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重组DNA药物重重组DNA药物物一、重一、重组DNA技技术与基因工程的基本定与基因工程的基本定义重重组DNA技技术是指将一种生物体(是指将一种生物体(供体供体)的基因与)的基因与载体体在体外在体外进行拼接重行拼接重组,然后,然后转入另一种生物体(入另一种生物体(受受体体)内,使之按照人)内,使之按照人们的意愿的意愿稳定定遗传并表达出新并表达出新产物或新性状的物或新性状的DNA体外操作程序,也称体外操作程序,也称为分子克隆技分子克隆技术。因此,因此,供体供体、受体受体、载体体是重是重组DNA技技术的三大基本的三大基本元件。元件。2重组DNA药物基因工程基因工程是指重是指重组DNA技技术的的产业化化设计与与应用,包括用,包括上游技上游技术和和下游技下游技术两大两大组成部分。成部分。上游技上游技术指的是基因重指的是基因重组、克隆和表达的、克隆和表达的设计与与构建(即重构建(即重组DNA技技术);而下游);而下游则涉及到基涉及到基因工程菌或因工程菌或细胞的大胞的大规模培养以及基因模培养以及基因产物的分物的分离离纯化化过程。程。3重组DNA药物优点:点:1、可大量生、可大量生产过去去难以以获得的生理活性蛋白得的生理活性蛋白和多和多肽;去除内源性物;去除内源性物质的不足之的不足之处2、提供足、提供足够数量的生理活性物数量的生理活性物质,以,以进行生行生理生化、理生化、结构的研究构的研究3、利用基因工程技、利用基因工程技术可可发现、挖掘更多内源、挖掘更多内源性生理活性物性生理活性物质4、获得新型化合物得新型化合物4重组DNA药物主要基因工程主要基因工程主要基因工程主要基因工程产产品的研制、开品的研制、开品的研制、开品的研制、开发发、上市、上市、上市、上市时间时间产品产品人生长激素释放抑制素(人生长激素释放抑制素(SRM)人胰岛素人胰岛素首次克隆首次克隆表达时间表达时间国家国家用途用途首次进入首次进入市场时间市场时间国家国家/地区地区1977日本日本治疗巨人症治疗巨人症1978美国美国治疗糖尿病治疗糖尿病1982欧洲欧洲人生长激素(人生长激素(HGH)1979美国美国治疗侏儒症治疗侏儒症1985美国美国人人干扰素(干扰素(IFN)1980美国美国治疗病毒感染症治疗病毒感染症1985美国美国乙肝疫苗乙肝疫苗1983美国美国预防乙型肝炎预防乙型肝炎1986欧洲欧洲人白细胞介素人白细胞介素21984日本日本治疗肿瘤治疗肿瘤1989欧洲欧洲人促红细胞生成素人促红细胞生成素治疗贫血治疗贫血1988欧洲欧洲人粒细胞集落刺激因子人粒细胞集落刺激因子治疗中性白细胞治疗中性白细胞减少症减少症1991美国美国人组织纤溶酶原激活剂人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)治疗血栓症治疗血栓症1987美国美国5重组DNA药物DNADNA重重重重组药组药物制造的主要步物制造的主要步物制造的主要步物制造的主要步骤骤获得目的基因获得目的基因DNA的体外重组的体外重组(切与连)(切与连)载体的选择受体细胞的选择重组重组DNA分子转化分子转化(转)(转)转化子的筛选与鉴定转化子的筛选与鉴定(选)(选)外源基因的大规模表达和分离纯化外源基因的大规模表达和分离纯化产品的检验和制剂制备产品的检验和制剂制备6重组DNA药物7重组DNA药物二、基本二、基本过程程上游阶段:实验室获得目的基因、酶切和酶连、插入适当载体、转入宿主细胞、复制、目的基因分析确证、表达、筛选合适表达系统等下游阶段:将实验室成果产业化发酵参数确定、新型生物反应器研制、高效分离介质及装置开发、生物传感器设计制造、电子计算机优化控制、产品质量控制v注意:上游注意:上游DNA重重组的的设计必必须以以简化下游操作工化下游操作工艺和装和装备为指指导思想;而下游思想;而下游过程程则是上游基因重是上游基因重组蓝图的体的体现和保和保证,这是基因工程是基因工程产业化的基本原化的基本原则。8重组DNA药物1、目的基因的、目的基因的获得得1)、)、鸟枪法(基因文法(基因文库)基因基因组DNA提取提取限制性内切限制性内切酶部分水解部分水解与与载体体连接接转化、化、扩增与增与筛选2)、逆)、逆转录法(法(cDNA文文库)mRNA纯化化cDNA第一合成第一合成第二第二链合成合成cDNA克隆克隆将重将重组体体导入宿主入宿主细胞胞cDNA文文库鉴定定目的目的cDNA克隆的分离和克隆的分离和鉴定定3)、合成法)、合成法4)、)、PCR法法9重组DNA药物4、PCR法或逆法或逆转录PCR(RT-PCR)典型PCR反应包括 模板变性 94以上(12)退火 5055(12)延伸 72(12)在高温聚合酶作用下,以DNA单链为模板,由引物起始从53 延伸。10重组DNA药物(c)(c)(b)(b)引物引物引物引物2 2553333335555(d)d)新引物新引物新引物新引物5533靶靶靶靶DNADNA的扩增的扩增的扩增的扩增(a)(a)5533引物引物引物引物1 13 3 553355引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链单位长度的链单位长度的链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链5 5 3 3 3355引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链目的片段(不同长度的链未示出)目的片段(不同长度的链未示出)目的片段(不同长度的链未示出)目的片段(不同长度的链未示出)聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)11重组DNA药物55333355靶靶靶靶DNADNA片段片段片段片段引物引物引物引物A A5 55 5引物引物引物引物AA3333PCRPCRPCRPCRPCRPCR3 33 35555PCRPCR引物引物引物引物B B引物引物引物引物C C5 55 53333混合混合混合混合,变性变性变性变性,退火退火退火退火5533553333553355+DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶5533335555333355用引物用引物用引物用引物B B和和和和C C作作作作PCRPCRPCRPCRPCRPCR定点诱变定点诱变定点诱变定点诱变PCRPCR用于基因突变用于基因突变12重组DNA药物13重组DNA药物14重组DNA药物化学合成法化学合成法 在已知DNA序列或多肽的一般结构时,如链长在 60bp100bp可用化学合成法直接合成DNA。15重组DNA药物16重组DNA药物2、基因表达、基因表达1)、)、选择宿主宿主细胞胞原核原核大大肠杆菌杆菌:生:生长快;快;遗传研究深入;研究深入;产品多品多为胞内(包含体)或周胞内(包含体)或周质中;不能糖基化修中;不能糖基化修饰。需注意内毒素需注意内毒素污染。染。枯草芽枯草芽孢杆菌杆菌:分泌力分泌力强,不形成包含体;,不形成包含体;不修不修饰;胞外;胞外酶可能会降解可能会降解产物物链霉菌霉菌:分泌能力:分泌能力强;不致病,安全;有糖;不致病,安全;有糖基化能力。基化能力。17重组DNA药物优点:易大量生产,成本低,周期短 缺点:多为胞内表达、提取困难,易生成包含体、含起始密码Met(AUG),有内毒素毒性18重组DNA药物真核真核酵母酵母:研究基因表达:研究基因表达调控最有效的控最有效的单细胞真核微胞真核微生物;基因生物;基因组小,小,仅为大大肠杆菌杆菌4倍;倍;传代代时间短;无毒;有分泌功能和修短;无毒;有分泌功能和修饰功能;已用于功能;已用于干干扰素、乙肝表面抗原等重素、乙肝表面抗原等重组DNA药物的生物的生产。丝状真菌状真菌:有很:有很强的蛋白的蛋白质分泌能力,能正确加分泌能力,能正确加工,糖基化方式与高等生物相似,有成熟工,糖基化方式与高等生物相似,有成熟发酵酵和后和后处理工理工艺哺乳哺乳动物物细胞胞:类似天然似天然产物,但培养条件苛刻物,但培养条件苛刻19重组DNA药物大大肠杆菌与真核杆菌与真核细胞表达系胞表达系统比比较大肠杆菌大肠杆菌:发酵发酵 包含体包含体 复性复性 纯化纯化 目的蛋白目的蛋白真核细胞真核细胞:发酵发酵 上清液上清液 纯化纯化 目的蛋白目的蛋白20重组DNA药物大大肠杆菌表达的重杆菌表达的重组蛋白易形成包含体蛋白易形成包含体 高效表达的目的蛋白高效表达的目的蛋白在大在大肠杆菌内形成杆菌内形成大大量无活性包含体。量无活性包含体。因无法有效的解决复因无法有效的解决复性性问题,在美国每,在美国每年年造成的造成的经济损失就失就达达几十几十亿美元美元包含体电镜图包含体电镜图21重组DNA药物蛋白蛋白质复性概念复性概念将蛋白将蛋白质从从结构不构不规则、无、无 活性的状活性的状态,恢复到有唯一,恢复到有唯一 立体立体结构、有生物活性的构、有生物活性的状状态的的过程称程称为蛋白蛋白质复性复性。22重组DNA药物2)、表达)、表达载体体 要求:要求:a、能独立复制、能独立复制b、有灵活的多克隆位点和方便的、有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记c、具有有效运、具有有效运载外源基因的能力,能携外源基因的能力,能携带大大小不同的外源基因小不同的外源基因d、容易控制,在、容易控制,在细胞内胞内稳定性高,安全可靠。定性高,安全可靠。23重组DNA药物 如大如大肠杆菌的杆菌的pBV220系系统,为温度温度诱导表表达达载体,已成功用于体,已成功用于IL-2,IL-3,IFN等等pET系系统,最有潜力的系,最有潜力的系统,可用乳糖代替,可用乳糖代替IPTG(异丙基硫代(异丙基硫代-D-半乳糖),半乳糖),产物可物可达达细胞胞总蛋白蛋白2030%,表达量可达,表达量可达总蛋白蛋白50%。24重组DNA药物pETpET载载体体体体25重组DNA药物 3)、构建工程菌)、构建工程菌 目的基因与目的基因与载体体DNA的的连接接v重重组DNA向宿主向宿主细胞内胞内转移移v筛选与与鉴定定带有目的基因的阳性克隆有目的基因的阳性克隆v影响目的基因表达的因素影响目的基因表达的因素26重组DNA药物三、重三、重组药物的分离物的分离纯化化 A 重重组蛋白分离蛋白分离纯化方法化方法选择的基本原的基本原则针对不用的不用的产物表达形式采取不同的策略物表达形式采取不同的策略针对不同性不同性质的重的重组蛋白蛋白选择不同的不同的层析析类型型多种分离多种分离纯化技化技术的的联合运用合运用合适分离合适分离纯化介化介质的的选择分离分离纯化化过程的程的规模化模化27重组DNA药物针对不同的不同的产物表达形式采取不同的策略物表达形式采取不同的策略采用采用分泌型分泌型战略表达重略表达重组蛋白,通常体蛋白,通常体积大、大、浓度低,因此度低,因此应在在纯化之前采用沉淀或超化之前采用沉淀或超滤等方法先等方法先进行行浓缩处理;理;采用采用包涵体包涵体型型战略表达重略表达重组蛋白,蛋白,应先离心回收先离心回收包涵体;包涵体;采用采用融合型融合型战略表达重略表达重组蛋白,一般是胞内可溶蛋白,一般是胞内可溶性的,性的,拟首先首先选用用亲和和层析析进行行纯化化表达在表达在细胞膜和胞膜和细胞壁之胞壁之间的的间隙中隙中的蛋白的蛋白质,应用低用低浓度的溶菌度的溶菌酶处理,然有再用渗透理,然有再用渗透压休克法休克法释放重放重组蛋白。蛋白。28重组DNA药物针对不同性不同性质的重的重组蛋白蛋白选择不同的不同的层析析类型型等等电点点处于极端区域(于极端区域(大于大于8或小于或小于5)的重)的重组蛋白蛋白应首首选离子交离子交换法法进行分离,行分离,这样很容易除去几乎所有的很容易除去几乎所有的杂蛋白;蛋白;重重组蛋白特异性的蛋白特异性的配体配体、底物底物、抗体抗体、糖糖链等都是首等都是首选亲和和层析析纯化方法的重要条件,原化方法的重要条件,原则是它是它们与目与目标蛋白之蛋白之间的的解离常数解离常数应在合适的范在合适的范围内(内(108104mol/L);疏水疏水层析析和和反相反相层析析是根据蛋白是根据蛋白质的的疏水性疏水性差异差异进行分离行分离的;的;凝胶凝胶过滤层析析是根据蛋白的是根据蛋白的分子量和体分子量和体积差异差异进行分离行分离的;的;径向径向层析析是近年来是近年来发展起来的集展起来的集层析分离析分离和和膜分离膜分离于一于一体的一种复合技体的一种复合技术,在流量、,在流量、负荷量等参数方面荷量等参数方面显示出极大的示出极大的优越性。越性。29重组DNA药物多种分离多种分离纯化技化技术的的联合运用合运用在在进行重行重组蛋白的蛋白的纯化化时,通常需要,通常需要综合使用多合使用多种技种技术,一般来,一般来说,在,在选择分离分离纯化方法化方法时应遵循下遵循下列原列原则:应选择不同分离不同分离纯化机理的方法化机理的方法联合使用合使用应首先首先选择能除去含量最多能除去含量最多杂质的方法的方法应尽量尽量选择高效的分离方法高效的分离方法应将最将最费时、成本最高的分离、成本最高的分离纯化方法安排化方法安排在最后在最后阶段段30重组DNA药物合适分离合适分离纯化介化介质的的选择常用的蛋白常用的蛋白质分离分离纯化介化介质有有Sephadex和和Sepharose。理想的分离。理想的分离纯化介化介质应具有下列具有下列性性质:对目目标蛋白具有蛋白具有较高的分辨高的分辨效率效率 对目目标蛋白不会造成蛋白不会造成变性性 化学性能和机械性能化学性能和机械性能稳定,定,重复性好重复性好 价格低廉价格低廉31重组DNA药物分离分离纯化化过程的程的规模化模化蛋白蛋白质分离分离纯化的化的实验室工室工艺、技、技术、方法在、方法在大大规模模产业化化过程未必合适,如:程未必合适,如:实验室方法在工程上可能室方法在工程上可能难以以实现(超声(超声波破波破细胞壁)胞壁)实验室方法在大室方法在大规模生模生产中可能成本中可能成本过高高(超速离心)(超速离心)因此,在很多情况下,因此,在很多情况下,实验室的技室的技术路路线不等不等于生于生产工工艺。32重组DNA药物四、四、质量控制量控制v1、原材料、原材料质量控制:量控制:2、培养、培养过程程质量控制量控制3、纯化工化工艺质量控制量控制4、目、目标产品品质量控制量控制33重组DNA药物保保证编码DNA序列正确序列正确要了解以下特性:要了解以下特性:A、目的基因来源、克隆、目的基因来源、克隆过程、序列程、序列B、表达、表达载体名称、体名称、结构、构、遗传特性及特性及酶切切图谱、抗生素、抗生素标记等等C、宿主名称、来源、宿主名称、来源、传代代历史、史、检定定结果果及生物学特征及生物学特征D、载体引入宿主方式、及体引入宿主方式、及载体再宿主中状体再宿主中状态E、插入基因于表达、插入基因于表达载体两体两侧控制区核酸序控制区核酸序列列F、启、启动和控制克隆基因表达的方法及水平和控制克隆基因表达的方法及水平34重组DNA药物v种子克隆种子克隆纯而且而且稳定,在培养工程中工定,在培养工程中工程菌不程菌不应出出现无突无突变或或质粒粒丢失的失的现象象v种子批系种子批系统v工作工作细胞胞库35重组DNA药物v尽量去除尽量去除污染病毒、核酸、宿主染病毒、核酸、宿主细胞胞杂蛋白蛋白等等杂质,并避免在,并避免在纯化化过程程带入有害物入有害物质 纯化每一步化每一步应测定定纯度、度、计算提算提纯倍数、收倍数、收率等等率等等36重组DNA药物1)、)、产品的品的鉴别氨基酸氨基酸组成分析:成分析:肽图分析:分析:N末端和末端和C末端氨基酸末端氨基酸测序:序:蛋白蛋白质二硫二硫键的分析:的分析:重重组蛋白相蛋白相对分子量:分子量:等等电点的点的测定:定:2)、)、纯度分析:度分析:SDS-PAGE,CE,IEF,HPLC3)、生物活性)、生物活性测定定4)、残余)、残余杂质检测 宿主宿主细胞蛋白含量、宿主胞蛋白含量、宿主细胞胞DNA、残余抗生素等、残余抗生素等5)、安全性)、安全性检测无菌无菌实验、热原原实验、毒性、毒性实验、免疫原性、免疫原性检查37重组DNA药物A 体内生物学活性体内生物学活性测定方法定方法生物学模型生物学模型生生长激素激素大鼠大鼠脑垂体垂体B 体外生物学活性体外生物学活性测定方法定方法 如:如:MTT法法:MTT formazan(蓝紫紫色色)干干扰素素类蛋白:可用蛋白:可用细胞毒抑制胞毒抑制试验来来测定干定干扰素的体外活性。素的体外活性。琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶38重组DNA药物五、重要的重五、重要的重组DNA药物物(一)利用重(一)利用重组大大肠杆菌生杆菌生产医用蛋白或多医用蛋白或多肽 代表代表产品:重品:重组人胰人胰岛素、重素、重组人生人生长激素、重激素、重组人干人干扰素、素、重重组人白人白细胞介素、重胞介素、重组人集落刺激因子、重人集落刺激因子、重组抗体及其片抗体及其片断等。断等。v 效率高、效率高、产量大量大vv 周期短、成本低周期短、成本低vv 工工艺稳定、定、质量可控量可控vv 缺点是易形成包含体缺点是易形成包含体39重组DNA药物1 1)、干)、干扰素(素(IFN-、)1957年年Isaccs等等发现病毒干病毒干扰现象,即病毒象,即病毒感染的感染的细胞能胞能产生一种因子,作用于其他生一种因子,作用于其他细胞胞干干扰病毒复制,因而命名病毒复制,因而命名为干干扰素。素。根据根据产生干生干扰素素细胞的来源、理化性胞的来源、理化性质和生和生物活性等差异,可分物活性等差异,可分为、等等3种,其中种,其中IFN-为多基因多基因产物,有物,有23种以上的种以上的亚型。型。40重组DNA药物 1986年,年,FDA批准批准Roch公司的重公司的重组IFN-2a和和Schering公司的重公司的重组IFN-2b,重,重组IFN-、分分别在在1990年和年和1993年上市。年上市。我国中国我国中国预防医学科学院病毒学研究所侯防医学科学院病毒学研究所侯云德等云德等发现中国人受病毒攻中国人受病毒攻击产生的干生的干扰素主要素主要为IFN-1b型,型,1992年我国第一个年我国第一个基因工程基因工程药物物IFN-1b获得国家一得国家一类新新药证书。41重组DNA药物2)胰)胰岛素素(Insulin,Ins)1921年,年,Banting FG等从胰等从胰脏中分离中分离1955年,年,Sanger F测序序1965年,我国完成年,我国完成结晶牛胰晶牛胰岛素全合成素全合成1979年,年,Rutter W等克隆了胰等克隆了胰岛素基因素基因1982年,第一个重年,第一个重组人胰人胰岛素批准上市素批准上市42重组DNA药物44重组DNA药物v(a)AB链分分别表达法表达法 体外折叠成功率低,通常只有1020v(b)人胰人胰岛素原表达法素原表达法 由于C肽的存在,胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象,为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件,使得体外折叠率高达80以上 目前Ely Lily用这种工艺路线年产几十吨的重组人胰岛素,其经济效益相当可观。v(c)AB链同同时表达法表达法45重组DNA药物46重组DNA药物47重组DNA药物3)生)生长激素激素1944年,李卓浩等从牛垂体中分离出牛生年,李卓浩等从牛垂体中分离出牛生长激素激素1956年,从人垂体中分离出年,从人垂体中分离出hGH1969年,年,hGH序列序列报道道临床上用于垂体性侏儒症。床上用于垂体性侏儒症。19561985年,年,只能从人尸体垂体中分离只能从人尸体垂体中分离纯化。但至化。但至1985年,年,共共发现50多例克多例克-雅氏症,雅氏症,5人病亡,研究人病亡,研究结果果证实由垂体来源的生由垂体来源的生长激素激素污染有染有朊病毒。病毒。1985年,垂体来源的被禁用,同年,年,垂体来源的被禁用,同年,rhGH上市。上市。48重组DNA药物v1985年,美国年,美国FDA批准由大批准由大肠杆菌杆菌发酵生酵生产的重的重组人生人生长激素上市,随后各种途径生激素上市,随后各种途径生产的重的重组人生人生长激素迅速充斥市激素迅速充斥市场。1997年,年,仅美国美国Genentech和和Ely Lily两家公司的重两家公司的重组人生人生长激素年激素年产量已达量已达20kg,年,年销售售额超超过3.5亿美元。美元。v人生人生长激素的激素的结构与性构与性质v重重组人生人生长激素工程菌的构建激素工程菌的构建49重组DNA药物50重组DNA药物(二)利用重(二)利用重组酵母生酵母生产医用蛋白医用蛋白优势:v1.1.最最简单的真核生物,基因表达的真核生物,基因表达调控机理控机理较清楚,清楚,并且并且遗传操作相操作相对较为简单;v2.2.具有原核无法比具有原核无法比拟的真核生物蛋白翻的真核生物蛋白翻译后修后修饰加工系加工系统v3.3.不含有特异性的病毒,不不含有特异性的病毒,不产生毒素,有些酵母生毒素,有些酵母菌在食品工菌在食品工业当中有着几百年的当中有着几百年的应用用历史,属于史,属于安全型基因工程受体系安全型基因工程受体系统;v4.4.大大规模模发酵工酵工艺简单,成本低廉,成本低廉v5.5.能将外源基因表达能将外源基因表达产物分泌至培养基中物分泌至培养基中劣劣势:虽然然拥有完整的蛋白有完整的蛋白质糖基化修糖基化修饰系系统,但其,但其修修饰方式不用于高等真核生物。方式不用于高等真核生物。v举例:重例:重组乙肝疫苗乙肝疫苗 重重组人血清白蛋白人血清白蛋白51重组DNA药物重组HAS的制备v人血清白蛋白人血清白蛋白HAS是血是血浆中的主要成分中的主要成分 载体蛋白。体蛋白。成熟的人血清白蛋白成熟的人血清白蛋白为一非糖基化的一非糖基化的单一多一多肽链,由,由585个氨基酸个氨基酸组成,含有成,含有17对二硫二硫键,由此,由此维系的空系的空间构象是血清白蛋白的生物功能所必需的。构象是血清白蛋白的生物功能所必需的。v巴斯德巴斯德毕赤酵母是迄今赤酵母是迄今为止最止最为优良的重良的重组人血清白人血清白蛋白的表达分泌系蛋白的表达分泌系统。产率可高达率可高达15g/L 52重组DNA药物(三)利用(三)利用转基因基因动物或物或细胞生胞生产生物大分子生物大分子v1.利用利用动物乳腺物乳腺组织生生产蛋白蛋白药物物v 酪蛋白酪蛋白、tPA、IL2v2.利用哺乳利用哺乳动物物细胞大胞大规模培养技模培养技术生生产复复杂的人体蛋白的人体蛋白v例如例如 EPO53重组DNA药物促促红细胞生成素(胞生成素(EPO)由由肾脏分泌的一种唾液酸蛋白,它能促分泌的一种唾液酸蛋白,它能促进红细胞系的增胞系的增值、分化和成熟、分化和成熟.由由166个氨基酸残基个氨基酸残基组成的高度糖基化蛋白,成的高度糖基化蛋白,其糖基其糖基对其生物活性至关重要其生物活性至关重要 目前用哺乳目前用哺乳动物物细胞表达系胞表达系统如如CHO细胞生胞生产。临床床为治治疗肾衰衰导致致贫血的首血的首选药物,全世界物,全世界销售售额超超过10亿美元。美元。54重组DNA药物v1957年年Jacobson等等证实,肾脏是血清是血清EPO的主要来源,含量极微小,无法分离的主要来源,含量极微小,无法分离纯化化获得得纯品。直到品。直到1985年,年,Jacobs等才先后成功等才先后成功克隆出人、猴、小鼠的克隆出人、猴、小鼠的EPO基因,随后重基因,随后重组人人EPO在在CHO细胞中胞中获得表达,并通得表达,并通过层析析纯化技化技术制制备出出rHuEPO纯品,于品,于1989年年获得美国得美国FDA批准后首次投放市批准后首次投放市场。55重组DNA药物EPO制备工艺 v根据已知天然根据已知天然EPO的氨基酸序列,合成相的氨基酸序列,合成相应的寡聚核苷酸探的寡聚核苷酸探针,筛选出人出人EPO基因,引入真核生物基因,引入真核生物质粒表达粒表达载体体PD11,用磷酸用磷酸钙微量沉淀法微量沉淀法转染染CHO细胞,克隆培养后,胞,克隆培养后,检测培培养上清中养上清中EPO的生物学活性,的生物学活性,筛选出高效表达出高效表达EPO的的细胞胞株,按照株,按照中国生物制品中国生物制品规程程要求建立种子要求建立种子库,检定合格定合格后用于生后用于生产。v CHO工程工程细胞在条件培养基中培养胞在条件培养基中培养时,表达的,表达的EPO分泌分泌到培养上清中,上清液中除了到培养上清中,上清液中除了EPO外,外,还含有培养基成分和含有培养基成分和其他其他杂蛋白,利用蛋白,利用EPO 本身的物理化学性本身的物理化学性质,将培养上清,将培养上清液加液加热至至80,或用,或用6mol/L盐酸胍、酸胍、8mol/L尿素沉淀,可尿素沉淀,可以除去大多数以除去大多数杂蛋白。上清液超蛋白。上清液超滤浓缩后,后,经过一系列的凝一系列的凝胶胶过滤层析,如析,如Sephadex G25,Sephacryl S200及及Biogel P 等多步凝胶等多步凝胶过滤,其,其EPO的的纯度可达到度可达到90以以上。上。进一步一步纯化可用化可用Sepharose 4B偶偶联EPO单克隆抗体或克隆抗体或多克隆抗体多克隆抗体亲和和层析或析或经高高压液相液相层析,其析,其EPO纯度可达度可达99以上以上。56重组DNA药物根据氨基酸序列根据氨基酸序列合成寡聚核苷酸合成寡聚核苷酸筛选出筛选出EPO基因基因与真核载体连接转化与真核载体连接转化重组质粒重组质粒转染转染CHO筛选筛选高表达高表达CHO工程细胞工程细胞建立种子库建立种子库CHO工程细胞工程细胞培养培养培养液培养液去杂蛋白去杂蛋白初提取液初提取液80 盐酸胍盐酸胍凝胶层析凝胶层析EPO 纯度纯度达达90HPLC 或亲合层析或亲合层析EPO纯度达纯度达9957重组DNA药物
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