺酸,-,乙酸溶液。,三、检验方法1、检验标准； GB 4789.142003,29,3,、检验程序,361 12 h 20 h,37,，,18 h 24 h,361 12 h 20 h,检 样,25 g,（,mL,）加,225 mL,生理盐水,菌数计算,做成,10,-1,10,-5,的稀释液,选择性培养基,（分离培养）,MYP,营养琼脂培养基,生长及菌落观察,染色镜检,生化试验,菌株保存,报 告,选择性培养基,（菌数测定）,MYP,包括四个步骤：,菌数测定,:,涂布甘露醇卵黄多粘菌素（,MYP,）,平板计数。,分离培养,:,从,MYP,上,挑可疑菌落进行纯培养。,证实实验,:,包括形态观察、培养特性、生化性状和生化分型试验。,与类似菌的鉴别：,主要是与苏云金芽孢杆菌的鉴别。,结果报告：,报告每,g,（,mL,）,检样中所含的蜡样芽孢杆菌数。,3、检验程序361 12 h 20 h37，,30,将样品稀释液,0.1 mL,涂布于甘露醇卵黄多粘菌素（,MYP,）琼脂平板上培养后，选取适当菌落数的平板进行计数。计数后，从中挑取,5,个典型菌落做证实试验。根据证实的蜡样芽孢杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数。,蜡样芽孢杆菌数,=,可疑菌落数,证实为阳性菌落数的比例,稀释倍数,10,菌数测定：,MYP,培养基中含有卵黄、甘露醇、多粘菌素和,pH,指示剂酚红等。多粘菌素可抑制杂菌的生长。,蜡样芽孢杆菌不发酵甘露醇，菌落为粉红色（否则为黄色）。,该菌产生卵磷脂酶，由于脂肪和卵磷脂被分解，在菌落周围产生粉红色的晕。,将样品稀释液0.1 mL涂布于甘露醇卵黄多粘菌素,31,分离培养和证实试验,:,分离培养：,从,MYP,平板上挑可疑菌落到营养琼脂上进行纯培养。,证实试验：,（,1,）形态观察,（,2,）培养特性（,3,）生化性状及生化分型,生化性状,本菌有动力；能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；常能液化明胶和使硝酸盐还原；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。生化分型,根据蜡样芽孢杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、,V-P,反应、明胶液化性状的试验，分成不同的型别。,分离培养和证实试验: 分离培养：从MYP平板上挑可疑菌落到营,32,型 别,生 化 试 验,柠檬酸盐利用,硝酸盐还原,淀粉水解,V-P,反应,明胶液化,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,表,1,蜡样芽孢杆菌生化分型,型 别生 化 试 验柠檬酸盐利用硝酸盐还原淀粉水解V-P反应,33,鉴别：,蜡样芽孢杆菌在形态以及生化性状上与苏云金芽孢杆菌极为相似 ，要进行鉴别。主要是通过观察伴孢晶体来判断，苏云金芽孢杆菌有伴孢晶体，蜡样芽孢杆菌无。,苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体,蜡样芽孢杆菌,鉴别：苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体蜡样芽孢杆菌,34,写在最后,成功的基础在于好的学习习惯,The foundation of success lies in good habits,35,写在最后成功的基础在于好的学习习惯35,结束语,当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的，所以不要放弃，坚持就是正确的。,When You Do Your Best, Failure Is Great, So DonT Give Up, Stick To The End,演讲人：,XXXXXX,时 间：,XX,年,XX,月,XX,日,结束语,36,
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