高级动物生物化学第一二三章课件

高高级动物生物化学第物生物化学第一二三章一二三章第一篇第一篇 蛋白质分子基础蛋白质分子基础 及其实验技术及其实验技术第二篇第二篇 基因表达调控基因表达调控第一篇第一篇 蛋白质分子基础及其实验技术蛋白质分子基础及其实验技术 第一章第一章 蛋白质的化学组成及其分类（蛋白质的化学组成及其分类（1）第二章第二章 蛋白质分子结构（蛋白质分子结构（3）第三章第三章 蛋白质一级结构测定（蛋白质一级结构测定（4）第四章第四章 蛋白质的化学修饰（蛋白质的化学修饰（4）第五章第五章 蛋白质结构与功能的关系（蛋白质结构与功能的关系（2）第六章第六章 蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质相互作用(2)第七章第七章 蛋白质的制备的方法与技术（蛋白质的制备的方法与技术（4）第二篇第二篇 基因表达调控基因表达调控 第一章第一章 原核生物基因表达的调控（原核生物基因表达的调控（10）1 1 引言引言 2 2 细菌对营养的适应细菌对营养的适应 3 3 组成蛋白与调解蛋白组成蛋白与调解蛋白 4 4 操纵子学说操纵子学说 5 5 操纵子基因结构操纵子基因结构 6 6 乳糖操纵子乳糖操纵子 7 7 阿拉伯糖操纵子阿拉伯糖操纵子 8 8 氨基酸合成的操纵子氨基酸合成的操纵子 第二章第二章 真核生物基因表达调控（真核生物基因表达调控（12）第一章第一章 蛋白质的化学组成及其分类蛋白质的化学组成及其分类 蛋白质是生物体现生命特征的物质基础。在生物体含有蛋白质是生物体现生命特征的物质基础。在生物体含有成千上万种蛋白质，各具备其特异的生物学功能：如催化功成千上万种蛋白质，各具备其特异的生物学功能：如催化功能、结构功能、收缩功能、运输和贮存功能、调节功能、免能、结构功能、收缩功能、运输和贮存功能、调节功能、免疫功能、信号传导功能等等。疫功能、信号传导功能等等。具有特定生物学功能的蛋白质应具有特定的结构。结构具有特定生物学功能的蛋白质应具有特定的结构。结构决定功能；结构改变导致功能改变。决定功能；结构改变导致功能改变。1955年，年，Sanger，胰岛素一级结构。上世纪，胰岛素一级结构。上世纪80年代后，年代后，随着分子生物学技术的进步，特别是人类基因组计划的完成，随着分子生物学技术的进步，特别是人类基因组计划的完成，人们在基因水平破译了数以千计人们在基因水平破译了数以千计 的蛋白一级结构。蛋白质的的蛋白一级结构。蛋白质的空间结构（立体结构）主要通过现代生物物理方法，如空间结构（立体结构）主要通过现代生物物理方法，如X-光光衍射、核磁共振、圆二色性光谱、紫外差光谱、激光拉曼光衍射、核磁共振、圆二色性光谱、紫外差光谱、激光拉曼光谱等方法进行研究。谱等方法进行研究。研究蛋白质的空间结构对了解蛋白与蛋白、蛋白与其研究蛋白质的空间结构对了解蛋白与蛋白、蛋白与其他物质相互作用的过程，药物的设计等具有重要意义。他物质相互作用的过程，药物的设计等具有重要意义。一、一、蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成 组成蛋白质的元素：组成蛋白质的元素：C（50%）、）、H（7%）、）、O（23%）、）、N（16%）、）、S（0-3%）、其它元素微量（）、其它元素微量（P、I、Mo、Cr、Zn、Cu等）；等）；蛋白质的平均含氮量为蛋白质的平均含氮量为16%，此为凯氏定氮法测定蛋白，此为凯氏定氮法测定蛋白质含量的基础。质含量的基础。二、蛋白质的基本结构单位二、蛋白质的基本结构单位氨基酸氨基酸组成蛋白质的氨基酸为：组成蛋白质的氨基酸为：L-氨基酸氨基酸（L-amino acids)L-氨基酸氨基酸（L-Amino acids)CRCOOHHH3N+CCH2OHCHOHHO L-甘油醛甘油醛（L-Glyceraldehyde)蛋白质中常见氨基酸的结构蛋白质中常见氨基酸的结构 甘氨酸甘氨酸 Glycine 脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸氨基乙酸氨基乙酸氨基酸的结构氨基酸的结构 脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸甘氨酸甘氨酸 Glycine 丙氨酸丙氨酸 Alanine-氨基丙酸氨基丙酸氨基酸的结构氨基酸的结构 甘氨酸甘氨酸 Glycine 丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine 脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸-氨基异戊酸氨基异戊酸氨基酸的结构氨基酸的结构 甘氨酸甘氨酸 Glycine 丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine 脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸-氨基异己酸氨基异己酸氨基酸的结构氨基酸的结构 甘氨酸甘氨酸 Glycine 丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine异亮氨酸异亮氨酸 Ileucine 脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸-氨基氨基-甲基戊酸甲基戊酸氨基酸的结构氨基酸的结构 甘氨酸甘氨酸 Glycine 丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine异亮氨酸异亮氨酸 Ileucine脯氨酸脯氨酸 Proline 亚氨基酸亚氨基酸-吡咯烷基吡咯烷基-羧酸，羧酸，吡咯啶吡咯啶-甲甲酸酸氨基酸的结构氨基酸的结构 甘氨酸甘氨酸 Glycine 丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine异亮氨酸异亮氨酸 Ileucine脯氨酸脯氨酸 Proline甲硫氨酸甲硫氨酸 （蛋氨酸）（蛋氨酸）Methionine 含硫氨基酸含硫氨基酸 -氨基氨基-甲硫基丁酸甲硫基丁酸氨基酸的结构氨基酸的结构 甘氨酸甘氨酸 Glycine 丙氨酸丙氨酸 Alanine缬氨酸缬氨酸 Valine亮氨酸亮氨酸 Leucine异亮氨酸异亮氨酸 Ileucine脯氨酸脯氨酸 Proline甲硫氨酸甲硫氨酸 Methionine半胱氨酸半胱氨酸 Cysteine 含硫氨基酸含硫氨基酸 -氨基氨基-巯基丙巯基丙酸酸氨基酸的结构氨基酸的结构 芳香族氨基酸芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸Phenylalanine -氨基氨基-苯基丙苯基丙酸酸氨基酸的结构氨基酸的结构 芳香族氨基酸芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸酪氨酸Tyrosine -氨基氨基-对羟苯基丙对羟苯基丙酸酸氨基酸的结构氨基酸的结构 芳香族氨基酸芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸酪氨酸Tyrosine色氨酸色氨酸 TryptophanTrp -氨基氨基-吲哚基丙吲哚基丙酸酸氨基酸的结构氨基酸的结构 碱性氨基酸碱性氨基酸精氨酸精氨酸 Arginine -氨基氨基-胍基戊胍基戊酸酸氨基酸的结构氨基酸的结构 碱性氨基酸碱性氨基酸精氨酸精氨酸 Arginine赖氨酸赖氨酸 Lysine，-二氨基己酸二氨基己酸氨基酸的结构氨基酸的结构 碱性氨基酸碱性氨基酸精氨酸精氨酸 Arginine赖氨酸赖氨酸 Lysine组氨酸组氨酸 Histidine -氨基氨基-咪唑基丙咪唑基丙酸酸氨基酸的结构氨基酸的结构 天冬氨酸天冬氨酸 Aspartate 酸性氨基酸酸性氨基酸 -氨基丁二酸氨基丁二酸氨基酸的结构氨基酸的结构 天冬氨酸天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸谷氨酸 Glutamate 酸性氨基酸酸性氨基酸 -氨基戊二酸氨基戊二酸氨基酸的结构氨基酸的结构 丝氨酸丝氨酸 Serine 含羟基氨基酸含羟基氨基酸 -氨基氨基-羟基丙羟基丙酸酸氨基酸的结构氨基酸的结构 丝氨酸丝氨酸 Serine 苏氨酸苏氨酸 Threonine 含羟基氨基酸含羟基氨基酸 -氨基氨基-羟基丁羟基丁酸酸氨基酸的结构氨基酸的结构 天冬酰胺天冬酰胺 Asparagine 含酰胺氨基酸含酰胺氨基酸-酰胺基酰胺基-氨基丙酸氨基丙酸氨基酸的结构氨基酸的结构 天冬酰胺天冬酰胺 Asparagine谷酰胺谷酰胺 Glutamine 含酰胺氨基酸含酰胺氨基酸-酰胺基酰胺基-氨基丁酸氨基丁酸 根据氨基酸根据氨基酸R 基团的不同，将氨基酸分为五类：基团的不同，将氨基酸分为五类：1.Nonpolar aliphatic amino acids:甘甘 Glycine Gly G 丙丙 Alanine Ala A脯脯 Proline Pro P缬缬 Valine Val V亮亮 Leucine Leu L异亮异亮 Isoleucine Ile I蛋蛋 Methionine Met M2.Aromatic amino acids:苯丙苯丙 Phenylalanine Phe F 酪酪 Tyrosine Tyr Y 色色 Tryptophan Trp W 3.Polar,uncharged amino acids:丝丝 Serine Ser S 苏苏 Threonine Thr T 半胱半胱 Cystine Cys C 天酰天酰 Asparagine Asn N 谷酰谷酰 Glutamine Glu Q 4.Positively charged amino acids赖赖 Lysine Lys K 组组 Histidine His H 精精 Arginine Arg R 5.Negatively charged amino acids天冬天冬 Aspartate Asp D 谷谷 Glutamate Glu E 蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸（20种）种）酸性氨基酸酸性氨基酸天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸碱性氨基酸碱性氨基酸赖氨酸赖氨酸组氨酸组氨酸精氨酸精氨酸中性氨基酸中性氨基酸极性氨基酸极性氨基酸非极性氨基非极性氨基酸酸丝氨酸丝氨酸苏氨酸苏氨酸半胱氨酸半胱氨酸酪氨酸酪氨酸天冬酰氨天冬酰氨谷氨酰胺谷氨酰胺甘氨酸甘氨酸丙氨酸丙氨酸亮氨酸亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸色氨酸色氨酸脯氨酸脯氨酸颉氨酸颉氨酸分类分类单纯蛋白质（如清蛋白、球蛋白、组蛋白、谷蛋白、等）单纯蛋白质（如清蛋白、球蛋白、组蛋白、谷蛋白、等）结合蛋白质（如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、金属蛋白等）结合蛋白质（如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、金属蛋白等）分类分类：按生物学功能可将蛋白质分为酶、调节蛋白、结构蛋白、转运蛋按生物学功能可将蛋白质分为酶、调节蛋白、结构蛋白、转运蛋白等等；白等等；分类分类分类分类纤维状蛋白质（一般不溶于水。典型的有：胶原蛋白、弹性蛋白、纤维状蛋白质（一般不溶于水。典型的有：胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白、肌球蛋白等）角蛋白、丝蛋白、肌球蛋白等）球状蛋白质（可溶性好。典型的有：胞质酶类等）球状蛋白质（可溶性好。典型的有：胞质酶类等）膜蛋白（与细胞的膜系统结合而存在）膜蛋白（与细胞的膜系统结合而存在）单体蛋白质单体蛋白质（寡）多聚蛋白质（寡）多聚蛋白质蛋白质的分类蛋白质的分类第二章第二章 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构一、蛋白质的一级结构：一、蛋白质的一级结构：蛋白质的蛋白质的一级结构一级结构指多肽链氨基酸的排列顺序。指多肽链氨基酸的排列顺序。在蛋白质分子中，氨基酸是以在蛋白质分子中，氨基酸是以肽键肽键形式连接起来的。肽形式连接起来的。肽键是由一个氨基酸的键是由一个氨基酸的 羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的 氨基脱氨基脱水形成的水形成的酰胺键酰胺键。肽键肽键二肽二肽 R group 氨基端氨基端（N 端）端）羧基端羧基端（C端）端）氨基酸残基氨基酸残基（residue）肽键肽键 蛋白质分子在结构上可分为：一、二、三、四级结构。蛋白质分子在结构上可分为：一、二、三、四级结构。一级结构又称为化学结构；二一级结构又称为化学结构；二-四极结构称为空间结构或构四极结构称为空间结构或构象。象。构型与构象的概念：构型与构象的概念：构型构型(Configuration)：分子中各原子特有的空间排列。这种：分子中各原子特有的空间排列。这种排列的改变涉及到共价键的生成与破坏，与氢键无关。如顺排列的改变涉及到共价键的生成与破坏，与氢键无关。如顺反异构（顺反异构（顺-，反反-）、旋光异构（）、旋光异构（D-，L-）。）。构象构象(Conformation)：分子中由于单键的旋转而产生的原子：分子中由于单键的旋转而产生的原子空间排列。这种排列的改变仅涉及氢键等次级键得生成遇破空间排列。这种排列的改变仅涉及氢键等次级键得生成遇破坏，不涉及共价键的生成与破坏。坏，不涉及共价键的生成与破坏。蛋白质分子中原子或基团的空间排列叫蛋白质的分子构象。蛋白质分子中原子或基团的空间排列叫蛋白质的分子构象。蛋蛋白质构象的形成是由于单键的旋转而引起的。白质构象的形成是由于单键的旋转而引起的。蛋白质多肽链主链上的共价键都是单键结构，如果所有的单键蛋白质多肽链主链上的共价键都是单键结构，如果所有的单键都可以自由旋转，多肽链将有无数个构象。但实际上某一特定的多都可以自由旋转，多肽链将有无数个构象。但实际上某一特定的多肽链在一定条件下常形成一种或少十几种构象。可见蛋白质主链上肽链在一定条件下常形成一种或少十几种构象。可见蛋白质主链上的单键并不都能自由旋转。的单键并不都能自由旋转。经过经过X-光衍射证明：在普通有机化合物分子中，光衍射证明：在普通有机化合物分子中，C-N 单键的键长：单键的键长：14.9 nm；C=N 双键的键长：双键的键长：12.7 nm；肽键的肽键的C-N 单键的键长：单键的键长：13.2 nm由此可见，肽键中的由此可见，肽键中的C-N 键长介乎于普通键长介乎于普通C-N和和C=N 之间。它虽然之间。它虽然是单键，却具有部分双键的性质，不能自由旋转。这样与是单键，却具有部分双键的性质，不能自由旋转。这样与C-N 相连相连的的4个原子：两个个原子：两个C、一个、一个H和一个和一个O 与与C-N 位于一个平面上，这位于一个平面上，这个平面被称为酰胺平面或肽键平面。由于此平面可塑性差，又称为个平面被称为酰胺平面或肽键平面。由于此平面可塑性差，又称为刚性平面。刚性平面。二、蛋白质的分子构象：二、蛋白质的分子构象：肽键平面是蛋白质构象的基本结构单位，在肽链中，相邻肽键平面是蛋白质构象的基本结构单位，在肽链中，相邻的肽键平面可以围绕的肽键平面可以围绕 碳原子自由旋转形成多种状态的立体结构。碳原子自由旋转形成多种状态的立体结构。多肽链有规律的盘绕、折叠而形成的空间结构叫多肽链有规律的盘绕、折叠而形成的空间结构叫蛋白质二级结构。包括蛋白质二级结构。包括-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转角、无规转角、无规则卷曲。维持二级结构的化学键为氢键。则卷曲。维持二级结构的化学键为氢键。三、蛋白质的二级结构（三、蛋白质的二级结构（Secondary structure）（一）（一）-螺旋螺旋(-helix)肽链中相邻的肽键平面通过肽链中相邻的肽键平面通过-碳原子进行旋转，碳原子进行旋转，盘绕而成的右手双螺旋结构叫盘绕而成的右手双螺旋结构叫-螺旋。螺旋。In protein,the helix is a major structural motif in Secondary structure.It was first postulated by Linus Pauling,(Chemist 1901-1994，USA,Two-time winner of the Nobel Prize）Robert Corey,and Herman Branson in 1951 based on the known crystal structures of amino acids and peptides and Paulings prediction of planar peptide bonds.-螺旋螺旋(-helix)在在-helix中，每一圈含有中，每一圈含有3.6氨基氨基酸（即每个氨基酸旋转酸（即每个氨基酸旋转100o），肽键），肽键平面与螺旋轴平行，氨基酸侧链（平面与螺旋轴平行，氨基酸侧链（R基团）分布在螺旋外侧；相邻螺旋之基团）分布在螺旋外侧；相邻螺旋之间靠链内氢键连接（即一个氨基酸残间靠链内氢键连接（即一个氨基酸残基（基（n）的）的N-H的的H与前第四个与前第四个（n+4）残基的）残基的C=O之间形成的氢键之间形成的氢键（N-HO=C）。）。The amino acids in an helix are arranged in a helical structure,about 50 nm(5)wide.Each amino acid results in a 100 turn in the helix,and corresponds to a translation of 15 nm along the helical axis.The helix is tightly packed;there is almost no free space within the helix.All amino acid side-chains are arranged at the outside of the helix.The N-H group of amino acid(n)can establish a hydrogen bond with the C=O group of amino acid(n+4).某些某些R基团对基团对-螺旋的形成和稳定性有很大影响：螺旋的形成和稳定性有很大影响：A.A.酸性氨基酸酸性氨基酸（特别是（特别是Glu）或碱性氨基酸（）或碱性氨基酸（Lys、Arg）集中的区域，）集中的区域，(pH=7)由于同性电荷相斥，不利于由于同性电荷相斥，不利于-螺旋的形成；螺旋的形成；B.B.较大氨基酸较大氨基酸（Phe,Ile,Try）集中的区域）集中的区域,由于空间位阻会影响其稳定性；由于空间位阻会影响其稳定性；C.C.脯氨酸和甘氨酸脯氨酸和甘氨酸 是是-螺旋破坏者（螺旋破坏者（Disruptor）,在在-螺旋中很少发现有这螺旋中很少发现有这两个氨基酸的存在。两个氨基酸的存在。Some amino acids(called helix breakers)like proline and glycine will disrupt the helical structure.Ordinarily,a helix has a buildup of positive charge at the N-terminal end and negative charge at the C-terminal end which is a destabilizing influence.As a result,helices are often capped at the N-terminal end by a negatively charged amino acid(like glutamic acid)in order to stabilise the helix dipole.Less common(and less effective)is C-terminal capping with a positively charged amino acid like lysine.helices have particular significance in DNA binding motifs,including helix-turn-helix motifs,leucine zipper motifs and zinc finger motifs.This is because of the structural coincidence of the helix diameter of 120 nm being the same as the width of the major groove in B-form DNA.多肽链中的两个或多个区域充分伸展、平行排列而形成的片层结构多肽链中的两个或多个区域充分伸展、平行排列而形成的片层结构叫叫-折叠。平行排列分为顺式和反式。反式稳定。片层之间靠氢键维系折叠。平行排列分为顺式和反式。反式稳定。片层之间靠氢键维系（即一条链的（即一条链的N-H的的H与相邻条链的与相邻条链的C=O之间形成的氢键（之间形成的氢键（N-HO=C）；侧链位于片层的上下。如丝心蛋白含较多的这种结构。）；侧链位于片层的上下。如丝心蛋白含较多的这种结构。(二二)-折叠折叠（-sheet）The sheet(also-pleated sheet)is a commonly occurring form of regular secondary structure in proteins,first proposed by Linus Pauling and Robert Corey in 1951.It consists of two or more amino acid sequences within the same protein that are arranged adjacently and in parallel,but with alternating orientation such that hydrogen bonds can form between the two strands.The amino acid chain is almost fully extended throughout a strand.The N-H groups in the backbone of one strand establish hydrogen bonds with the C=O groups in the backbone of the adjacent,parallel strand(s).The cumulative effect of multiple such hydrogen bonds arranged in this way contributes to the sheets stability and structural rigidity and integrity.The-C atoms of adjacent strands stand 350 picometres(0.35 nm)apart.顺式顺式-折叠折叠反式反式-折叠折叠(三三)-转角（转角（-Turns)肽链的主链某一区域发生的肽链的主链某一区域发生的180度转弯的结构。度转弯的结构。附：附：（一）超二级结构（一）超二级结构:是指二级结构单元相互聚集形成更高级的是指二级结构单元相互聚集形成更高级的有规律结构：有规律结构：1.复绕复绕-螺旋（螺旋（coiled-coil coiled-coil-helix):2.2.x-单元（单元（x-unit):两条两条3.-迂回（迂回（-meande):三条或三条以上三条或三条以上4.-折叠筒（折叠筒（-sheet barrel):多条卷成多条卷成圆筒状筒状5.-螺旋螺旋-转角角-螺旋：螺旋：（二）（二）结构域结构域（structural domains):一条多肽链在超二级结构一条多肽链在超二级结构的基础上，形成相对独立的几个球状区域，的基础上，形成相对独立的几个球状区域，并以松散的肽链，并以松散的肽链，这种区域叫结构域。结构域往往与功能域相对应。这种区域叫结构域。结构域往往与功能域相对应。(四四)无规则卷曲无规则卷曲 指在蛋白质分子中所有原子的空间排列。即在蛋指在蛋白质分子中所有原子的空间排列。即在蛋白质二级结构的基础上，由于氨基酸残基侧链的相互白质二级结构的基础上，由于氨基酸残基侧链的相互作用，肽链进一步卷曲、折叠形成的立体结构或三维作用，肽链进一步卷曲、折叠形成的立体结构或三维结构叫蛋白质三级结构。具有生物活性的蛋白质必须结构叫蛋白质三级结构。具有生物活性的蛋白质必须具有三级结构。具有三级结构。侧链的相互作用可以形成各种次级键，以维持蛋侧链的相互作用可以形成各种次级键，以维持蛋白质三级结构的空间构象。次级键包括：疏水键、盐白质三级结构的空间构象。次级键包括：疏水键、盐键、氢键、范德华引力、二硫键。其中疏水键、二硫键、氢键、范德华引力、二硫键。其中疏水键、二硫键是主键。键是主键。四、蛋白质的三级结构（四、蛋白质的三级结构（tertiary structure）胰岛素三级结构三级结构 有些蛋白质是由两条或两条以上的具有独立三级结构的多有些蛋白质是由两条或两条以上的具有独立三级结构的多肽链通过次级键聚合而成的，具有独立三级结构的多肽链称为肽链通过次级键聚合而成的，具有独立三级结构的多肽链称为亚基（亚单位）。蛋白质的四级结构就是组成蛋白质的各个亚亚基（亚单位）。蛋白质的四级结构就是组成蛋白质的各个亚基的空间排列。基的空间排列。亚基可以相同，也可以不同。如血红蛋白，亚基可以相同，也可以不同。如血红蛋白，22 亚基。亚基。主要的键为盐键。主要的键为盐键。实际上好多蛋白质在发挥生理作用时常以二聚体或多聚体实际上好多蛋白质在发挥生理作用时常以二聚体或多聚体的形式存在。如膜上的受体。的形式存在。如膜上的受体。五、蛋白质的四级结构（五、蛋白质的四级结构（Quaternary structure）In biochemistry,many proteins are actually assemblies of more than one protein(polypeptide)molecule,which in the context of the larger assemblage are known as protein subunits.In addition to the tertiary structure of the subunits,multiple-subunit proteins possess a quaternary structure,which is the arrangement into which the subunits assemble.Enzymes composed of subunits with diverse functions are sometimes called holoenzymes,in which some parts may be known as regulatory subunits and the core is often called the catalytic subunit.Examples of proteins with quaternary structure include hemoglobin,DNA polymerase,and ion channels.Other assemblies referred to instead as multiprotein complexes also possess quaternary structure.Examples include nucleosomes and microtubules.Changes in quaternary structure are called conformational changes.It is through such changes,which underlie cooperativity and allostery in multimeric enzymes,that many proteins undergo regulation and perform their physiological function.The above definition follows a classical approach to biochemistry,established at times when the distinction between a protein and a functional,proteinaceous unit was difficult to elucidate.More recently,people refer to protein-protein interaction when discussing quaternary structure of proteins and consider all assemblies of proteins as protein complexes.血红蛋白四级结构血红蛋白四级结构肌红蛋白三级结构肌红蛋白三级结构第三章第三章 蛋白质一级结构测定蛋白质一级结构测定1955年年,F.Sanger等分析了牛胰岛素一级结构等分析了牛胰岛素一级结构11、蛋白测序的基本策略、步骤及注意事项、蛋白测序的基本策略、步骤及注意事项一、测序策略一、测序策略 用两套方法将肽链专一性切开，各自获得一系列片用两套方法将肽链专一性切开，各自获得一系列片段，分离纯化片段，对片段测序，最后将两条片段组合，段，分离纯化片段，对片段测序，最后将两条片段组合，得到全序列。得到全序列。二、测序的一般步骤二、测序的一般步骤断开多肽链内的二硫键断开多肽链内的二硫键测定每一肽链的氨基酸组成测定每一肽链的氨基酸组成鉴定多肽链的鉴定多肽链的N-末端和末端和C-末端末端确定二硫键的位置确定二硫键的位置裂解多肽链为较小的肽裂解多肽链为较小的肽测定各肽段的氨基酸序列测定各肽段的氨基酸序列利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构拆分多肽链拆分多肽链测定多肽链的数目测定多肽链的数目三、测序注意事项三、测序注意事项1.样品纯度：要求样品纯度：要求95%以上。纯度检查方法：电泳、离子交换以上。纯度检查方法：电泳、离子交换层析、层析、N-端氨基酸分析、端氨基酸分析、Western blot等；等；2.蛋白分子量测定：方法：蛋白分子量测定：方法：SDS-PAGE，沉降系数；，沉降系数；3.蛋白亚基数目：方法：蛋白亚基数目：方法：SDS-PAGE，用还原性上样，用还原性上样buffer；4.蛋白质氨基酸组成：氨基酸自动分析仪或水解蛋白后做氨基蛋白质氨基酸组成：氨基酸自动分析仪或水解蛋白后做氨基酸双向层析；酸双向层析；5.糖蛋白的确定：糖蛋白的确定：6.蛋白质末端氨基酸分析蛋白质末端氨基酸分析：22、蛋白质氨基酸的组成分析、蛋白质氨基酸的组成分析 首先将蛋白质水解成游离氨基酸，再通过氨基酸自动分析仪分首先将蛋白质水解成游离氨基酸，再通过氨基酸自动分析仪分析蛋白质的氨基酸组成。析蛋白质的氨基酸组成。一、蛋白质的水解一、蛋白质的水解 1.HCl 水解法：水解法：5.7M HCl5.7M HCl，105-110 oC密封水解密封水解24-72h。通过此法水解，。通过此法水解，Trp被破坏；被破坏；Ser、Thr 被缓慢分解，但通过测定不同水解时间的量，可倒推水解初期的被缓慢分解，但通过测定不同水解时间的量，可倒推水解初期的量；量；Cys被氧化。所以先氧化成稳定的磺基丙氨酸后再水解；被氧化。所以先氧化成稳定的磺基丙氨酸后再水解；Gln和和Asn 酸水解时脱酰胺后全部变为酸水解时脱酰胺后全部变为Glu和和Asp,水解时放出的水解时放出的NH3可用来可用来测定测定Gln和和Asn 的总量；的总量；Met 水解时被氧化为甲硫氨酸砜，损失水解时被氧化为甲硫氨酸砜，损失20%，需要校正。，需要校正。2.磺酸水解法：是非氧化性强酸，用于代替磺酸水解法：是非氧化性强酸，用于代替HCl。方法：方法：4M甲基磺酸，甲基磺酸，0.2%-吲哚基乙胺（水解基乙胺（水解剂）。）。此法操作比此法操作比较复复杂。3.酶酶水解法：比水解法：比较温和，温和，专一性一性强强，受水解的氨基酸不，受水解的氨基酸不被破坏（如被破坏（如Trp、Asn、Gln）；缺点是蛋白不易）；缺点是蛋白不易彻底水底水解。解。用氨基酸自动分析仪分离和测定各种氨基酸的含量。用氨基酸自动分析仪分离和测定各种氨基酸的含量。此类仪器属于离子交换层析系统，柱的填充材料为磺酸此类仪器属于离子交换层析系统，柱的填充材料为磺酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂，在型聚苯乙烯阳离子交换树脂，在pH2时，全部氨基酸结时，全部氨基酸结合在树脂上，提高合在树脂上，提高pH和离子强度，可以将氨基酸一次洗和离子强度，可以将氨基酸一次洗脱下来，从而达到分离目的（酸性氨基酸先下来，碱性脱下来，从而达到分离目的（酸性氨基酸先下来，碱性氨基酸最后下来）；洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应呈氨基酸最后下来）；洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应呈紫色，可在紫色，可在570 nm比色测定。比色测定。目前有多种型号的氨基酸自动分析仪，如日立目前有多种型号的氨基酸自动分析仪，如日立835-50型氨基酸自动分析仪分析的图谱为：型氨基酸自动分析仪分析的图谱为：二、氨基酸的分离与定量测定二、氨基酸的分离与定量测定 测定每条多肽链的氨基酸组成测定每条多肽链的氨基酸组成三、特殊氨基酸的测定三、特殊氨基酸的测定（一）色氨酸（一）色氨酸（Trp)由于酸水解由于酸水解Trp被破坏。常用方法有：被破坏。常用方法有：1.紫外吸收法：由于紫外吸收法：由于Trp and Tyr 在在280nm 290nm 有吸收，所以可用完整有吸收，所以可用完整的蛋白质进行的蛋白质进行Trp的测定。的测定。2.已知已知Trp的摩尔消光系数：的摩尔消光系数：288nm=4815；280nm=56903.Tyr的摩尔消光系数的摩尔消光系数:288nm=385;280nm=1280 Trp/Tyr=(A2881280)-(A280385)/(A2804815)-(A2885690)由于由于Tyr氨基酸残基数可以氨基酸残基数可以测得，所以用得，所以用Trp/Tyr比值就可以推算出比值就可以推算出Trp的量。的量。2.对对-二甲基氨基苯甲醛法：二甲基氨基苯甲醛法：Trp强酸强酸醛醛有色物质（有色物质（590nm)（二）巯基测定（二）巯基测定 方法有：硫醇盐法、烷基化法和比色法等，方法有：硫醇盐法、烷基化法和比色法等，由于比色法简便，被广泛应用。由于比色法简便，被广泛应用。1 15,5-5,5-二硫代双（二硫代双（-2-2-硝基苯基酸）（也叫硝基苯基酸）（也叫 Ellman Ellman 试剂）试剂）5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid）（）（DTNB）：2Pr-SHPr-S-S-Pr +（DTNB）SCOOHSNO2HOOCO2NCOOHHSNO22(CNT)（三）二硫键的测定（三）二硫键的测定 1.Ellman试剂法试剂法（DTNB）SCOOHSNO2HOOCO2N（DTNB）COOHSNO2O2NSCOOH+Pr-SH（Protein）Pr-S-S-COOHNO2+COOHHSNO2（CNT）Pr-S-S-Pr+COOHSNO2O2NSCOOHPr-S-S-COOHNO2COOHHSNO2+Pr-SH+Pr-SH（Protein）Pr-S-S-COOHNO2+（CNT）COOHHSNO2Pr-SHPr-S-S-PrCOOHSNO2O2NSCOOH2+3Pr-S-S-COOHNO2COOHHSNO2（CNT）总反应：总反应：Pr-S-S-COOHNO2碱碱-HN-CH-CO-CH2SCOOHSNO2-HN-C-CO-CH2+SCOOHHSNO2+（CNT）实际测定时，将蛋白质溶于实际测定时，将蛋白质溶于2M硫氰酸胍和硫氰酸胍和 3mM EDTA中，先用中，先用DTNB 试剂测定释放的试剂测定释放的CNT数，然后再将这个溶液数，然后再将这个溶液pH 调到调到10.5，再测定，再测定CNT释放的数量，二硫键的数目可用下列公式计算：释放的数量，二硫键的数目可用下列公式计算：二硫键的数目二硫键的数目=（pH10.5后测得的后测得的CNT数）数）2（pH10.5前测得的前测得的CNT数）数）2 如果蛋白质没有活泼的巯基，可加入含巯基的化合物：如果蛋白质没有活泼的巯基，可加入含巯基的化合物：Cys,GSH,DTT （四）氨基的测定（四）氨基的测定 测定蛋白质和肽中的氨基常用：测定蛋白质和肽中的氨基常用：1.2,4,6-三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBS）比色法：与伯胺定量反应，分光光度比色法：与伯胺定量反应，分光光度法测定。法测定。2.荧光胺法：荧光胺法：33 末端氨基酸的测定末端氨基酸的测定一、一、N-末端氨基酸的测定末端氨基酸的测定 主要为化学方法。共同特点是：在主要为化学方法。共同特点是：在N 端引入一个标记性基团，后分离、端引入一个标记性基团，后分离、鉴定带有这种基团的氨基酸衍生物。鉴定带有这种基团的氨基酸衍生物。（一）二硝基氟苯法（一）二硝基氟苯法（DNFB）（一）二硝基氟苯法（一）二硝基氟苯法（DNFB）NO2O2NF+H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-.R1R2R3（DNFB）HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-.R1R2R3NO2O2NFHHN-CH-COOHR1RNO2O2N n H2N-CH-COOH+蛋白蛋白-二硝基氟苯衍生物二硝基氟苯衍生物（DNP-Protein）DNP-氨基酸氨基酸（黄色）（黄色）氨基酸混合物氨基酸混合物蛋白质蛋白质 除除DNP-Arg外，其它氨基酸生成的外，其它氨基酸生成的DNP-氨基酸都可用乙氨基酸都可用乙醚抽提出来，然后用双向纸层析，用标准醚抽提出来，然后用双向纸层析，用标准DNP-氨基酸比较，氨基酸比较，取下色斑，用取下色斑，用1%NaHCO3洗脱，洗脱，360nm波长比色进行定量。波长比色进行定量。酸水解酸水解 （二）丹磺酰氯法（二）丹磺酰氯法（Dansyl-Cl or DNS-Cl）Dansyl-Cl 是一种荧光试剂，能专一地与是一种荧光试剂，能专一地与N-端端-氨基反应，生成氨基反应，生成DNS-DNS-肽肽,经酸水解后得到经酸水解后得到DNS-DNS-氨基酸和其它游离氨基酸。氨基酸和其它游离氨基酸。（DNS-Cl）NCH3CH3SO2Cl +H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-.R1R2R3蛋白质蛋白质HCl NCH3CH3SO2-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-.R1R2R3（DNS-Protein）酸水解酸水解 NCH3CH3SO2-HN-CH-COOH R1各种游离氨基酸各种游离氨基酸（DNS-AA）DNS-AA在紫外线下在紫外线下有强烈荧光，灵敏度高，有强烈荧光，灵敏度高，比二硝基氟苯高比二硝基氟苯高100倍，倍，而且水解产物不需要提而且水解产物不需要提取，样品可直接进行纸取，样品可直接进行纸层析。此方法已被广泛层析。此方法已被广泛应用于应用于N-端氨基酸分析端氨基酸分析。（三）异硫氰酸苯酯法（三）异硫氰酸苯酯法（PITC）：）：此法是此法是 Edman 1950提出的，也称提出的，也称Edman降解法。最大优点是可以连续降降解法。最大优点是可以连续降解，所以成为蛋白质氨基酸序列测定的基本原理和方法。（见后）解，所以成为蛋白质氨基酸序列测定的基本原理和方法。（见后）常用肼解法：常用肼解法：此法是多肽链此法是多肽链C-端氨基酸分析。多肽与肼在无水条件下加端氨基酸分析。多肽与肼在无水条件下加热（热（100oC)，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与与C-端氨基酸分离。端氨基酸分离。二、二、C-末端氨基酸的测定末端氨基酸的测定H2N-NH2(肼）肼）H2N-CH-CO-NHCO-NH-CH-CO-NH-CH-COOHR1R(n-1)RnH2N-CH-CO-NHNH2 +NH2-CH-CO-NHNH2 +H2N-CH-COOHR1R(n-1)Rn44 肽键的专一性裂解和肽段的分离纯化肽键的专一性裂解和肽段的分离纯化 由于用由于用Edman 降解法测定氨基酸序列，一次只能连续降解降解法测定氨基酸序列，一次只能连续降解数数10个个残基。残基。用手工方法最多能测用手工方法最多能测20个氨基酸残基。所以需要将大肽裂解成小肽，然后个氨基酸残基。所以需要将大肽裂解成小肽，然后分别对其测序。裂解要求切点少，专一性强，收率高。分别对其测序。裂解要求切点少，专一性强，收率高。裂解方法主要有：化学法和酶法裂解方法主要有：化学法和酶法裂解时，一般裂解时，一般先将二硫键还原先将二硫键还原，并用烷化剂使其烷基化，从而不会重新氧，并用烷化剂使其烷基化，从而不会重新氧化成二硫键。化成二硫键。（一）（一）蛋白质的化学裂解蛋白质的化学裂解一、一、肽链的专一性裂解肽链的专一性裂解 化学裂解的产物片段较大，适合在自动序列分析仪上测定，同时也利于化学裂解的产物片段较大，适合在自动序列分析仪上测定，同时也利于肽段的吻合。肽段的吻合。1.溴化氰裂解：溴化氰裂解：溴化氰能专一裂解蛋氨酸残基羧基的肽键，产率达溴化氰能专一裂解蛋氨酸残基羧基的肽键，产率达85%。.-NHCHCNHCHCO-.CH2CH3CH2SO.-NHCHCNHCHCO-.CH2CH3CH2SOCN+Br-CNBrRRCH3-S-CN.-NHCHC=NHCHCO-.RCH2CH2O+.-NHCHC=OCH2CH2O H2ONH2CHCO-.RN-端侧肽端侧肽高丝氨酸高丝氨酸内酯内酯C-端侧肽端侧肽 用此法裂解用此法裂解Met-X肽时，肽时，X的性质可影响的性质可影响裂解速度，特别是裂解速度，特别是含羟基的氨基酸会干扰含羟基的氨基酸会干扰反反应，应加大溴化氰的浓度（应，应加大溴化氰的浓度（500：1）；）；在酸性条件下，可引起其它肽键裂解，特在酸性条件下，可引起其它肽键裂解，特别是别是Asp-Pro 2.亚碘酰基苯甲酸裂解法：打开亚碘酰基苯甲酸裂解法：打开Trp-X的肽键。的肽键。3.X-Cys 键的裂解：常用两种试剂：键的裂解：常用两种试剂：2-硝基硝基5-硫氰苯甲酸（硫氰苯甲酸（NTCB）和）和（2-甲基）甲基）-N-1-苯磺酰苯磺酰-N-（溴乙酰）醌二亚酰胺（溴乙酰）醌二亚酰胺（Cyssor)4.羟胺裂解：裂解羟胺裂解：裂解Asn-Gly肽键。肽键。5.Asp-Pro键的裂解：在稀酸溶液中就可断裂。键的裂解：在稀酸溶液中就可断裂。（二）（二）蛋白质的酶法裂解蛋白质的酶法裂解优点：专一性好，不易破坏氨基酸。常用的酶：优点：专一性好，不易破坏氨基酸。常用的酶：1.胰蛋白酶：胰蛋白酶：Lys(Arg)X2.胰凝乳蛋白酶：专一性较宽，但对胰凝乳蛋白酶：专一性较宽，但对 疏水疏水AAX 裂解好裂解好3.胃蛋白酶：胃蛋白酶：芳香芳香AA（Leu)X 二、二、肽段的分离纯化及纯度鉴定肽段的分离纯化及纯度鉴定（一）（一）分离纯化分离纯化 根据肽段的大小、电荷、极性、溶解度等不同可以选择：凝胶根据肽段的大小、电荷、极性、溶解度等不同可以选择：凝胶过滤、离子交换、薄曾层析、毛细管电泳等过滤、离子交换、薄曾层析、毛细管电泳等 但现在常用高压液相色谱法（但现在常用高压液相色谱法（HPLCHPLC）。）。（二）（二）纯度鉴定纯度鉴定样品中只有一条肽。样品中只有一条肽。N-N-端氨基酸分析只有一种氨基酸为纯品端氨基酸分析只有一种氨基酸为纯品55 肽段的序列测定肽段的序列测定一、手工一、手工序列测定技术：化学法和酶法序列测定技术：化学法和酶法（一）（一）Edman Edman 化学降解法化学降解法 此法比较有效，是最基本的方法。所用试剂是异硫氰酸苯酯（此法比较有效，是最基本的方法。所用试剂是异硫氰酸苯酯（PITCPITC）H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-.R1R2R3N=C=S异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯（PITC）（肽）（肽）在碱性（在碱性（pH9-9.5）下进行下进行偶联反应偶联反应-H N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-.R1R2R3N-CS异硫氰酸苯酯肽异硫氰酸苯酯肽（PTC-肽）肽）NH-CCSNH CH-R1=O NH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-.R2R3+2-苯胺基苯胺基-5-噻唑啉酮噻唑啉酮衍生物衍生物（PTZ）在强酸条件下在强酸条件下裂解裂解 在在HCl,80oC下下转化转化NCCSNHCH-R1=O 3-苯基苯基-2-乙内酰脲乙内酰脲（PTH-AA）进行下一轮进行下一轮循环反应循环反应 上述反应得到的上述反应得到的 PTH-AA PTH-AA稳定，可用薄层层析、气相色谱、回水解法（即稳定，可用薄层层析、气相色谱、回水解法（即用酸水解用酸水解PTH-AAPTH-AA，将其中的氨基酸释放出来，再用氨基酸分析仪测定），即，将其中的氨基酸释放出来，再用氨基酸分析仪测定），即得到氨基酸序列的第一个残基。得到氨基酸序列的第一个残基。裂解步骤产生的少了一个裂解步骤产生的少了一个AAAA残基的肽可以进行下一轮循环，这样可以得到残基的肽可以进行下一轮循环，这样可以得到第二个、第三个第二个、第三个.等氨基酸。等氨基酸。（二）（二）DNS-Edman 法法 是是Edman的改良方法。灵敏度较高，但酰胺和的改良方法。灵敏度较高，但酰胺和Trp不易检出不易检出。（三）酶降解法（三）酶降解法 利用外肽酶利用外肽酶 1.氨肽酶法氨肽酶法 2.羧肽酶法羧肽酶法 羧肽酶羧肽酶A:释放除释放除Pro,Arg,Lys外所有外所有C-端氨基端氨基酸残基（牛胰脏）酸残基（牛胰脏）羧肽酶羧肽酶B：只释放：只释放Arg,Lys碱性氨基酸碱性氨基酸C-端氨端氨基酸残基（猪胰脏）基酸残基（猪胰脏）羧肽酶羧肽酶Y：20种氨基酸全释放（面包酵母）种氨基酸全释放（面包酵母）二、自动序列分析二、自动序列分析 为减轻手工测序的烦琐劳动，提高每次循环的收率，基于为减轻手工测序的烦琐劳动，提高每次循环的收率，基于EdmanEdman反应反应原理，人们研制了氨基酸序列分析仪。原理，人们研制了氨基酸序列分析仪。有三类序列仪：液相、固相和气相。有三类序列仪：液相、固相和气相。66 由已知序列的肽段建立蛋白质一级结构由已知序列的肽段建立蛋白质一级结构一、重叠肽（接头肽）一、重叠肽（接头肽）用至少两套切肽链的方法，得到两套以上的肽段及其各肽用至少两套切肽链的方法，得到两套以上的肽段及其各肽段的氨基酸排列顺序，然后根据两套肽段的重叠区域，就可以段的氨基酸排列顺序，然后根据两套肽段的重叠区域，就可以查出蛋白质的整个氨基酸排列顺序。查出蛋白质的整个氨基酸排列顺序。二、二硫键位置的确定二、二硫键位置的确定 在测定一级结构时，肽链二硫键都是用烷化剂保护的。在在测定一级结构时，肽链二硫键都是用烷化剂保护的。在测出一级结构后，需要确定哪几个测出一级结构后，需要确定哪几个CysCys形成二硫键。形成二硫键。方法：直接用蛋白酶（内切酶）水解原来的蛋白质，保留二硫方法：直接用蛋白酶（内切酶）水解原来的蛋白质，保留二硫键的完整性，然后找出含二硫键的肽（用对角线电泳法），再键的完整性，然后找出含二硫键的肽（用对角线电泳法），再将这个肽的二硫键拆开，分别测定两个肽的序列，将这两个肽将这个肽的二硫键拆开，分别测定两个肽的序列，将这两个肽段的序列与原来的一级结构对比，就可以找出相应的二硫键的段的序列与原来的一级结构对比，就可以找出相应的二硫键的位置。位置。对角线电泳法：用蛋白酶水解原来的蛋白，得到一系列对角线电泳法：用蛋白酶水解原来的蛋白，得到一系列肽段（包括含二硫键的肽段）后，先进性第一向电泳，将肽段（包括含二硫键的肽段）后，先进性第一向电泳，将产物分开；再用还原剂（碘乙酸等）处理，将二硫键打开，产物分开；再用还原剂（碘乙酸等）处理，将二硫键打开，在进行第二向电泳，电泳条件与第一向完全相同。选取偏在进行第二向电泳，电泳条件与第一向完全相同。选取偏离对角线的样品离对角线的样品(多肽或寡肽），即为含二硫键的肽。多肽或寡肽），即为含二硫键的肽。如果二硫键在一条肽链内存在，而且在该肽链中另有一个如果二硫键在一条肽链内存在，而且在该肽链中另有一个Cys,Cys,则应该在未拆开二硫键之前，将则应该在未拆开二硫键之前，将1414C-C-碘乙酰胺封闭，二硫碘乙酰胺封闭，二硫键不参与此反应，这样可以