第五章毛细管电泳

第五章第五章 毛细管电泳法毛细管电泳法High performance capillary High performance capillary electrophoresiselectrophoresis毛细管电泳的基本概念及主要应用毛细管电泳的基本概念及主要应用毛细管电泳毛细管电泳 毛细管电泳毛细管电泳 指一系列以内径指一系列以内径10 10 200m200m的毛细管柱为分的毛细管柱为分离通道，以离通道，以高压直流电高压直流电为分离动力对大分子和小为分离动力对大分子和小分子等进行高效分离和检测的有关技术的统称分子等进行高效分离和检测的有关技术的统称 毛细管电泳和传统电泳的区别毛细管电泳和传统电泳的区别 传统的电泳是在平板凝胶的两端加上一定的电传统的电泳是在平板凝胶的两端加上一定的电压使组分分离压使组分分离 毛细管电泳是在毛细管电泳是在散热效率散热效率极高的毛细管内进行，极高的毛细管内进行，它可以加上它可以加上 0 0 30 KV 30 KV 的高电压进行分离，达的高电压进行分离，达到快速、高效到快速、高效毛细管电泳的特点毛细管电泳的特点毛细管的特点毛细管的特点 容积小，以容积小，以100100长、长、75m75m内径的毛细管计，容内径的毛细管计，容积仅为积仅为4.4 l4.4 l 侧面侧面/截面积比大，使毛细管散热快，能承受截面积比大，使毛细管散热快，能承受100 100 1000V/cm1000V/cm的高电场的高电场 能使用自由溶液、凝胶等作为支持介质能使用自由溶液、凝胶等作为支持介质 在溶液介质下能产生平面形状的电渗流在溶液介质下能产生平面形状的电渗流毛细管电泳的特点毛细管电泳的特点(续）续）毛细管电泳的特点毛细管电泳的特点 高效：区带电泳中，柱效一般为几十万高效：区带电泳中，柱效一般为几十万几几百万理论塔扳百万理论塔扳/米米 快速：多数分析在快速：多数分析在1010分钟内完成，有的可分钟内完成，有的可以在以在6060秒内完成秒内完成 高灵敏度：高灵敏度：紫外检测器紫外检测器 1010-13-131010-15-15molmol 荧光检测器荧光检测器 1010-19-191010-21-21molmol 微量：微量：进样量进样量 1 110 10 nLnL 样品量样品量 5ul5ul5 5 mLmL 检测检测 :在线检测在线检测毛细管电泳的特点（续）毛细管电泳的特点（续）重现性重现性:迁移时间迁移时间 0.5%0.5%经济：实验消耗不过几经济：实验消耗不过几mlml缓冲液，没有泵输缓冲液，没有泵输送系统送系统 样品对象广：从无机离子到整个细胞，具有包样品对象广：从无机离子到整个细胞，具有包罗罗“万能万能”的分析功能和潜力的分析功能和潜力 自动：自动：CECE是目前自动化程度最高的分离方法是目前自动化程度最高的分离方法 自动进样，缓冲液交换，数据处理 洁净：洁净：毛细管电泳与平板凝胶电泳的比较毛细管电泳与平板凝胶电泳的比较毛细管电泳与毛细管电泳与HPLCHPLC的比较的比较相同之处：相同之处：1.1.快速高效分离技术快速高效分离技术2.2.可定量可定量3.3.全自动化全自动化4.4.可用不同模式可用不同模式5.5.在许多领域逐步取代在许多领域逐步取代HPLCHPLC毛细管电泳与毛细管电泳与HPLCHPLC的比较的比较毛细管电泳的主要应用毛细管电泳的主要应用 手性化合物手性化合物 碱性药物分子碱性药物分子 法医毒物法医毒物/临床毒理临床毒理 蛋白质蛋白质/多肽多肽/氨基酸氨基酸 糖类糖类/糖蛋白糖蛋白 核酸核酸/核苷酸核苷酸 无机及有机离子无机及有机离子/有机酸有机酸 其它小分子其它小分子 水溶液中分子间的相互作用水溶液中分子间的相互作用 单细胞分析单细胞分析 药物与细胞的相互作用药物与细胞的相互作用分析与微量制备手性手性/异构体拆分异构体拆分 方法简单化方法简单化 改善分辨率改善分辨率 快速快速 成本降低成本降低 方法开发过程简单方法开发过程简单碱性药物分析碱性药物分析1919种混合碱性药物的质量种混合碱性药物的质量控制分析控制分析在其它药物分析中的应用在其它药物分析中的应用 主成分的定量测定主成分的定量测定 痕量杂质检测痕量杂质检测 中药材成分分析中药材成分分析/指纹图谱指纹图谱 中药复方制剂中化学成分测定中药复方制剂中化学成分测定 药物计量离子配比测定药物计量离子配比测定 药物代谢产物测定药物代谢产物测定 药物与蛋白质的相互作用研究药物与蛋白质的相互作用研究 滥用药物测定滥用药物测定 药厂质控药厂质控在蛋白质和多肽分析中的应用在蛋白质和多肽分析中的应用 肽、蛋白和糖蛋白的鉴别肽、蛋白和糖蛋白的鉴别 结构分析结构分析 纯度检测纯度检测 非均一性、多样性研究非均一性、多样性研究 稳定性研究稳定性研究 结合和动力学研究结合和动力学研究 定量测定定量测定 等电点测定等电点测定 蛋白质和多肽的质量控制蛋白质和多肽的质量控制 微量制备微量制备在糖类在糖类/糖蛋白中的应用糖蛋白中的应用 多糖谱图的制定多糖谱图的制定 水化合物分离及测定水化合物分离及测定 蛋白分析蛋白分析 构体分析构体分析 糖脂研究糖脂研究在核酸在核酸/核苷酸分析中的应用核苷酸分析中的应用 核酸、基因疫苗的质量控制核酸、基因疫苗的质量控制 碱基、核苷和核苷酸的分析碱基、核苷和核苷酸的分析 纯度检测、片段收集和微量制备纯度检测、片段收集和微量制备 PCRPCR产物分析和产物分析和dsDNAdsDNA分析分析 蛋白质蛋白质-DNA-DNA相互作用测定相互作用测定 基因突变测定基因突变测定 基因表达测定基因表达测定 DNADNA序列测定序列测定(CEQ2000XL)(CEQ2000XL)在临床医学中的应用在临床医学中的应用 临床疾病诊断临床疾病诊断 临床蛋白分析临床蛋白分析 基因诊断基因诊断 病毒检测病毒检测 临床药物检测临床药物检测 药物代谢研究药物代谢研究 临床分子生物学测定临床分子生物学测定 毒物、滥用药物测定毒物、滥用药物测定CE/MS/MSCE/MS/MS联用技术及应用联用技术及应用 药物的结构药物的结构 药物及其代谢产物分析药物及其代谢产物分析 蛋白质和多肽结构蛋白质和多肽结构 蛋白质酶解产物测定蛋白质酶解产物测定 核苷酸、核苷酸、DNADNA结构结构 其它领域的应用其它领域的应用在其它工业领域中的应用在其它工业领域中的应用 药品纯度及杂质检测药品纯度及杂质检测 石油化工产品杂质监测石油化工产品杂质监测 食品中有机酸检测及矿物食品中有机酸检测及矿物质分析质分析 环境污染物分析环境污染物分析 金属阴和阳离子、无机离金属阴和阳离子、无机离子检测子检测 烟草中成分检测烟草中成分检测 纺织染料的测定纺织染料的测定 表面活性剂测定表面活性剂测定毛细管电泳存在问题毛细管电泳存在问题 使用了小管径的毛细管，制备能力差使用了小管径的毛细管，制备能力差 光路短，要用高灵敏度的检测器检测样品光路短，要用高灵敏度的检测器检测样品 凝胶、色谱填充管要用专门的灌制技术凝胶、色谱填充管要用专门的灌制技术 大的侧面大的侧面/截面积比会截面积比会“放大放大”吸附的作用，导吸附的作用，导致蛋白质等的分离效率下降或无峰致蛋白质等的分离效率下降或无峰 吸附会引起电渗的变化，进而影响分离重现性吸附会引起电渗的变化，进而影响分离重现性毛细管电泳与毛细管电泳与HPLCHPLC的互补结合应用的互补结合应用 逐步代替许多逐步代替许多HPLC HPLC 的功能的功能 手性拆分、蛋白质分析、碱性药物、手性拆分、蛋白质分析、碱性药物、DNADNA分析、毛细管电泳中药指纹图谱、分析、毛细管电泳中药指纹图谱、药物的质量控制、杂质测定药物的质量控制、杂质测定 在制备功能上是互补的：在制备功能上是互补的：HPLC HPLC 强调较大的制备量强调较大的制备量 CE CE 强调可获得极高的纯度强调可获得极高的纯度基本理论基本理论分离原理分离原理 高效毛细管电泳是离子或荷电粒子以电场为驱动力，高效毛细管电泳是离子或荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按淌度或在毛细管中按淌度或/和分配系数不同进行高效和分配系数不同进行高效,快速分离快速分离的一种电泳新技术的一种电泳新技术例：以应用最多的毛细管区带电泳（例：以应用最多的毛细管区带电泳（CZECZE）为例为例 在移动过程中，由于样品组分间的淌度不同，它们在移动过程中，由于样品组分间的淌度不同，它们的迁移速度不同，所以经过一定时间后，各组分就按的迁移速度不同，所以经过一定时间后，各组分就按其速度或淌度的大小顺序，依次到达检测器检测窗口其速度或淌度的大小顺序，依次到达检测器检测窗口被检出，这样就可以得到按时间荷响应值（被检出，这样就可以得到按时间荷响应值（A A）分布的分布的电泳谱图电泳谱图 分离原理分离原理 毛细管和电泳毛细管和电泳槽中充有相同组分槽中充有相同组分和相同浓度的背景和相同浓度的背景电介质溶液，样品电介质溶液，样品从毛细管的进样端从毛细管的进样端导入。当毛细管两导入。当毛细管两端加上一定的电压端加上一定的电压后，荷电溶质便朝后，荷电溶质便朝着与其电荷极性相着与其电荷极性相反的电极方向移动。反的电极方向移动。毛细管电泳预备知识毛细管电泳预备知识偶电层偶电层和和ZetaZeta电势电势 偶电层是浸没在液体中的所有表面都具备的一种特性，偶电层是浸没在液体中的所有表面都具备的一种特性，通常是指两相之间的分离表面由相对固定和游离的两部分离子通常是指两相之间的分离表面由相对固定和游离的两部分离子组成的与表面电荷异号的离子层组成的与表面电荷异号的离子层 按照近代偶电层模型，在偶电层溶液一侧由两层组成：按照近代偶电层模型，在偶电层溶液一侧由两层组成：第一层：吸附层，又称为第一层：吸附层，又称为斯特恩斯特恩（Stern Stern）层或层或 紧密层（紧密层（Compact layerCompact layer）第二层：扩散层第二层：扩散层diffuse layerdiffuse layer 00为表面电势为表面电势 ，它，它在在sternstern层中线性地降到层中线性地降到dd，它是，它是sternstern面和面和溶液内部的电势差，和特性吸附离子的性质和数量溶液内部的电势差，和特性吸附离子的性质和数量有关。在有关。在sternstern面外面外侧侧很近的地方有一剪切面，是紧贴在固相很近的地方有一剪切面，是紧贴在固相表面粘度迅速变化的区域，我们把剪切面上的电势称为表面粘度迅速变化的区域，我们把剪切面上的电势称为zetazeta（）电势，其值略低于电势，其值略低于dd，公式计公式计 式中：式中：ee溶液中每单位面积总溶液中每单位面积总 的过剩电荷的过剩电荷 介质的介电常数介质的介电常数 -扩散层的厚度，它和电扩散层的厚度，它和电 介质浓度（介质浓度（C C）有关，有关，确切地说，和溶液的离子确切地说，和溶液的离子 强度有关强度有关毛细管电泳中的毛细管电泳中的zetazeta电势电势第一种：毛细管壁上第一种：毛细管壁上的的zetazeta电势电势 熔硅毛细管表面上的熔硅毛细管表面上的zetazeta电势正比于它表电势正比于它表面上的电荷数与对离子层厚度的乘积，但电面上的电荷数与对离子层厚度的乘积，但电荷数和对离子层厚度又会受到对离子的性质、荷数和对离子层厚度又会受到对离子的性质、缓冲液的缓冲液的pHpH、缓冲液中阳离子和熔硅基表面缓冲液中阳离子和熔硅基表面间的平衡等因素的影响。间的平衡等因素的影响。对于熔硅或聚四氟乙烯材质的毛细管，管对于熔硅或聚四氟乙烯材质的毛细管，管壁上壁上的的zetazeta电势是毛细管电泳中的一个重要电势是毛细管电泳中的一个重要参数，对控制电渗流、优化毛细管分离有重参数，对控制电渗流、优化毛细管分离有重要意义。要意义。毛细管电泳中的毛细管电泳中的zetazeta电势电势第二种：荷电粒子表面上的第二种：荷电粒子表面上的zetazeta电势电势 在电介质中，任何带电粒子都可以被看成在电介质中，任何带电粒子都可以被看成是一个偶电层系统的一部分。在这个系统中，是一个偶电层系统的一部分。在这个系统中，粒子自身的电荷被异号的带电离子中和，这些粒子自身的电荷被异号的带电离子中和，这些异号离子中有一些被不可逆地吸附到粒子上，异号离子中有一些被不可逆地吸附到粒子上，而另一些则游离在附近，并扩散到电介质中进而另一些则游离在附近，并扩散到电介质中进行离子交换。行离子交换。“固定固定”离子有一个切平面，它离子有一个切平面，它和离得最近的游离离子间的电势称为粒子的和离得最近的游离离子间的电势称为粒子的zetazeta电势。电势。电泳电泳 在半导体中，荷电粒子在外电场作用下的泳在半导体中，荷电粒子在外电场作用下的泳动现象称为电泳（动现象称为电泳（electrophoresiselectrophoresis）.带电粒子在电场中受到向前的带电粒子在电场中受到向前的力力F F F=qE F=qE 同时，带电粒子受到粘滞阻力同时，带电粒子受到粘滞阻力FF F=f u F=f u 当当F=F F=F，粒子以稳态速度运动，有：粒子以稳态速度运动，有：u=u=qE/fqE/f对于球形粒子，对于球形粒子，f f由由stokesstokes定律给出，定律给出，f=6f=6 r,r,有：有：电泳（续）电泳（续）根据上式，电泳速度是和外加电场有关，所根据上式，电泳速度是和外加电场有关，所以电泳中常用以电泳中常用淌度淌度（mobility,mobility,）来描述荷电粒来描述荷电粒子的电泳行为和特性子的电泳行为和特性.电泳淌度（电泳淌度（epep）定义：单位场强下离子的定义：单位场强下离子的平均电泳速度平均电泳速度 影响荷电粒子在电场中的迁移速度的因素有：影响荷电粒子在电场中的迁移速度的因素有：电场强度、电场强度、介质性质、介质性质、粒子的荷电情况、粒子的荷电情况、粒子的大小和形状粒子的大小和形状电渗（电渗（electroosmoticelectroosmotic flow,EOF flow,EOF）电电渗流是渗流是一种液体相对于带电的管壁移动的一种液体相对于带电的管壁移动的现象。现象。在毛细管电泳里在所指的在毛细管电泳里在所指的电渗电渗是：在高电是：在高电压下，溶液中的正电荷与毛细管管壁表面的负压下，溶液中的正电荷与毛细管管壁表面的负电荷之间作用，引起流体朝负极方向运动的现电荷之间作用，引起流体朝负极方向运动的现象。象。和电泳淌度相似，电渗淌度（和电泳淌度相似，电渗淌度（eoeo ）可）可表示为：表示为：在普通的毛细管区带电泳条件下，电渗在普通的毛细管区带电泳条件下，电渗流从阳极流向阴极，大小受到流从阳极流向阴极，大小受到ZetaZeta电势、偶电势、偶电层厚度、介质粘度的影响，一般电势愈大、电层厚度、介质粘度的影响，一般电势愈大、偶电层愈薄、粘度愈小，电渗流值就愈大。偶电层愈薄、粘度愈小，电渗流值就愈大。通常，通常，渗流速度是泳流速度渗流速度是泳流速度5 57 7倍倍 电渗（续）电渗（续）粒子在毛细管中同时受到泳流和渗流两粒子在毛细管中同时受到泳流和渗流两种运动速度的影响，粒子在毛细管电介质的种运动速度的影响，粒子在毛细管电介质的运动速度应该是两种速度的矢量和：运动速度应该是两种速度的矢量和：令令app=app=epep+eoeo为表现淌度为表现淌度（apparent apparent mobilitymobility）或净淌度或净淌度(net mobility)(net mobility)电渗（续）电渗（续）从毛细管电泳测量中得到的淌度应为粒子自身从毛细管电泳测量中得到的淌度应为粒子自身的电泳淌度和由电渗引起的淌度的矢量和：的电泳淌度和由电渗引起的淌度的矢量和：式中：式中：Ld-Ld-毛细管从进样口到检测器的距离毛细管从进样口到检测器的距离 tm-tm-粒子通过毛细管到达检测器的时间粒子通过毛细管到达检测器的时间 Lt-Lt-毛细管柱长，毛细管柱长，V-V-电压电压粒子的表观淌度粒子的表观淌度电渗（续）电渗（续）各带电离子在毛细管中的流出顺序为：各带电离子在毛细管中的流出顺序为：正正 离离 子子运动方向与电渗一致运动方向与电渗一致 中性粒子中性粒子泳流速度为零，随电渗而行泳流速度为零，随电渗而行 负负 离离 子子运动方向与电渗相反，当运动方向与电渗相反，当eoeo epep时，最后流出，否则无法流出时，最后流出，否则无法流出结论：结论：只有当电渗速度的绝对值大于所有负离子泳流只有当电渗速度的绝对值大于所有负离子泳流速度的绝对值时，混合物中的所有组分才将向一个速度的绝对值时，混合物中的所有组分才将向一个方向迁移，才能检测出所有组分方向迁移，才能检测出所有组分电渗（续）电渗（续）通过以上讨论可得：通过以上讨论可得：表现淌度表现淌度appapp可以从毛细管电泳的测量结果求得可以从毛细管电泳的测量结果求得 电渗淌度电渗淌度eoeo可以用中性粒子按同样的方法测得可以用中性粒子按同样的方法测得 电泳淌度电泳淌度epep带电粒子的电泳淌度可用中性粒子带电粒子的电泳淌度可用中性粒子为参照从式中求得为参照从式中求得毛细管电泳流型毛细管电泳流型 毛细管电泳是属于电驱动系统，在毛细管中毛细管电泳是属于电驱动系统，在毛细管中流体的流型呈扁平型的塞子向前流动。流体的流型呈扁平型的塞子向前流动。毛细管电泳的分类及主要应用方向毛细管电泳的分类及主要应用方向按分离机理分：按分离机理分：毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（CZECZE）毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGECGE）毛细管等电聚焦（毛细管等电聚焦（CIEFCIEF）毛细管电动色谱（毛细管电动色谱（EKCEKC）毛细管胶束电动色谱毛细管胶束电动色谱（MECCMECC）毛细管电色谱（毛细管电色谱（CECCEC）毛细管等速电泳（毛细管等速电泳（CITPCITP）亲和毛细管电泳（亲和毛细管电泳（ACEACE）非水相毛细管电泳（非水相毛细管电泳（NACE)NACE)各种电泳的主要应用方向各种电泳的主要应用方向小型离子小型离子:CZE CITP:CZE CITP 小分子小分子:MECC CZE CITP:MECC CZE CITP肽类肽类 :CZE MECC CIEF CITP CGE:CZE MECC CIEF CITP CGE蛋白质蛋白质:CZE CGE CIEF CITP:CZE CGE CIEF CITP低聚核苷酸低聚核苷酸 :CGE MEKC:CGE MEKCDNA:CGEDNA:CGE毛毛细细管管电电泳泳仪仪毛细管电泳仪的基本结构毛细管电泳仪的基本结构 毛细管电泳系统包括：进样、填毛细管电泳系统包括：进样、填灌灌/清洗、电流回清洗、电流回路、毛细管路、毛细管/温度控制、检测温度控制、检测/记录记录/数据处理等部分数据处理等部分 毛细管电泳仪的性能毛细管电泳仪的性能 多种灵活的分离模式多种灵活的分离模式 电压、电流、功电压、电流、功率、压力和真空率、压力和真空可恒压、恒流、可恒压、恒流、恒功率或梯度编程恒功率或梯度编程可压力与电压、可压力与电压、电流、功率的组合电流、功率的组合可程序控制切换可程序控制切换极性极性毛细管电泳仪的性能毛细管电泳仪的性能 控温范围宽，至少应能够在控温范围宽，至少应能够在20204040内恒温内恒温 可选择的样品温度控制系统可选择的样品温度控制系统 半导体的温控系统可供选择半导体的温控系统可供选择 样品温度控制与缓冲液的温度控制分开样品温度控制与缓冲液的温度控制分开 样品量可达样品量可达192192个个 恒温精度能到达恒温精度能到达0.1 0.1 毛细管电泳仪的性能毛细管电泳仪的性能准确、自动的进样系统性准确、自动的进样系统性 具有精确的进样控制和校正系统，进样量准确具有精确的进样控制和校正系统，进样量准确 可直接从可直接从9696孔样品板上自动进样，也可从孔样品板上自动进样，也可从2ml2ml或或0.5ml0.5ml或或PCRPCR试管中进样试管中进样 可电动、压力、真空或三者组合进样可电动、压力、真空或三者组合进样 可从毛细管两端的任一端进样可从毛细管两端的任一端进样 进样后，有等待功能进样后，有等待功能 毛细管电泳仪的性能毛细管电泳仪的性能最佳的缓冲液供给系统最佳的缓冲液供给系统 可容纳可容纳3636种缓冲液种缓冲液组合功能组合功能 缓冲液的温度控制缓冲液的温度控制与样品的温度控制分开与样品的温度控制分开 还有备选的还有备选的4 x 25 4 x 25 ml ml 的大容量缓冲液瓶可的大容量缓冲液瓶可供选择供选择毛细管电泳仪的性能毛细管电泳仪的性能 配备性能优良的检测器，以满足不同的应用配备性能优良的检测器，以满足不同的应用 二极管阵列检测器（二极管阵列检测器（DADDAD）紫外检测器（紫外检测器（UV/VISUV/VIS）激光诱导荧光检测器（激光诱导荧光检测器（LIFLIF）通用型外部接口（通用型外部接口（EDAEDA），），连接连接 串联串联质谱检测器（质谱检测器（MS/MSMS/MS）电导检测器（电导检测器（ConductivityConductivity）等等进样进样 进样必须满足的要求：进样必须满足的要求：进样时不能引入显著的区带扩张进样时不能引入显著的区带扩张 样品的量必须小于样品的量必须小于100nl100nl，否则会引起过载否则会引起过载 进样方式进样方式 真空进样真空进样 电进样电进样 压力进样压力进样进样进样-电动进样（电迁移进样）电动进样（电迁移进样）电动进样属于普适性方法，是凝胶电泳进样唯一电动进样属于普适性方法，是凝胶电泳进样唯一的方法的方法 缺点：对离子组分存在进样偏向，即进样歧视缺点：对离子组分存在进样偏向，即进样歧视 进样进样-压力进样压力进样方法方法：压力进样也叫压力进样也叫流动进样，要求毛细管流动进样，要求毛细管中的填充介质具有流动中的填充介质具有流动性，也即当把毛细管的性，也即当把毛细管的两端置于不同的压力环两端置于不同的压力环境中时，管中溶液即能境中时，管中溶液即能流动，将样品带入。流动，将样品带入。进样进样-压力进压力进样样 三种方式：三种方式：正压正压 负压（管尾抽吸）负压（管尾抽吸）重力（虹吸）重力（虹吸）正压进样的优点正压进样的优点 进样过程中没有组分歧视，进样过程中没有组分歧视，在严格控制样品的粘度和温度下，进入毛细在严格控制样品的粘度和温度下，进入毛细管的量是固定的管的量是固定的检测检测器器紫外检测紫外检测 (UV/VIS)(UV/VIS)二极管阵列检测二极管阵列检测 (UV/VIS DAD)(UV/VIS DAD)激光诱导荧光检测激光诱导荧光检测 (LIF)(LIF)间接检测间接检测 (Indirect Detection)(Indirect Detection)电化学检测电化学检测 质谱检测质谱检测 (CE-MS/MS)(CE-MS/MS)化学发光检测化学发光检测紫外检测光路图紫外检测光路图二极管阵列检测器二极管阵列检测器间接检测法间接检测法 CECE间接检测法中，信号不是来自样品本身，间接检测法中，信号不是来自样品本身，而是来自背景电解质离子而是来自背景电解质离子(缓冲溶液或加入其缓冲溶液或加入其中的添加剂离子中的添加剂离子)。样品溶质在毛细管样品溶质在毛细管中迁移时，为了保持中迁移时，为了保持局部区域的电荷平衡，局部区域的电荷平衡，要求置换同电荷离子，要求置换同电荷离子，即在区带内产生电荷即在区带内产生电荷的物理置换，使背景的物理置换，使背景电解质离子浓度降低，电解质离子浓度降低，从而产生背景信号减从而产生背景信号减弱。通过相对于稳态弱。通过相对于稳态时背景信号的减弱时背景信号的减弱(负负峰峰)进行样品溶质的间进行样品溶质的间接测定。接测定。间接检测法间接检测法特点：特点：不要求分析物具有能被检测的信号特性，如不要求分析物具有能被检测的信号特性，如光的吸收、发射、碎灭及电化学活性等光的吸收、发射、碎灭及电化学活性等 是一种近于通用性的检测方法，非常适合于是一种近于通用性的检测方法，非常适合于无机离子、有机小分子、氨基酸和糖类化合无机离子、有机小分子、氨基酸和糖类化合物等的检测物等的检测 不需要柱前或柱后衍生，分析物没有发生不需要柱前或柱后衍生，分析物没有发生化学变化，是非破坏性检测，便于组分收集化学变化，是非破坏性检测，便于组分收集后作进一步研究后作进一步研究 间接检测间接检测法法 测定的机理是物理置换，可以根据所用仪器的类型测定的机理是物理置换，可以根据所用仪器的类型来选择背景电解质离子来选择背景电解质离子(如吸收波长、电极电位等如吸收波长、电极电位等)由于间接法是在强背景信号下测定信号的微弱变化，由于间接法是在强背景信号下测定信号的微弱变化，灵敏度没有相应的直接测定法高灵敏度没有相应的直接测定法高 基线噪声大，存在基线漂移和较大扰动等缺点基线噪声大，存在基线漂移和较大扰动等缺点 具有具有通用性，对杂质也较敏感通用性，对杂质也较敏感 采用的间接检测法有采用的间接检测法有：间接吸收法、间接荧光法、间接吸收法、间接荧光法、间接电化学法、间接化学发光法间接电化学法、间接化学发光法CECE检测器的检测限及其特点检测器的检测限及其特点毛细管区带电泳毛细管区带电泳毛细管区带电泳毛细管区带电泳-分分离离原理原理 样样品在品在电电解液中泳解液中泳动动,根根据据物物质的荷质的荷/质比（质比（chargecharge/massmass比比值）差值）差异来进异来进行分行分离离，比值愈大，比值愈大,跑得愈快。跑得愈快。Capillary Zone Electrophoresis毛细管区带电泳毛细管区带电泳-分分离离原理原理毛细管区带电泳毛细管区带电泳-分分离离原理原理 特特点点 可使用可使用凃层凃层或未或未凃层的凃层的毛毛细细管管 避免避免样样品吸附品吸附 抑制抑制电渗电渗透流透流 毛毛细细管中除管中除电电解解质质外外,无无需填充任何需填充任何物质物质 使用未使用未凃层的毛细管进行分离时凃层的毛细管进行分离时,不不仅仅是正是正电荷，电荷，包括无电荷包括无电荷及及负电荷物质负电荷物质都會向都會向负电负电极极移移动动(因因为电渗为电渗流流),),所以可所以可同时检测同时检测正正电荷电荷、负电荷负电荷及中性物及中性物质质 以以电解质电解质之之pHpH值、值、离子浓度离子浓度、温度温度、毛细管电泳毛细管电泳及及电压电压大小大小来来控制分控制分离状态离状态 毛细管区带电泳毛细管区带电泳-分分离离原理原理 主要主要应应用用 蛋白蛋白质质、多肽多肽及帶及帶电电荷荷的的大小分子大小分子 可取代可取代传统电泳传统电泳及及离子交换离子交换HPLCHPLC胶束电动毛细管电泳胶束电动毛细管电泳胶束电动毛细管电泳胶束电动毛细管电泳-分离设想分离设想 电解质电解质中加入中加入表表面活性面活性剂剂,使使之之形成形成胶束，样胶束，样品根品根据据疏水性疏水性的强弱的的强弱的差差异异，在在胶束与胶束与电解质电解质的的分配系分配系数数有所不同有所不同,來來进进行分行分离离 样品样品疏水性愈強疏水性愈強,则进则进入入胶束胶束的的机会机会愈大愈大 通常通常物质进物质进入入胶束后胶束后,泳泳动动的速度的速度会变会变慢慢,因此因此疏水性愈強的物疏水性愈強的物质质則愈慢出來則愈慢出來胶束电动毛细管电泳胶束电动毛细管电泳-特特点及点及主要主要应应用用 根根据据分子之疏水性及分子之疏水性及亲亲水性水性的的強弱差強弱差异进异进行分行分离离 可分可分离离不帶不帶电电荷荷的物质的物质,疏水性強的物疏水性強的物质质或或电电荷荷/质量质量比值相近之比值相近之物质物质 对样品分子大小有限制，要求分子量小于对样品分子大小有限制，要求分子量小于50005000（CZECZE则没有此限制）则没有此限制）药药物分析、物分析、环境环境污染物分析及其他小分子污染物分析及其他小分子物质物质 可取代可取代反反相相HPLCHPLC分离原理分离原理 被分离检测物质在水相和假固定相之间进行分配，被分离检测物质在水相和假固定相之间进行分配，由于它们在胶束中具有保留能力不同而产生不同的由于它们在胶束中具有保留能力不同而产生不同的保留时间，所以溶质的迁移速度决定于溶质在两相保留时间，所以溶质的迁移速度决定于溶质在两相间的分配系数间的分配系数 在胶束电动毛细管色谱中，中性粒子间的分离在胶束电动毛细管色谱中，中性粒子间的分离是根据粒子本身的疏水性的不同而达到的是根据粒子本身的疏水性的不同而达到的 不同疏水性的粒子和胶束的相互作用不同，疏不同疏水性的粒子和胶束的相互作用不同，疏水性强的作用力大，保留时间就大，反之，保留水性强的作用力大，保留时间就大，反之，保留时间短时间短 是唯一能分离是唯一能分离带电粒子和带电粒子和中性化合物中性化合物的模式的模式 常用的表面活性剂有：常用的表面活性剂有：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、胆酸、十二烷基三甲基十二烷基磺酸钠、胆酸、十二烷基三甲基溴化胺、十四烷基三甲基溴化胺、溴化胺、十四烷基三甲基溴化胺、十六烷十六烷基三甲基溴化胺基三甲基溴化胺等等MECCMECC应用应用-七种青霉素的分离七种青霉素的分离(A)(A)CZE:CZE:20mM Pi-Borate,pH 8.520mM Pi-Borate,pH 8.5(B)MEKC:B)MEKC:0.1 M SDS in(A)0.1 M SDS in(A)solnsoln.的迁移的迁移毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 (capillary gel (capillary gel electrophoresiselectrophoresis，CGE)CGE)是是2020世纪世纪8080年代后期发年代后期发展起来的毛细管电泳的分离模式，它将凝胶电泳展起来的毛细管电泳的分离模式，它将凝胶电泳对生物大分子的高效分离能力和毛细管电泳的快对生物大分子的高效分离能力和毛细管电泳的快速、微量和定量分析相结合，成为当今分离度极速、微量和定量分析相结合，成为当今分离度极高的一种分离技术。高的一种分离技术。目前主要用于生命科学和生物化学领目前主要用于生命科学和生物化学领域，如对大分子蛋白质的分离，分子量测域，如对大分子蛋白质的分离，分子量测定，定，DNADNA、寡聚核苛酸的分离与纯化。寡聚核苛酸的分离与纯化。CGECGE与激光诱导荧光与激光诱导荧光 (LIF)(LIF)检测技术相结合已检测技术相结合已成为成为DNADNA快速序列分析的优选方法。快速序列分析的优选方法。分离机制分离机制 CGECGE的分离机制与凝胶电泳相同，因凝胶具的分离机制与凝胶电泳相同，因凝胶具有网状结构，有分子筛作用有网状结构，有分子筛作用 分离取决于溶质的净电性质、电荷多少和分子分离取决于溶质的净电性质、电荷多少和分子的大小的大小 当带电溶质通过凝胶时，即按分子大小、电荷当带电溶质通过凝胶时，即按分子大小、电荷性质及电荷多少依次筛分性质及电荷多少依次筛分 对荷电量不随分子大小而变化的大分子如对荷电量不随分子大小而变化的大分子如DNA DNA、SDS-SDS-蛋白质复合物，必须经凝胶筛分得到分蛋白质复合物，必须经凝胶筛分得到分离离 CGECGE的特点的特点 可分可分离蛋白质离蛋白质、DNADNA、RNARNA、多多糖类糖类及及高分子聚合物高分子聚合物,並並确定确定其分子量其分子量 可改可改变变GelGel的的浓浓度來控制分度來控制分离离的的范围范围 分离介质凝胶黏度大，能减少溶质的分离介质凝胶黏度大，能减少溶质的扩散（分离对象为大分子物质，扩散扩散（分离对象为大分子物质，扩散系数小）系数小）所得的峰形尖锐所得的峰形尖锐，是，是CECE分离模式中柱分离模式中柱效最高的效最高的(10(107 7/m)/m)一种分离方法一种分离方法 可可制成不同浓度的凝胶制成不同浓度的凝胶 可得到不同孔径的分子筛，用于分可得到不同孔径的分子筛，用于分离不同分子量的物质离不同分子量的物质 毛细管等速电泳毛细管等速电泳(CITP)(CITP)vCITPCITP基于有效离子淌度的差异进行带电离子的分离基于有效离子淌度的差异进行带电离子的分离 v属于不连续介质电泳，需要两种缓冲液属于不连续介质电泳，需要两种缓冲液 前导电解液：前导电解液：含有与溶质离子电荷相同且淌度为含有与溶质离子电荷相同且淌度为体系中最高的离子体系中最高的离子 尾随电解液：尾随电解液：体系中淌度最低的离子体系中淌度最低的离子 样品离子的淌度介于这两者之间样品离子的淌度介于这两者之间 缺点缺点 ：需要采用不连续缓冲体系，空间分辨率差：需要采用不连续缓冲体系，空间分辨率差 毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳 毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳(capillary(capillary isoelectricisoelectric focusing focusing，CIEF)CIEF)是将常规等电是将常规等电聚焦凝胶电泳的高分辨率与现代毛细管电泳的聚焦凝胶电泳的高分辨率与现代毛细管电泳的特点相结合的一种毛细管电泳分离模式特点相结合的一种毛细管电泳分离模式用于分离用于分离不同等电点不同等电点的两性大分子，尤其在分的两性大分子，尤其在分离蛋白质方面显示了较大的优越性，可分离等离蛋白质方面显示了较大的优越性，可分离等电点电点(pIpI)相差相差0.0lpH0.0lpH单位的不同蛋白质单位的不同蛋白质 除测定除测定pIpI外，还可用于其他方法无法分离的外，还可用于其他方法无法分离的蛋白样，如免疫球蛋白、血红蛋白、血清转铁蛋白样，如免疫球蛋白、血红蛋白、血清转铁蛋白以及低浓度生物样品的分析蛋白以及低浓度生物样品的分析分离原理分离原理等等电点的定义：电点的定义：当当蛋白蛋白质质存在於某一存在於某一个个pHpH值值环环境下境下,其正其正电电荷及荷及负电负电荷的荷的数数目相等目相等(净电净电荷等荷等于于零零,不不帶帶电电),),則此則此pHpH值即值即为为其等其等电点电点(pIpI).分分离离原理原理 电电解解质质中混合中混合凝胶凝胶及及两性电解质两性电解质,通通电后，电后，两性电解质会两性电解质会先形成先形成pHpH梯度梯度,样样品品会会各自向各自向其等其等电点电点移動移動,直到不帶直到不帶电电荷荷(等等电点电点)時時则则停止移停止移动动,利用利用气压压气压压力力将将已等已等电电聚焦聚焦的样的样品推品推动动,经过检测经过检测器器进进行行检测检测分离原理（续）分离原理（续）CIEFCIEF的电泳缓冲液由的电泳缓冲液由不同不同pHpH值范围的两性电值范围的两性电解质组成解质组成 (其其 pHpH值范围值范围应包括被分离溶质如蛋应包括被分离溶质如蛋白质的白质的pIpI值值)，将溶质和，将溶质和不同不同pHpH值范围的载体两值范围的载体两性电解质的混合溶液注性电解质的混合溶液注入毛细管柱入毛细管柱分离原理（续分离原理（续）在电场作用下，在电场作用下，带正电荷的溶质和带正电荷的溶质和两性电解质向阴极两性电解质向阴极移动，带负电荷的移动，带负电荷的则向阳极移动，形则向阳极移动，形成成pHpH梯度梯度分离原理（续）分离原理（续）溶质和两性电解质溶质和两性电解质在不同在不同pHpH值梯度下，值梯度下，通过介质迁移，而溶通过介质迁移，而溶质的电荷将随质的电荷将随pHpH值的值的变化而减少，直到不变化而减少，直到不再移动，达到稳态，再移动，达到稳态，此时的此时的pHpH值即为溶质值即为溶质的的pIpI值，这一过程称值，这一过程称等电聚焦等电聚焦 聚焦过程可用电流检测，聚焦过程可用电流检测，当聚焦完毕，无电流通过当聚焦完毕，无电流通过 蛋白质只能在它蛋白质只能在它的等电点位置，被的等电点位置，被聚焦成一条窄而稳聚焦成一条窄而稳定的区带，故能获定的区带，故能获得非常高的分辨率，得非常高的分辨率，不同的蛋白质有不不同的蛋白质有不同的等电点，能在同的等电点，能在CIEFCIEF中聚焦成不同中聚焦成不同的区带得以分离。的区带得以分离。毛细管电色谱毛细管电色谱(capillary electrochromatography，CEC）毛细管电色谱毛细管电色谱 CECCEC是高效液相和毛细管电泳相结合的一种毛细是高效液相和毛细管电泳相结合的一种毛细管电泳分离模式。管电泳分离模式。在石英毛细管柱内填充在石英毛细管柱内填充HPLCHPLC用的固定相或在毛用的固定相或在毛细管壁键合固定相，以电场作用下产生的电渗流细管壁键合固定相，以电场作用下产生的电渗流为驱动力推动流动相进行分离为驱动力推动流动相进行分离 CECCEC既保持既保持CECE高效、高分辨和快速的特点，又可高效、高分辨和快速的特点，又可选择不同的固定相提高选择性和扩大分离范围选择不同的固定相提高选择性和扩大分离范围 根据溶质在流动相与固定相中的分配系数不同，根据溶质在流动相与固定相中的分配系数不同，荷电组分电泳淌度的差异进行分离荷电组分电泳淌度的差异进行分离毛细管电色谱毛细管电色谱 能分离中性物质、阴离子和阳离子。克服了能分离中性物质、阴离子和阳离子。克服了CZECZE分离分离中性物质的困难，同时提高了中性物质的困难，同时提高了HPLCHPLC的分离效率的分离效率 CECCEC在分离中性粒子时，不需像在分离中性粒子时，不需像MECCMECC那样使用表面活那样使用表面活性剂，有利于和性剂，有利于和MSMS联用。亦可选用离子交换树脂对联用。亦可选用离子交换树脂对带电组分进行分离带电组分进行分离 CECCEC在分离手性化合物时可以在固定相上键合手性选在分离手性化合物时可以在固定相上键合手性选择剂，也可用非手性固体相在缓冲液中加入手性选择剂，也可用非手性固体相在缓冲液中加入手性选择剂进行拆分择剂进行拆分 毛细管电色谱毛细管电色谱 在分离过程中同时存在色谱和电泳双重分离机制在分离过程中同时存在色谱和电泳双重分离机制 可用压力驱动对可用压力驱动对CECCEC系统的溶剂进行梯度洗脱，系统的溶剂进行梯度洗脱，分离分子结构相近或电泳淌度接近的混合物分离分子结构相近或电泳淌度接近的混合物 CECCEC柱的制备目前大多采用匀浆高压填充法和电柱的制备目前大多采用匀浆高压填充法和电动填充法，但柱的均匀度尚存在问题，气泡也不动填充法，但柱的均匀度尚存在问题，气泡也不可避免可避免 除填充柱外除填充柱外CECCEC还可用涂层的方法，在毛细管壁还可用涂层的方法，在毛细管壁键合固定相，制备分离柱，例如将二甲基聚硅键合固定相，制备分离柱，例如将二甲基聚硅氧烷与甲基化的环糊精键合后再涂于毛细管壁氧烷与甲基化的环糊精键合后再涂于毛细管壁制成手性分离柱制成手性分离柱 CECCEC已开始用于多环芳烃的芳香族类、蛋白多肽已开始用于多环芳烃的芳香族类、蛋白多肽类、寡聚核苷酸类等的药物分析和对映体分离类、寡聚核苷酸类等的药物分析和对映体分离EPO