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生生物物技技术术实实践践第第 37 37 讲讲DNA和蛋白质技术和蛋白质技术选修11 1进行进行DNADNA的粗提取与鉴定。的粗提取与鉴定。2 2尝试尝试PCRPCR技术的基本操作和应用。技术的基本操作和应用。3 3尝试蛋白质的提取和分离。尝试蛋白质的提取和分离。1 1(2010(2010江江苏苏)某某生生物物兴兴趣趣小小组组开开展展DNADNA粗粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：提取的相关探究活动。具体步骤如下：材材料料处处理理：称称取取新新鲜鲜的的花花菜菜、辣辣椒椒和和蒜蒜黄黄各各2 2份份，每每份份10 10 g g。剪剪碎碎后后分分成成两两组组，一一组组置置于于20 20、另另一一组组置置于于20 20 条条件件下下保保存存24 h24 h。DNADNA粗提取：粗提取：第第一一步步：将将上上述述材材料料分分别别放放入入研研钵钵中中，各各加加入入15 15 mLmL研研磨磨液液，充充分分研研磨磨。用用两两层层纱纱布布过过滤，取滤液备用。滤，取滤液备用。第第二二步步：先先向向6 6只只小小烧烧杯杯中中分分别别注注入入10 10 mLmL滤滤液液，再再加加入入20 20 mLmL体体积积分分数数为为95%95%的的冷冷酒酒精精溶溶液液，然然后后用用玻玻璃璃棒棒缓缓缓缓地地向向一一个个方方向向搅搅拌拌，使使絮絮状物缠绕在玻璃棒上。状物缠绕在玻璃棒上。第第三三步步：取取6 6支支试试管管，分分别别加加入入等等量量的的2 2 mol/L mol/L NaClNaCl溶液溶解上述絮状物。溶液溶解上述絮状物。DNADNA检检测测：在在上上述述试试管管中中各各加加入入4 4 mLmL二二苯苯胺胺试试剂剂，混混合合均均匀匀后后，置置于于沸沸水水中中加加热热5 5 minmin，待待试试管管冷冷却却后后比比较较溶溶液液的的颜颜色色深深浅浅，结结果果如如下表。下表。(注：注：“”越多表示蓝色越深越多表示蓝色越深)分析上述实验过程，回答下列问题：分析上述实验过程，回答下列问题：(1)(1)该探究性实验课题名称是该探究性实验课题名称是 。(2 2)第第二二步步中中“缓缓缓缓地地”搅搅拌拌，这这是是为为了了减减少少 。探究不同材料和探究不同材料和不同保存温度对不同保存温度对DNA提取量的影响提取量的影响DNA断裂断裂(3)(3)根据实验结果，得出结论并分析。根据实验结果，得出结论并分析。结结论论1 1：与与20 20 相相比比，相相同同实实验验材材料料在在20 20 条条件下保存，件下保存，DNADNA的提取量较多。的提取量较多。结论结论2 2：。针对结论针对结论1 1，请提出合理的解释：，请提出合理的解释：。(4)(4)氯氯仿仿密密度度大大于于水水，能能使使蛋蛋白白质质变变性性沉沉淀淀，与与水水和和DNADNA均均不不相相溶溶，且且对对DNADNA影影响响极极小小。为为了了进进一一步步提提高高DNADNA纯纯度度，依依据据氯氯仿仿的的特特性性，在在DNADNA粗粗提提取取第第三三步步的的基础上继续操作的步骤是：基础上继续操作的步骤是：，然后用体积分数为然后用体积分数为95%95%的冷酒精溶液使的冷酒精溶液使DNADNA析出。析出。等质量的不同实验材料，在相同的保存温等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄提取的度下，从蒜黄提取的DNA量最多量最多 低温抑制了相关酶低温抑制了相关酶的活性，的活性，DNA降解速度慢降解速度慢 将第三步获得的溶液分别与将第三步获得的溶液分别与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液 本本题题考考查查了了DNADNA粗粗提提取取技技术术的的原原理理、操操作作过过程程及及学学生生的的分分析析、判判断断能能力力。从从题题目目实实验验看看出出，该该实实验验的的课课题题名名称称是是探探究究不不同同材材料料和和不不同同保保存存温温度度对对DNADNA提提取取量量的的影影响响。在在实实验验的的第第二二步步中中，为为了了防防止止DNADNA断断裂裂，要要缓缓缓缓地地搅搅拌拌。从从表表中中结结果果看看出出，由由于于低低温温抑抑制制了了相相关关酶酶的的活活性性，DNADNA降降解解慢慢，使使得得相相同同材材料料在在低低温温保保存存时时，DNADNA提提取取量量大大；在在相相同同保保存存条条件件下下，蒜蒜黄黄蓝蓝色色最最深深，说说明明相相同同条条件件下下从从蒜蒜黄黄中中提提取取的的DNADNA量量最最大大。由由于于氯氯仿仿密密度度比比水水大大，可可使使蛋蛋白白质质变变性性后后沉沉淀淀，而而与与水水、DNADNA不不相相溶溶，这这样样可可将将第第三三步步获获得得的的溶溶液液分分别别与与等等量量的的氯氯仿仿混混合合，静静置置一一段段时时间间，吸吸取取上上清清液液即即可可得得到较纯净的到较纯净的DNADNA。2.(2008山山东东)科科学学家家发发现现家家蝇蝇体体内内存存在在一一种种抗抗菌菌活活性性蛋蛋白白。这这种种蛋蛋白白质质具具有有极极强强的抗菌能力，受到研究者重视。的抗菌能力，受到研究者重视。(1)分分离离该该抗抗菌菌蛋蛋白白可可用用电电泳泳法法，其其原原理理是是根根据据蛋蛋白白质质分分子子的的，大大小小及及性性状状不不同同，在在电电场场中中的的不不同而实现分离。同而实现分离。电荷电荷(带电情况带电情况)迁移速度迁移速度(2)可可用用金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌来来检检验验该该蛋蛋白白质质的的体体外外抗抗菌菌特特性性。抗抗菌菌实实验验所所用用培培养养基基中中的的牛牛肉肉膏膏和和蛋蛋白白胨胨主主要要为为细细菌菌生生长长提提供供和和。(3)分分别别在在加加入入和和未未加加入入该该抗抗菌菌蛋蛋白白的的培培养养基基中中接接种种等等量量菌菌液液。培培养养一一定定时时间间后后，比比较较两两种种培培养养基基中中菌菌落落的的，确确定定该该蛋蛋白白质的抗菌效果。质的抗菌效果。(4)抗抗 菌菌 培培 养养 常常 用用 的的 接接 种种 方方 法法 有有 .和和。实实验验结结束后，对使用过的培养基应进行束后，对使用过的培养基应进行处理。处理。碳源碳源氮源氮源数量数量平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法(稀释混合平板法稀释混合平板法)灭菌灭菌(1)电电泳泳是是指指带带电电粒粒子子在在电电场场的的作作用用下下发发生生迁迁移移的的过过程程。许许多多重重要要的的生生物物大大分分子子，如如多多肽肽、蛋蛋白白质质、核核酸酸等等都都具具有有可可解解离离基基团团，它它们们在在某某个个特特定定的的pH下下会会带带上上正正电电或或负负电电；在在电电场场的的作作用用下下，这这些些带带电电分分子子会会向向着着与与其其所所带带电电荷荷相相反反的的电电极极方方向向移移动动。电电泳泳技技术术就就是是在在电电场场的的作作用用下下，利利用用待待分分离离样样品品中中各各种种分分子子带带电电性性质质以以及及分分子子本本身身大大小小、形形状状等等性性质质的的差差异异，使使带带电电分分子子产产生生不不同同的的迁迁移移速速度度，从从而而达达到到对对样样品品进进行行分分离离、鉴鉴定定或或提提纯纯的的目目的。的。(2)牛牛肉肉膏膏和和蛋蛋白白胨胨是是成成分分复复杂杂的的天天然然有有机机物物，能能为为微微生生物物提提供供碳碳源源、氮源。氮源。(3)可可采采用用逆逆向向思思维维。若若抗抗菌菌蛋蛋白白具具有有抗抗菌菌效效果果，即即抗抗菌菌蛋蛋白白抑抑制制了了金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌的的生生长长繁繁殖殖，则则不不形形成成菌落或菌落数量明显偏少。菌落或菌落数量明显偏少。(4)微微生生物物接接种种的的方方法法很很多多，最最常常用用的的是是平平板板划划线线法法和和稀稀释释涂涂布布平平板板法法。平平板板划划线线法法通通过过接接种种环环在在琼琼脂脂固固体体培培养养基基表表面面连连续续划划线线的的操操作作，将将聚聚集集的的菌菌种种逐逐步步稀稀释释分分散散到到培培养养基基的的表表面面。稀稀释释涂涂布布平平板板法法则则是是将将菌菌液液进进行行一一系系列列的的梯梯度度稀稀释释。然然后后将将不不同同稀稀释释度度的的菌菌液液分分别别涂涂布布到到琼琼脂脂固固体体培培养养基基的的表表面面，进进行行培培养养。实实验验结结束束后后，使使用用过过的的培培养养基基应应该该进进行行灭灭菌菌处处理理才才能能倒倒掉掉，这这样做的目的是防止造成环境污染。样做的目的是防止造成环境污染。一、一、DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定1.原理原理粗提粗提取取DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶溶液中溶解度不同。在液中溶解度不同。在0.14 mol/L 的的NaCl溶液溶液中中DNA溶解度最溶解度最 .DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质则不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质则溶于酒精溶于酒精DNA与杂质对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同与杂质对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同鉴定鉴定DNA+蓝色蓝色二苯胺二苯胺沸水浴沸水浴5 min低低2.粗提取流程粗提取流程(以鸡血细胞液做实验材料为例以鸡血细胞液做实验材料为例)3.鉴定鉴定序号序号试管试管A试管试管B2 mol/L 的的NaCl溶溶液液5 mL5 mL加丝状物，用玻璃加丝状物，用玻璃棒搅拌棒搅拌加二苯胺加二苯胺4 mL，混匀，混匀4 mL，混匀，混匀沸水浴沸水浴5 min5 min实验现象实验现象变蓝变蓝不变蓝不变蓝实验结论实验结论丝状物的主要成分是丝状物的主要成分是DNA分子分子本本实实验验不不能能用用哺哺乳乳动动物物的的成成熟熟红红细细胞胞作作实实验验材材料料，原原因因是是哺哺乳乳动动物物的的成成熟熟红红细细胞胞内内无无细细胞胞核核，但但它它可可作作为为血血红红蛋蛋白白提提取取和和制备细胞膜的理想材料。制备细胞膜的理想材料。体内复制体内复制PCR反应反应解旋解旋在解旋酶作用下，在解旋酶作用下，细胞提供能量，细胞提供能量，部分解开部分解开加热至加热至90，双链全部解，双链全部解开，不需解旋酶开，不需解旋酶温度温度体内温和条件体内温和条件高温高温引物引物一小段一小段RNARNA或单链或单链DNA分子片段分子片段合成合成子子链链在引物基础上，在引物基础上，一条链连续合一条链连续合成，另一条链成，另一条链不连续合成不连续合成分别从两条链的引物端开分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控始，都是连续合成，控制温度制温度72 二、多聚酶链式反应扩增二、多聚酶链式反应扩增DNA片段片段1.生物体内生物体内DNA复制与复制与PCR反应的比较反应的比较体内复制体内复制PCR反应反应特点特点边解旋边复制，半保留复制边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增体外迅速扩增酶酶解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶等聚合酶等TaqDNA聚合酶聚合酶循环循环次次数数受生物体自身控制受生物体自身控制30多次多次相同相同点点生物体内的生物体内的DNA复制和复制和PCR体外体外DNA扩增都需扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸，子链延伸的方向要模板、四种脱氧核苷酸，子链延伸的方向都是从都是从5端端3端端条条件件稳定的缓冲液环境；稳定的缓冲液环境；DNA模板；模板；分别与模分别与模板板DNA两条模板链相结合的两种引物；两条模板链相结合的两种引物；A、T、G、C四种脱氧核苷酸；四种脱氧核苷酸；耐热的耐热的DNA聚合酶，聚合酶，一般用一般用TaqDNA聚合酶；聚合酶；能严格控制温度变化能严格控制温度变化的温控设备的温控设备过过程程变性：当温度上升到变性：当温度上升到90 以上时，双链以上时，双链DNA解解旋为单链旋为单链复性：温度下降为复性：温度下降为50 左右时，两种引物通过碱左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链基互补配对与两条单链DNA结合结合延伸：当温度上升到延伸：当温度上升到72 左右，四种脱氧核苷酸左右，四种脱氧核苷酸在在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的对原则合成新的DNA链链2.PCR反应反应蛋白质分蛋白质分离的方离的方法法三、血红蛋白的提取和分离三、血红蛋白的提取和分离1.蛋白质分离的方法蛋白质分离的方法凝胶色谱法凝胶色谱法电泳法电泳法蛋白质蛋白质相对分子质量大相对分子质量大相对分子质量小相对分子质量小运动方式运动方式排阻在凝胶颗粒排阻在凝胶颗粒外面，迅速通外面，迅速通过过进入凝胶颗粒内进入凝胶颗粒内部，被滞留部，被滞留移动速度移动速度.运动路程运动路程较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先先后后凝胶色谱法凝胶色谱法较快较快较慢较慢原理原理:一些生物大分子一些生物大分子(如多肽、核酸等如多肽、核酸等),在一定在一定pH下，其可解离的基团会带下，其可解离的基团会带上正电或负电上正电或负电,在电场的作用下在电场的作用下,这些这些带电分子会向着与其所带电荷带电分子会向着与其所带电荷的的电极移动电极移动影响因素影响因素:各种分子带电性质的差异以及各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状分子本身的大小、形状常用方法常用方法:琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳(通常使用通常使用聚丙聚丙烯酰胺凝胶电泳烯酰胺凝胶电泳)电泳法电泳法相反相反SDS步骤步骤目的目的过程过程样样品品处处理理红红细细胞胞洗洗涤涤去除杂蛋白，去除杂蛋白，以利于后以利于后续步骤的续步骤的分离纯化分离纯化分离分离(低速短时间离心低速短时间离心)用胶用胶头吸管吸去上层透明黄色血头吸管吸去上层透明黄色血浆浆下层红色细胞用下层红色细胞用洗涤洗涤(低速短时间离心低速短时间离心)三次三次血血红红蛋蛋白白的的释释放放使红细胞破使红细胞破裂释放血裂释放血红蛋白红蛋白依图中依图中abcd顺序顺序2.蛋白质的提取和分离操作流程蛋白质的提取和分离操作流程生理盐水生理盐水步骤步骤目的目的过程过程样样品品处处理理分分离离血血红红蛋蛋白白经过离心使血红经过离心使血红蛋白和其他杂蛋白和其他杂质分离开来，质分离开来，便于下一步对便于下一步对血红蛋白的纯血红蛋白的纯化化搅拌好的混合液转移至搅拌好的混合液转移至离心管中，离心管中，2000 r/min速度离心速度离心10 min(高速长时间高速长时间)滤滤纸过滤除去杂质得血纸过滤除去杂质得血红蛋白红蛋白粗分离粗分离(透析透析)除去样品中分子除去样品中分子量较小的杂质量较小的杂质或用于更换样或用于更换样品的缓冲液品的缓冲液1 mL 血红蛋白溶液血红蛋白溶液透析袋透析袋20 mmol/L 的的(pH为为7.0)12h装入装入放入放入透析透析磷酸缓冲液磷酸缓冲液步骤步骤目的目的过程过程纯纯化化凝胶色凝胶色谱柱制作谱柱制作通过凝胶色通过凝胶色谱操作，谱操作，根据根据 .分离蛋白分离蛋白质质(将相将相对分子质对分子质量大的杂量大的杂质蛋白除质蛋白除去去)取玻璃管取玻璃管制作柱底部制作柱底部制作柱顶部制作柱顶部凝胶色凝胶色谱柱的装谱柱的装填填固定色谱柱固定色谱柱计算所需计算所需凝胶量凝胶量凝胶用蒸馏凝胶用蒸馏水溶胀水溶胀装填装填洗涤洗涤平衡平衡样品的样品的加入和洗加入和洗脱脱调整缓冲液面调整缓冲液面滴加透滴加透析样品析样品样品渗入凝样品渗入凝胶床胶床洗脱洗脱收集收集相对分子相对分子质量的大小质量的大小步骤步骤目的目的过程过程纯度鉴定纯度鉴定判断纯化的蛋白判断纯化的蛋白质是否达到要质是否达到要求求使用最多的是使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳(操作选做操作选做)相相对对分分子子质质量量不不同同的的蛋蛋白白质质通通过过凝凝胶胶时时，相相对对分分子子质质量量较较小小的的容容易易进进入入凝凝胶胶内内部部的的通通道道，而而相相对对分分子子质质量量较较大大的的蛋蛋白白质质只只能能在在凝凝胶胶外外部部移移动动，移移动动速速度度快快，因因此此相相对对分分子子质质量量不不同同的的蛋白质分子彼此分离。蛋白质分子彼此分离。1.如如何何正正确确区区分分破破碎碎动动物物细细胞胞和和植植物物细细胞胞的的原原理理和方法？和方法？原理原理方法方法动物细动物细胞胞(鸡鸡血细血细胞胞)在低浓度溶在低浓度溶液中会吸液中会吸水甚至涨水甚至涨破破鸡血细胞液中加入一定量的蒸鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液过滤后收集滤液植物细植物细胞胞(洋洋葱细葱细胞胞)洗涤剂能够洗涤剂能够瓦解细胞瓦解细胞膜膜在切碎的洋葱中，加入一定的在切碎的洋葱中，加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研搅拌和研磨，过滤后收集研磨液磨液2.教教材材中中去去除除滤滤液液中中杂杂质质的的三三种种方方案案有有什么不同？什么不同？原理原理方法方法方方案案一一DNA在不同在不同浓度的浓度的NaCl溶液溶液中溶解度中溶解度不同不同在滤液中加入在滤液中加入2 mol/L NaCl溶液，溶液，过滤除去不溶杂质；再调节过滤除去不溶杂质；再调节NaCl溶液浓度为溶液浓度为0.14 mol/L，析出析出DNA，过滤除去不溶的杂，过滤除去不溶的杂质，再用质，再用2 mol/L NaCl溶液溶溶液溶解解DNA原理原理方法方法方方案案二二DNA对酶对酶的耐受的耐受性性直接在滤液中加入嫩肉粉，反应直接在滤液中加入嫩肉粉，反应1015 min，嫩肉粉中的木瓜蛋白，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质酶能够分解蛋白质方方案案三三DNA对高对高温的耐温的耐受性受性将滤液放在将滤液放在6075 的恒温水浴箱的恒温水浴箱中保温中保温1015 min，注意严格控，注意严格控制温度范围，使蛋白质沉淀而制温度范围，使蛋白质沉淀而DNA分子还未变性，可将分子还未变性，可将DNA与与蛋白质分离蛋白质分离3.如何区分如何区分DNA粗提取实验中部分操作的目的？粗提取实验中部分操作的目的？加蒸加蒸馏馏水水加到鸡血细胞液，使血细胞吸水胀裂加到鸡血细胞液，使血细胞吸水胀裂加到含加到含DNA的的2 mol/L NaCl溶液，使溶液，使DNA析出析出用纱用纱布布过过滤滤过滤血细胞破裂液，提取细胞核物质过滤血细胞破裂液，提取细胞核物质(滤液滤液)滤取滤取0.14 mol/L NaCl溶液中析出的溶液中析出的DNA(黏稠物黏稠物)过滤溶有过滤溶有DNA的的2 mol/L NaCl溶液溶液(滤液滤液)用用NaCl溶溶液液加加2 mol/L NaCl溶液，溶解提取的细胞核溶液，溶解提取的细胞核物质物质(加蒸馏水加蒸馏水)0.14 mol/L NaCl溶液使溶液使DNA析析出出加加2 mol/L NaCl溶液，溶解滤取的溶液，溶解滤取的DNA黏黏稠物稠物用用2 mol/L NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴溶液，溶解丝状物用于鉴定定DNA4.什什么么是是3端端和和5端端？DNA复复制制为为什什么么需需要要引引物物？为为了了明明确确地地表表示示DNA的的方方向向，通通常常将将DNA的的羟羟基基(OH)末末端端称称为为3端端，而而含含磷磷酸酸基基团团的的末末端端称称为为5端端；一一个个双双链链DNA分分子子中中含含2个个3端端和和2个个5端端，如如果果一一条条链链的的方方向向是是35，则则另另一一条条链链的的方方向向就就是是53，这就是反向平行的含意。，这就是反向平行的含意。DNA聚聚合合酶酶不不能能从从头头开开始始合合成成DNA，而而只只能能从从3端端延延伸伸DNA链链。PCR实实验验中中，引引物物长长度度通通常常为为2030个核苷酸。个核苷酸。5.PCR实实验验中中应应注注意意哪哪些些问问题题？如如何何进进行行PCR结结果的分析与评价？果的分析与评价？(1)PCR实验中的注意事项：实验中的注意事项：避避免免外外源源DNA污污染染：所所用用仪仪器器、缓缓冲冲液液、蒸蒸馏馏水等使用前进行高压灭菌。水等使用前进行高压灭菌。缓冲液和酶分装成小份，缓冲液和酶分装成小份，-20 低温保存。低温保存。每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。(2)PCR结果的分析与评价：结果的分析与评价：对对于于教教材材中中的的方方法法，可可以以通通过过计计算算DNA含含量量来来评价扩增的效果。评价扩增的效果。原原理理：DNA在在260 nm的的紫紫外外线线波波段段有有一一强强烈烈的的吸吸收收峰峰，峰值的大小与峰值的大小与DNA的含量有关。的含量有关。过程：稀释过程：稀释对照调零对照调零测定测定计算。计算。对对于于电电泳泳检检测测的的方方法法，可可以以通通过过在在紫紫外外线线下下直直接观察接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。扩扩增增不不成成功功的的可可能能原原因因有有：漏漏加加了了PCR的的反反应应成成分分，各各反反应应成成分分的的用用量量不不当当，PCR程程序序设设置置不不当当等。等。6.分分离离血血红红蛋蛋白白的的样样品品处处理理中中，红红细细胞胞洗洗涤涤时时为为什什么么要要低低速速短短时时间间离离心心，并并且且要要洗涤三次？洗涤三次？红红细细胞胞洗洗涤涤时时，洗洗涤涤次次数数、离离心心速速度度与与离离心心时时间间十十分分重重要要。洗洗涤涤次次数数过过少少，无无法法除除去去血血浆浆蛋蛋白白；离离心心速速度度过过高高和和时时间间过过长长会会使使白白细细胞胞等等一一起起沉沉淀淀，达达不不到到分分离离的的效效果果。洗洗涤涤三三次次后后，若若上上清清液液仍仍有有黄黄色色，可可增加洗涤次数，否则无法除去血浆蛋白。增加洗涤次数，否则无法除去血浆蛋白。7.凝凝胶胶色色谱谱柱柱的的装装填填有有什什么么要要求求？如如何何进进行样品的加入和洗脱？行样品的加入和洗脱？在在色色谱谱柱柱中中填填凝凝胶胶的的时时候候要要尽尽量量紧紧密密，以以降降低低凝凝胶胶颗颗粒粒之之间间的的空空隙隙。一一是是在在装装填填凝凝胶胶柱柱时时，不不能能有有气气泡泡存存在在，因因为为气气泡泡会会搅搅乱乱洗洗脱脱液液中中蛋蛋白白质质的的洗洗脱脱次次序序，降降低低分分离离效效果果。二二是是在在凝凝胶胶色色谱谱操操作作过过程程中中，不不能能发发生生洗洗脱脱液液流流干干，露露出出凝凝胶胶颗颗粒粒的的现现象象。一一旦旦发发生生上上述述两两种种情情况况，凝凝胶胶色色谱谱柱柱需需要要重新装填。重新装填。滴滴加加样样品品时时，吸吸管管管管口口贴贴着着管管壁壁环环绕绕移移动动加加样样，不不要要破破坏坏凝凝胶胶面面。在在蛋蛋白白质质分分离离过过程程中中，仔仔细细观观察察红红色色区区带带在在洗洗脱脱过过程程中中的的移移动动情情况况，如如果果红红色色区区带带均均匀匀一一致致地地移移动动，说说明明色色谱谱柱柱制制作作成成功功。根根据据红红色色区区带带的的移移动动状状况况判判断断收收集集流流出出液液时时间间，待待红红色色的的蛋蛋白白质质接接近近色色谱谱柱柱底底端端时时，用用试试管管收收集集流流出出液，每液，每5 mL 收集一管，连续收集。收集一管，连续收集。DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 下下表表是是关关于于DNA粗粗提提取取与与鉴鉴定定实实验验中中，所所使使用用的的材材料料、操操作作及及其其作作用用的的表表述述，正正确的是确的是()试剂试剂操作操作作用作用A柠檬酸柠檬酸钠溶钠溶液液与鸡血混合与鸡血混合防止防止DNA受损受损B蒸馏水蒸馏水与鸡血细胞混合与鸡血细胞混合保持细胞形状保持细胞形状C蒸馏水蒸馏水加入到溶解有加入到溶解有DNA的的NaCl溶液中溶液中析出析出DNA丝状丝状物物D冷却的冷却的酒精酒精加入到过滤后含加入到过滤后含DNA的的NaCl溶液中溶液中产生特定的颜产生特定的颜色反应色反应 C在在“DNA粗粗提提取取与与鉴鉴定定”实实验验中中柠柠檬檬酸酸钠钠可可以以防防止止血血液液凝凝固固；鸡鸡血血中中加加入入蒸蒸馏馏水水可可以以使使细细胞胞膜膜破破裂裂；DNA在在不不同同的的氯氯化化钠钠溶溶液液中中的的溶溶解解度度不不同同，在在0.14 mol/L 时时，溶溶解解度度最最低低，有有利利于于DNA析析出出；DNA不不溶溶于于酒酒精精，但但细细胞胞中中的的某某些些物物质质可可以以溶溶于于酒酒精精，所所以以加加入入酒酒精精，可可以以获获得得较较纯纯的的DNA；DNA遇遇二二苯苯胺胺产产生生蓝蓝色色反反应应(需需要要沸沸水浴加热水浴加热)。在在“DNA粗粗提提取取与与鉴鉴定定”的的实实验验中中，将将含含有有一一定定杂杂质质的的DNA丝丝状状物物分分别别放放入入体体积积为为2 mL 的的四四种种溶溶液液中中，经经搅搅拌拌后后过过滤滤，获获得得4种种滤滤液液，含含DNA较少的是较少的是()A.B.C.D.C1 蒸馏水中蒸馏水中搅拌后过滤搅拌后过滤 滤液滤液E2 2 mol/L 的的NaCl溶液溶液搅拌后过滤搅拌后过滤 滤液滤液F3 0.14 mol/L 的的NaCl溶液溶液中中搅拌后过滤搅拌后过滤 滤液滤液G4 冷却的冷却的95%的酒精溶液中的酒精溶液中 搅拌后过滤搅拌后过滤 滤液滤液HDNA在在不不同同浓浓度度的的NaCl溶溶液液中中溶溶解解度度不不同同，在在0.14 mol/L 的的NaCl溶溶液液中中溶溶解解度度最最低低，参参照照DNA在在NaCl溶溶液液中中溶溶解解度度曲曲线线，可可知知中中只只有有滤滤液液G中中DNA含含量量较较少少。DNA不不溶溶于于酒酒精精溶溶液液，但但细细胞胞中中的的某某些些蛋蛋白白质质则则溶溶于于酒酒精精，利利用用这这一一原原理理可可以以将将DNA与与蛋蛋白白质质进进一一步步分分离离，可可见见滤液滤液H中中DNA也较少。也较少。DNA与蛋白质的溶解性不同：与蛋白质的溶解性不同：溶解规律溶解规律2mol/LNaCl溶液溶液0.14mol/LNaCl溶液溶液DNA溶解溶解析出析出蛋蛋白白质质NaCl溶液浓度从溶液浓度从2 mol/L降低过程中，降低过程中，其溶解度逐渐增其溶解度逐渐增大大部分发生盐部分发生盐析沉淀析沉淀溶解溶解多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNA片段片段 关关于于DNA的的复复制制，下下列列叙叙述述正正确确的的是是()A.DNA聚聚合合酶酶不不能能从从头头开开始始合合成成DNA，只能从只能从5端延伸端延伸DNA链链B.DNA复制不需要引物复制不需要引物C.引引物物与与DNA母母链链通通过过碱碱基基互互补补配配对对进进行结合行结合D.DNA的的合合成成方方向向总总是是从从子子链链的的3端端向向5端延伸端延伸 C由由于于DNA聚聚合合酶酶不不能能从从头头开开始始合合成成DNA，只只能能从从引引物物的的3端端即即复复制制方方向向由由3端端向向5端端延延伸伸；由由于于DNA分分子子是是反反向向平平行行的的，子子链链是是依依据据碱碱基基互互补补配配对对原原则则，在在DNA聚聚合合酶酶作作用用下下合合成成的的，其其合合成成方方向是从子链向是从子链5端向端向3端延伸。端延伸。下下图图示示PCR技技术术扩扩增增获获取取DNA的的过过程程。扩扩增增时时首首先先使使DNA两两条条链链解解开开为为单单链链；然然后后冷冷却却使使“引引物物”(DNA复复制制时时所所需需的的约约20个个核核苷苷酸酸的的短短链链)与与单单链链相相应应碱碱基基互互补补序序列列结结合合；再再在在热热稳稳定定DNA聚聚合合酶酶的的作作用用下下进进行行延延伸伸，合合成成与与模模板板互互补补的的DNA新新链链，如如此反复循环。上述过程可在此反复循环。上述过程可在PCR扩增仪中自动完成。扩增仪中自动完成。(1)图图中中过过程程也也称称为为DNA的的变变性性，此此过过程程在在温温度度高高达达9095 时时才才能能完完成成，说说明明DNA分子具有分子具有性。性。(2)过程在人体内可由过程在人体内可由.催化完成。催化完成。(3)由由题题中中信信息息可可知知，在在PCR扩扩增增仪仪中中进进行行DNA自自动动扩扩增增时时，若若起起始始时时有有a个个DNA分分子子，连连续续扩扩增增n代代，可可形形成成个个DNA分子。分子。稳定稳定DNA聚合酶聚合酶(DNAa2n聚合酶、聚合酶、DNA连接酶连接酶)DNA比比蛋蛋白白质质更更能能忍忍受受高高温温，分分子子结结构构具具有有相相对对的的稳稳定定性性，其其中中GC碱碱基基对对占占比比例例越越高高的的DNA分分子子越越稳稳定定。为为延延伸伸过过程程，在在体体外外扩扩增增是是耐耐高高温温的的DNA聚聚合合酶酶催催化化，在在体体内内是是由由DNA聚聚合合酶酶催催化化完完成成。依据起始依据起始a个以及个以及DNA扩增呈指数增长，可得答案。扩增呈指数增长，可得答案。PCR一一般般要要经经历历三三十十多多次次循循环环，每每次次循循环环都都包包括括变变性性、复复性性、延延伸伸三三步步。两两引引物物之之间间的的固固定定长长度度的的DNA序列呈指数扩增。序列呈指数扩增。血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离 蛋蛋白白质质的的分分离离与与纯纯化化技技术术是是蛋蛋白白质质研研究究的的重重要技术。下列有关叙述不正确的是要技术。下列有关叙述不正确的是()A.根根据据蛋蛋白白质质分分子子不不能能透透过过半半透透膜膜的的特特性性，可可将样品中各种不同的蛋白质分离将样品中各种不同的蛋白质分离B.根根据据蛋蛋白白质质所所带带电电荷荷性性质质的的差差异异及及分分子子大大小小等，可通过电泳分离蛋白质等，可通过电泳分离蛋白质C.根根据据蛋蛋白白质质相相对对分分子子质质量量的的大大小小，可可通通过过凝凝胶色谱法分离蛋白质胶色谱法分离蛋白质D.根根据据蛋蛋白白质质的的分分子子大大小小、密密度度不不同同，可可通通过过离心沉降法分离蛋白质离心沉降法分离蛋白质 AA项项蛋蛋白白质质分分子子既既然然不不能能透透过过半半透透膜膜，那那样样品品中中的的各各种种不不同同的的蛋蛋白白质质仍仍在在透透析析袋袋内内，而而不不能能达达到到分分离离的的目目的的。B正正确确：电电泳泳利利用用了了分分离离样样品品中中各各种种分分子子带带电电性性质质的的差差异异以以及及分分子子本本身身的的大大小小、形形状状不不同同，使使带带电电分分子子产产生生不不同同的的迁迁移移速速度度，从从而而实实现现样样品品中中各各种种分分子子的的分分离离。C正正确确：凝凝胶胶色色谱谱法法也也称称作作分分配配色色谱谱法法，是是根根据据相相对对分分子子质质量量的的大大小小分分离离蛋蛋白白质质的的有有效效方方法法。D正正确确：根根据据蛋蛋白白质质的的分分子子大大小小、密密度度不不同同，可可通通过过离离心心沉沉降降法法分分离离蛋蛋白白质质，分子大、密度大的在沉淀物中。分子大、密度大的在沉淀物中。下列叙述错误的是下列叙述错误的是()A.在在一一定定范范围围内内，缓缓冲冲溶溶液液能能够够抵抵制制外外界界的的酸酸和和碱碱对对溶溶液液pH的的影影响响，维维持持pH基基本不变本不变B.电电泳泳是是指指带带电电粒粒子子在在电电场场的的作作用用下下发发生迁移的过程生迁移的过程C.洗洗涤涤红红细细胞胞时时，用用五五倍倍体体积积的的蒸蒸馏馏水水充分冲洗充分冲洗D.缓缓冲冲溶溶液液通通常常由由12种种缓缓冲冲剂剂溶溶解解于于水中配制而成水中配制而成C洗洗涤涤红红细细胞胞时时，应应是是加加入入五五倍倍体体积积的的生生理理盐盐水水，以以维维持持红红细细胞胞的的正正常常形形态和结构。态和结构。血血液液样样品品处处理理后后，若若分分层层不不明明显显，原原因因有有：洗洗涤涤次次数数少少，未未能能除除去去血血浆蛋白；浆蛋白；离心速度过高和时间过长。离心速度过高和时间过长。p经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量pStudyConstantly,AndYouWillKnowEverything.TheMoreYouKnow,TheMorePowerfulYouWillBe写在最后Thank You在别人的演说中思考，在自己的故事里成长Thinking In Other PeopleS Speeches，Growing Up In Your Own Story讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
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