重组DNA技术培训课件

本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。重重 组组 DNA技技 术术（recombinant DNA technology）又又称称分分分分子子子子克克克克隆隆隆隆（molecular cloning）或或DNA克克隆隆（DNA cloning）或或基基因因克克隆隆（gene cloning)技技术术，是是指指在在体体外外利利用用酶酶学学方方法法将将目目的的DNA片片段段与与能能自自主主复复制制的的遗遗传传元元件件（又又叫叫载载体体）连连接接，形形成成重重组组DNA分分子子，进进而而在在受受体体细细胞胞中中复复制制、扩扩增增，从从而而获获得得单单一一DNA分分子的大量拷贝。子的大量拷贝。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。第第 一一 节节重组重组DNADNA技术中常用的技术中常用的工具酶工具酶 Frequently Used Enzymes in Recombinant DNA Technology本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，羟基末端之间形成磷酸二酯键，使使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基反转录酶反转录酶合成合成cDNA；替代；替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析末端脱氧核苷末端脱氧核苷酰转移移酶酶在在3羟基末端进行同聚物加尾羟基末端进行同聚物加尾DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接；缺口平移制作高比活性探针；分子或片段连接；缺口平移制作高比活性探针；DNA序列分析；填补序列分析；填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二第二链合成，双链链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等Taq DNA聚合聚合酶酶常用于常用于PCR；产物的物的3末端末端带有有A，可用于，可用于T-A克隆克隆多核苷酸激酶多核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。一、限制性核酸内切酶用于切割一、限制性核酸内切酶用于切割DNA定义定义:限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶(restriction endonuclease,RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列,并并在在识识别别位位点点或或其其周周围围切切割割双双链链DNA的的一一类类内内切切酶酶。限限制制性性核核酸酸内内切切酶是重组酶是重组DNA技术中重要的工具酶。技术中重要的工具酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）；第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 种种 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶（一）重组（一）重组DNA技术中通常使用技术中通常使用型限制酶型限制酶 本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（二）（二）型限制性内切酶具有一些共性和特性型限制性内切酶具有一些共性和特性1.具有特定的识别和切割位点具有特定的识别和切割位点 限制性内切酶限制性内切酶识别位点识别位点限制性内切酶限制性内切酶识别位点识别位点Apa IGGGCCCCCCGGGSma ICCCGGGGGGCCCBamH IGGATCCCCTAGGSau 3A IGATCCTAGPst ICTGCAGGACGTCNot IGCGGCCGCCGCCGGCGEcoR IGAATTCCTTAAGSfi IGGCCNNNNNGGCCCCGGNNNNNCCGG II II型限制性内切酶的识别位点举例（型限制性内切酶的识别位点举例（示切割位点）示切割位点）本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。2.识别的核苷酸序列通常为回文结构（识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome）本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口黏端切口黏端切口3.切割双链切割双链DNA分子后产生黏端或平端分子后产生黏端或平端（sticky end）（blunt end）本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。同尾酶同尾酶（isocaudarner）有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的黏黏端端，这这样样的的酶酶彼彼此此互互称称为为同同尾尾酶酶。这两个相同的黏端称为。这两个相同的黏端称为配伍末端配伍末端(compatible end)。Bam Bam HHBg Bg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A4.不同的酶可以产生同样的末端不同的酶可以产生同样的末端 本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+BstCCCGGGGGGCCCCCCCGGCCGGG G+XmaCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+Sma能能识识别别同同一一序序列列（切切割割位位点点可可同同或或不不同同）但但来来源源不不同同的两种酶互称同工异源酶（的两种酶互称同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶。）或同裂酶。5.不同的酶可以识别同一个序列不同的酶可以识别同一个序列 本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。6.6.切割会受其他因素的影响切割会受其他因素的影响 限制性内切酶通常不能切割在识别位点内有限制性内切酶通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化的序列。特异碱基甲基化的序列。缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。例如，例如，EcoR I在正常情况下识别在正常情况下识别“-GAATTC-”序列，但在甘油浓度大于序列，但在甘油浓度大于5%（v/v）或反应）或反应温度较低时识别序列可变为温度较低时识别序列可变为“-AATT-”或或“-嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶-”，这种现象称为星号活，这种现象称为星号活性（性（star activity），以），以EcoR I*表示。表示。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。二、二、DNA连接酶用于催化连接酶用于催化DNA片段连接片段连接 DNA连连接接酶酶（DNA ligase）：催催化化两两个个相相邻邻的的3-OH和和5-磷磷酸酸基基团团形形成成3，5-磷磷酸酸二二酯酯键键，从从而而使使DNA片片段段或或单单链断裂形成的缺口连接起来。链断裂形成的缺口连接起来。连接酶的作用机制连接酶的作用机制本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。1.大肠杆菌染色体编码的大肠杆菌染色体编码的 DNA连接酶连接酶 需需NAD+作为辅因子作为辅因子 2.大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体DNA编码的编码的T4 DNA连接酶连接酶 需需ATP作为辅因子作为辅因子 DNA连接酶的来源连接酶的来源本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。三、重组三、重组DNA 技术中还需使用其他常用技术中还需使用其他常用工具酶工具酶（一）（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团（二）反转录酶以（二）反转录酶以RNA为模板合成为模板合成cDNA（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端加尾以构成末端加尾以构成黏黏性末端性末端（四）（四）DNA聚合酶聚合酶I主要用于合成主要用于合成DNA（五）（五）DNA聚合酶聚合酶I大片段保留了有用的酶活性大片段保留了有用的酶活性（六）（六）Taq DNA聚合酶常用于聚合酶常用于PCR（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5羟基末端磷酸化羟基末端磷酸化本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。来来 自自 于于 大大 肠肠 杆杆 菌菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP）或或小小牛牛肠肠（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用用于于脱脱去去DNA（RNA）5末末端端的的磷磷酸酸基基团团，使使5-P成成为为5-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团磷酸基团P5OH3OH3P5OH5OH3OH3OH5本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（二）反转录酶以（二）反转录酶以RNA为模板合成为模板合成cDNA反转录酶反转录酶（reverse transcriptase）反转录酶催化的反转录酶催化的cDNA合成合成RNARNA53AAAAAAAAAAAATTTTTT53cDNAcDNA随机引物随机引物Oligo-dT本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。5 35533 53OHGGG GGdGTP末端转移酶末端转移酶（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端末端加尾以构成黏端加尾以构成黏端 本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。大大肠肠杆杆菌菌DNA聚聚合合酶酶I（DNA polymerase I）是是基基因因工工程程中中常常用用的的DNA聚聚合合酶酶。其其除除具具有有53聚聚合合酶酶活活性性外外，还还有有35及及53核核酸酸外外切切酶酶活活性性。因因其其具具有有53核核酸酸外外切切酶酶活活性性而而常常用用于于DNA探探针针的的缺缺缺缺口口口口平平平平移移移移法法法法（nick translation）标记。标记。（四）（四）DNA聚合酶聚合酶I主要用于合成主要用于合成DNA本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。DNA聚聚合合酶酶I用用枯枯草草杆杆菌菌蛋蛋白白酶酶（subtilisin）裂裂解解后后产产生生的的大大片片段段，也也称称为为 KlenowKlenow片片片片 段段段段（Klenow fragment）。其其保保留留了了53聚聚合合酶酶活活性性及及3 5外外切切酶活性，失去了酶活性，失去了5 3外切酶活性。外切酶活性。Klenow片片段段的的主主要要用用途途有有：补补齐齐双双链链DNA的的3末末端端，使使其其转转变变成成平平端端；或或通通过过补补齐齐3端端而而使使3末末端端标标记记；在在cDNA克克隆隆中中，用用于于第第二二股股链链的的合合成成；用用于于DNA序列分析。序列分析。（五）五）DNA聚合酶聚合酶I大片段保留了有用的酶活性大片段保留了有用的酶活性本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（六）（六）Taq DNA聚合酶常用于聚合酶常用于PCR Taq DNA聚聚合合酶酶具具有有良良好好的的聚聚合合活活性性和和热热稳稳定定性性，常常用用于于PCR。该该酶酶具具有有53聚聚合合酶酶活活性性及及53外外切切酶酶活活性性，但但没没有有35外外切切酶酶活活性性，因因而而无无35校对活性。校对活性。另另外外，Taq DNA聚聚合合酶酶具具有有末末端端转转移移酶酶作作用用，能能在在所所合合成成DNA链链的的3末末端端加加上上一一个个单单独独的的腺腺苷苷酸酸残基（残基（A）。）。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链55羟基末端磷酸化羟基末端磷酸化 常常 用用 的的 是是 T4多多 核核 苷苷 酸酸 激激 酶酶（T4 polynucleotide kinase），该该酶酶含含5多多核核苷苷酸酸激激酶酶和和3磷磷酸酸酶酶活活性性，能能催催化化ATP的的-位位磷磷酸酸向向DNA和和RNA的的5-羟基转移。羟基转移。该该酶酶常常用用于于：DNA或或RNA的的5末末端端标标记记；使使没没有有5-末末端端磷磷酸酸的的DNA片片段段磷磷酸酸化化，以以供供连接和克隆之用。连接和克隆之用。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。第二节第二节 目的目的DNA的获取的获取Preparation of Interested DNA本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。一、一、化学合成法可直接合成目的化学合成法可直接合成目的DNA要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列应用：一般用于小分子肽类基因的合成应用：一般用于小分子肽类基因的合成本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。*化学合成法获取目的化学合成法获取目的DNA由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列色色 苯丙苯丙 蛋蛋 赖赖本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。第一步：构建第一步：构建基因组基因组基因组基因组DNADNA文库文库文库文库（是指包含（是指包含某一个生物细胞或组织全部基因组某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列的序列的随机克隆群体，以随机克隆群体，以DNA片段的形式贮存了所有片段的形式贮存了所有的基因组的基因组DNA信息）。信息）。第二步：筛选含有目的基因的克隆。第二步：筛选含有目的基因的克隆。二、从基因组从基因组DNA文库中获取目的文库中获取目的DNA本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片段基因片段克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶或机械剪切或机械剪切受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存存在在于于转转化化细细胞胞内内由由克克隆隆载载体体所所携携带带的的所所有有基基因组因组DNA片段的集合片段的集合*从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。三、从三、从cDNA文库中获取目的文库中获取目的DNA 第第一一步步：构构建建cDNAcDNA文文文文库库库库（包包含含某某一一组组织织细细胞胞在在一一定定条条件件下下所所表表达达的的全全部部mRNA经经反反转转录录而而合合成成的的cDNA序序列列的的克克隆隆群群体体，它它以以cDNA片段的形式贮存了全部的基因表达信息）。片段的形式贮存了全部的基因表达信息）。第二步：筛选含有目的第二步：筛选含有目的cDNAcDNA的克隆。的克隆。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。cDNA文库文库存存在在于于转转化化细细胞胞内内由由克克隆隆载载体体所所携携带带的的所所有有 cDNA片片段的集合段的集合本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。从从基因组基因组DNA文库或文库或cDNA文库中筛选文库中筛选目的目的DNA的策略的策略1.菌落或噬斑原位杂交菌落或噬斑原位杂交2.针针对对表表达达文文库库，可可用用抗抗原原-抗抗体体或或配配体体-受受体结合的原理（亲和筛选法）筛选体结合的原理（亲和筛选法）筛选本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。如如果果已已经经知知道道目目的的基基因因的的序序列列，就就能能很很方方便便地地用用PCR反反应应，从从基基因因组组DNA或或cDNA中中获获得得目目的的基基因因，可可不不必必要要经经过过复复杂杂的的DNA文文库构建过程。库构建过程。PCR是一种高效快速的体外是一种高效快速的体外DNA聚合程序聚合程序四、经四、经PCR获取目的获取目的DNA 本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。酵酵母母单单杂杂交交系系统统五、通过特异杂交系统获取某些转录因子的编码五、通过特异杂交系统获取某些转录因子的编码DNADNAA.无转录因子：报告基因不表达无转录因子：报告基因不表达“诱饵诱饵”DNA序列序列B.有转录因子：报告基因表达有转录因子：报告基因表达C.有转录因子有转录因子 AD/DNA结合蛋白融合蛋白：报告基因表达结合蛋白融合蛋白：报告基因表达转录因子的转录因子的 AD转录因子转录因子DNA结合蛋白结合蛋白报告基因报告基因报告基因报告基因报告基因报告基因.本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。第三节第三节 重组重组DNA技术中的技术中的DNA载体载体DNA Vectors in Recombinant DNA Technology本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。载载体体（vectorvector）是是为为携携带带感感兴兴趣趣的的外外源源DNADNA，实实现现外外源源DNADNA在在受受体体细细胞胞中中的的无无性性繁繁殖殖或或表表达达有有意意义义的的蛋白质所采用的一些蛋白质所采用的一些DNADNA分子分子 按功能分按功能分克隆载体（克隆载体（cloning vector）表达载体（表达载体（expression vector）按基本元件按基本元件的来源不同的来源不同质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体黏粒载体黏粒载体病毒载体病毒载体人工染色体载体等人工染色体载体等载体概述载体概述本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体。克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列可可转转录录和和翻翻译译成多肽链而特意设计的载体称为成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。表达载体。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。一、克隆载体用于外源一、克隆载体用于外源DNA的克隆和的克隆和无性繁殖无性繁殖（一）克隆载体应具备的主要特点（一）克隆载体应具备的主要特点至少有一个复制起点（至少有一个复制起点（origin of replication,ori）至少有一个选择性标志（至少有一个选择性标志（selection marker）有适宜的限制性内切酶的单一切点：称为多克隆位有适宜的限制性内切酶的单一切点：称为多克隆位点（点（multiple cloning sites，MCS）应有较高的拷贝数。应有较高的拷贝数。pBR322质粒图谱质粒图谱 本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。1.1.质粒质粒(plasmid)特特点点：能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗传信息遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。（二）（二）常用克隆载体有多种常用克隆载体有多种本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。pUC系列质粒图谱系列质粒图谱本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用于系列（插入型，适用于cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用于基因组系列（置换型，适用于基因组DNA克隆）克隆）cos位点位点:噬菌体噬菌体DNA为线性双链分子，两端各有一条为线性双链分子，两端各有一条由由12个碱基组成、彼此完全互补且个碱基组成、彼此完全互补且5单链突出的序列单链突出的序列（即粘性末端），称（即粘性末端），称cos位点位点 2.噬菌体噬菌体(phage)M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。3.穿梭载体（穿梭载体（shuttle vector）人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源源DNA序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。u表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体基因的载体u 依据其宿主细胞的不同可分为依据其宿主细胞的不同可分为:原核表达载体（原核表达载体（prokaryotic expression vector）真核表达载体（真核表达载体（eukaryotic expression vector）二、表达载体用于外源二、表达载体用于外源DNA的表达的表达本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（一）（一）原核表达载体用于在原核细胞中表达外原核表达载体用于在原核细胞中表达外源基因源基因 从克隆载体发展而来，其除了具备克隆载体的一般特点外，从克隆载体发展而来，其除了具备克隆载体的一般特点外，还需有调控外源基因有效转录和翻译的序列，如启动子、核糖还需有调控外源基因有效转录和翻译的序列，如启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等。目前应用最广泛的原核表达载体结合位点、转录终止序列等。目前应用最广泛的原核表达载体是大肠杆菌表达载体。原核表达载体的基本组成如下：体是大肠杆菌表达载体。原核表达载体的基本组成如下：R：调节序列；：调节序列；P：启动子；：启动子；SD：SD序列；序列；TT：转录终止序列：转录终止序列大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。lLac启动子（乳糖启动子）启动子（乳糖启动子）lTrp启动子（色氨酸启动子）启动子（色氨酸启动子）lTac启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子）启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子）lPL和和PR启动子（启动子（噬菌体的左向和右向启动子）噬菌体的左向和右向启动子）lT7启动子启动子1.1.启动子是启动外源基因表达的必需元件，其能被启动子是启动外源基因表达的必需元件，其能被RNARNA聚合酶聚合酶所识别：所识别：目前原核表达载体常使用的启动子有以下几种目前原核表达载体常使用的启动子有以下几种 本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。2.SD序列提供核糖体结合位点序列提供核糖体结合位点 mRNA在在细细菌菌中中的的翻翻译译严严格格依依赖赖于于核核糖糖体体结结合合位位点点（ribosome binding site）的的存存在在。SD序序列列（Shine-Dalgarno sequence）位位于于转转录录起起始始位位点点上上游游813 bp处处，为为富富含含嘌嘌呤呤的的短短片片段段，其其能能与与核核糖糖体体30S小小亚亚基基中中的的16S rRNA 3端端的的部部分分序序列列互互补补结结合合。SD序序列列作作为为核核糖糖体体结结合位点，保证了翻译起始复合物的形成。合位点，保证了翻译起始复合物的形成。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。3.转录终止序列有助于外源基因的高效表达转录终止序列有助于外源基因的高效表达 尽管载体中没有转录终止序列，也可表达某些外源蛋尽管载体中没有转录终止序列，也可表达某些外源蛋白，但表达效果通常不理想。因此，多数原核表达载体中白，但表达效果通常不理想。因此，多数原核表达载体中都带有转录终止序列。都带有转录终止序列。转录终止序列长短不一，短的只有几十转录终止序列长短不一，短的只有几十bp，长的可达，长的可达几百几百bp。转录终止序列有助于使转录终止序列有助于使RNA聚合酶重点转录克隆的外聚合酶重点转录克隆的外源基因，控制所转录源基因，控制所转录RNA的长度，提高的长度，提高RNA稳定性。稳定性。位于启动子上游的转录终止序列可阻止其他启动子的位于启动子上游的转录终止序列可阻止其他启动子的通读，降低本底；位于多克隆位点下游的转录终止序列可通读，降低本底；位于多克隆位点下游的转录终止序列可防止因外源基因表达而干扰载体的稳定性。防止因外源基因表达而干扰载体的稳定性。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.几种常见的原核表达载体各有特点几种常见的原核表达载体各有特点 依据表达目的蛋白的方式，可将原核表达载体分为依据表达目的蛋白的方式，可将原核表达载体分为 （1）非融合型表达载体）非融合型表达载体 （2）融合型表达载体）融合型表达载体 （3）分泌型表达载体）分泌型表达载体 本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（1）非融合型表达载体用于表达非融合蛋白）非融合型表达载体用于表达非融合蛋白 非非融融合合蛋蛋白白是是指指不不与与细细菌菌的的任任何何蛋蛋白白或或多多肽肽融融合合在在一一起起进进行表达的蛋白。表达该类蛋白的载体称为非融合型表达载体。行表达的蛋白。表达该类蛋白的载体称为非融合型表达载体。使使用用强强启启动动子子tac，紧紧接接tac启启动动子子的的是是多多克克隆隆位位点点，目目的的基基因因克克隆隆于于启启动动子子和和SD序序列列下下游游。在在多多克克隆隆位位点点下下游游包包含含一一个个很很强强的的rrnB核核糖糖体体RNA的的转转录录终终止止子子，其其作作用用是是为为了了稳稳定定载载体体系系统统，因因为为上上游游强强的的tac启启动动子子控控制制的的转转录录必必须须由由强强终终止止子子抑抑制制，才才不不至至于于干干扰扰与与载载体体本本身身稳稳定定性性有有关关的的基基因因表表达达。载载体体的的其其余余部部分来自分来自pBR322。使使用用pKK223-3时时，应应配配套套使使用用LacIq宿宿主主菌菌，在在无无IPTG诱诱导导时时，tac启启动动子子受受阻阻遏遏，当当加加入入IPTG后后，便可去阻遏，从而使外源基因表达。便可去阻遏，从而使外源基因表达。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。将将一一段段特特殊殊的的蛋蛋白白质质（或或短短肽肽）的的基基因因构构建建入入载载体体，使使之之与与目目的的蛋蛋白白融融合合表表达达可可形形成成 融融 合合 蛋蛋 白白（fusion protein）。表表达达该该类类蛋蛋白白的的载载体体称称为为融融合合型型表表达达载载体体，如如pGEX系统。系统。pGEX系系统统包包括括多多种种载载体体，如如 pGEX-lT、pGEX-2T、pGEX-3X、pGEX-4T、pGEX-5X、pGEX-6P等等。该该系系统统载载体体使使用用强强启启动动子子tac，紧紧接接启启动动子子的的是是SD序序列列及及其其下下游游的的GST基基因因，然然后后是是多多克克隆隆位位点点。用用IPTG可可诱诱导导目目的的基基因因的的表表达达，表表达达产产物物与与GST融融合合，故故可可利利用用该该标标签签对蛋白进行纯化对蛋白进行纯化。（2）融合型表达载体用于表达融合蛋白）融合型表达载体用于表达融合蛋白本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。该类载体的优点是能把在受体细菌内表达的外源蛋白有效地分泌到周质腔，该类载体的优点是能把在受体细菌内表达的外源蛋白有效地分泌到周质腔，甚至穿过细胞外膜进入培养基中。甚至穿过细胞外膜进入培养基中。在构建该类载体时，除有一般表达载体应有的启动子等元件外，还需含有在构建该类载体时，除有一般表达载体应有的启动子等元件外，还需含有编码信号肽的序列（通常置于编码信号肽的序列（通常置于SD序列下游）。序列下游）。分泌型载体既可用于非融合蛋白的表达，也可用于融合蛋白的表达。分泌型载体既可用于非融合蛋白的表达，也可用于融合蛋白的表达。pIN 系系列列载载体体是是较较常常用用的的分分泌泌型型表表达达载载体体，可可使使所所表表达达的的蛋蛋白白分分泌泌到到宿宿主主菌菌的的周周质质腔腔中中。该该系系列列载载体体以以pBR322为为基基础础构构建建而而成成，带带有有大大肠肠杆杆菌菌中中最最强强的的启启动动子子之之一一，即即lpp（脂脂蛋蛋白白基基因因）启启动动子子，其其中中编编码码信信号号肽肽的的序序列列取自大肠杆菌中分泌蛋白的基因取自大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa（外膜蛋白基因）。（外膜蛋白基因）。（3 3）分泌型表达载体用于外源基因的分泌表达）分泌型表达载体用于外源基因的分泌表达pIN 系列载体有系列载体有3种，即种，即pIN-ompA1、pIN-ompA2和和pIN-ompA3，分别适用，分别适用于使用不同密码子框架的目的基因的插入，于使用不同密码子框架的目的基因的插入，克隆位点分别为克隆位点分别为EcoR、Hind和和BamH。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（二）真核表达载体用于在真原核细胞中（二）真核表达载体用于在真原核细胞中表达外源基因表达外源基因 真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。真核表达载体中还具有：真核表达载体中还具有：真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终止序列、止序列、poly A 加尾信号等加尾信号等 真核细胞复制起始序列真核细胞复制起始序列 真核细胞药物抗性基因真核细胞药物抗性基因本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。OriPro：原核复制起始序列；：原核复制起始序列；P：启动子；：启动子；MCS：多克隆：多克隆位点；位点；TT：转录终止序列；：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。：真核复制起始序列。注：不是所有真核表达载体都有整合序列注：不是所有真核表达载体都有整合序列 真核表达载体的基本组成真核表达载体的基本组成本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。真核启动子和增强子在不同类型细胞中的活性差别很真核启动子和增强子在不同类型细胞中的活性差别很大。某些来源于病毒的启动子和增强子，其真核宿主细胞大。某些来源于病毒的启动子和增强子，其真核宿主细胞范围较广，如范围较广，如Rous肉瘤病毒基因组长末端重复序列（肉瘤病毒基因组长末端重复序列（long terminal repeats，LTR）、）、SV40病毒早期基因的启动子和病毒早期基因的启动子和增强子、人类巨细胞病毒（增强子、人类巨细胞病毒（CMV）启动子等。这些启动子）启动子等。这些启动子和增强子组合可在广泛的宿主细胞中起作用，故在真核表和增强子组合可在广泛的宿主细胞中起作用，故在真核表达载体中被普遍使用。达载体中被普遍使用。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。真真核核表表达达载载体体带带有有的的poly A 加加尾尾信信号号可可保保证证新新转转录的录的mRNA能有效地加上能有效地加上poly A。为为 mRNA加加 上上 poly A依依 赖赖 于于 mRNA 3末末 端端 的的AAUAAA和其下游的和其下游的GU或或U富含区。富含区。尽尽管管全全长长cDNA克克隆隆可可能能已已带带有有AAUAAA序序列列和和一一段段poly A，但但这这些些序序列列仍仍不不足足以以保保证证poly A的的有有效效形形成。因此，载体中必须带有成。因此，载体中必须带有poly A 加尾信号。加尾信号。常常用用的的来来自自SV40的的poly A加加尾尾信信号号为为237 bp，其其中中同同时时含含有有针针对对早早期期和和晚晚期期转转录录子子的的切切割割和和poly A 加加尾尾信信号号。两两套套信信号号作作用用的的方方向向相相反反，并并分分别别位位于于不不同同的的DNA链上，对链上，对mRNA的加工均很有效。的加工均很有效。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。酵母表达载体酵母表达载体昆虫表达载体昆虫表达载体哺乳类细胞表达载体哺乳类细胞表达载体根据真核宿主细胞的不同，真核表达载体可主要根据真核宿主细胞的不同，真核表达载体可主要分为分为 ：本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（1 1）酵母表达载体适于在酵母细胞中表达外源蛋白）酵母表达载体适于在酵母细胞中表达外源蛋白 根据载体在酵母细胞中复制方式的不同，可将酵根据载体在酵母细胞中复制方式的不同，可将酵母载体分为五类，母载体分为五类，YIp：酵母整合型质粒：酵母整合型质粒 YRp：酵母复制型质粒：酵母复制型质粒 YCp：酵母着丝粒型质粒：酵母着丝粒型质粒 YEp：酵母游离型质粒：酵母游离型质粒 YLp：酵母线性质粒：酵母线性质粒 除除YLp外，其余各类既可在大肠杆菌，又可在酵外，其余各类既可在大肠杆菌，又可在酵母细胞中复制与扩增。母细胞中复制与扩增。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。根据在转化酵母细胞中的复制机制，又可根据在转化酵母细胞中的复制机制，又可将酵母载体分为两个基本类型：将酵母载体分为两个基本类型：整合型载体，如整合型载体，如YIp包含一个酵母包含一个酵母ura3标标志基因、大肠杆菌复制起始序列以及抗生素抗志基因、大肠杆菌复制起始序列以及抗生素抗性基因。该质粒缺乏在酵母细胞中进行自主复性基因。该质粒缺乏在酵母细胞中进行自主复制的元件，其需通过质粒制的元件，其需通过质粒DNA与酵母与酵母DNA同源同源序列重组而整合至酵母基因组中序列重组而整合至酵母基因组中。自主复制型载体，这类载体因在酵母细胞自主复制型载体，这类载体因在酵母细胞中有自我复制能力而得名，属于这类载体的有：中有自我复制能力而得名，属于这类载体的有：YRp、YEp和和YCp。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（2）昆虫表达载体可在昆虫细胞中表达真核基因）昆虫表达载体可在昆虫细胞中表达真核基因 昆虫表达载体主要有两类：昆虫表达载体主要有两类：杆杆状状病病毒毒表表达达载载体体。载载体体的的启启动动子子为为多多角角体体蛋蛋白白(polyhedrin)基基因因的的启启动动子子，所所使使用用的的外外泌泌信信号号序序列列来来自自蜜蜜蜂蜂的的milittin序序列列，其其可可在在宿宿主主细细胞胞（如（如Sf9或或Sf20）中高水平表达外源蛋白。）中高水平表达外源蛋白。果果蝇蝇表表达达载载体体。载载体体上上的的启启动动子子有有Ac5（果果蝇蝇黑黑素素激激动动蛋蛋白白5C基基因因）启启动动子子和和MT（果果蝇蝇黑黑素素金金属属硫硫蛋蛋白白基基因因）启启动动子子，所所使使用用的的外外泌泌信信号号序序列为列为Bip序列，其可连续表达或诱导表达外源蛋白。序列，其可连续表达或诱导表达外源蛋白。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（3 3）哺乳类细胞表达载体适宜在哺乳类细胞中）哺乳类细胞表达载体适宜在哺乳类细胞中表达真核基因表达真核基因 据载体进入宿主细胞的方式分为病毒载体和质粒载体据载体进入宿主细胞的方式分为病毒载体和质粒载体据载体在宿主细胞内是否整合于细胞染色体据载体在宿主细胞内是否整合于细胞染色体DNADNA，可将其分，可将其分为整合型和非整合型载体为整合型和非整合型载体整合型载体一般是随机整合入染色体，但所携带外源基因整合型载体一般是随机整合入染色体，但所携带外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性，整合型载体通常用于外源基因的稳定表达；非生长特性，整合型载体通常用于外源基因的稳定表达；非整合型载体通常用于外源基因的瞬时表达整合型载体通常用于外源基因的瞬时表达最常用的哺乳类细胞表达载体是最常用的哺乳类细胞表达载体是病毒载体病毒载体病毒载体病毒载体 本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。一个理想的病毒表达载体，通常应具备以下条件：一个理想的病毒表达载体，通常应具备以下条件：使用安全，对宿主细胞无毒副效应；使用安全，对宿主细胞无毒副效应；能容纳较大的外源能容纳较大的外源DNA片段且转染效率高；片段且转染效率高；所产生的病毒效价高；所产生的病毒效价高；外源基因在靶组织或靶细胞中能长期、稳定表达外源基因在靶组织或靶细胞中能长期、稳定表达 病毒的靶向性强；病毒的靶向性强；外源基因的表达具有可控性。外源基因的表达具有可控性。然而，遗憾的是，到目前为止，还没有任何一然而，遗憾的是，到目前为止，还没有任何一个病毒载体能满足以上全部理想条件。个病毒载体能满足以上全部理想条件。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。目前，常用的病毒表达载体包括如下多种：目前，常用的病毒表达载体包括如下多种：反转录病毒（反转录病毒（retrovirus,RV）载体）载体 lRV属属ssRNA病毒。病毒。l构构建建RV载载体体时时，将将RV的的DNA插插入入pBR322质质粒粒，同同时时删删除除RV的的三三个个编编码码基基因因，保保留留两两端端的的LTR和和病病毒毒颗颗粒粒包包装装序序列列，再再加加入入供供筛筛选选的的标标记记基基因因。5LTR具具启启动动子子和和增增强强子子活活性性并并具具转转录录起起始始信信号号，3LTR具转录终止信号。具转录终止信号。lRV载载体体具具有有较较高高整整合合和和表表达达外外源源基基因因的的能能力力，广广泛泛用用于于转转基基因因动动物物和和基基因因治治疗疗研研究究，但但因因其其随随机机整合，其安全性问题需加以考虑。整合，其安全性问题需加以考虑。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。慢病毒（慢病毒（lentivirus,LV）载体）载体lLV载体是以载体是以HIV-1（I型人类免疫缺陷病毒）为基础发展型人类免疫缺陷病毒）为基础发展起来的表达载体；起来的表达载体；l与一般与一般RV载体不同的是，它对分裂细胞和非分裂细胞均载体不同的是，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力；具有感染能力；l该载体可将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而获该载体可将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而获得持久表达；得持久表达；l该载体宿主细胞较广，在表达目的蛋白和小干扰该载体宿主细胞较广，在表达目的蛋白和小干扰RNA方面方面都有广泛应用都有广泛应用。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。腺病毒（腺病毒（Adenovirus,AV）载体）载体 lAV属线性属线性dsDNA病毒；病毒；l目前，普遍使用的是目前，普遍使用的是AV第三代载体，载体中去除了所第三代载体，载体中去除了所有有AV的编码基因，仅保留了的编码基因，仅保留了5和和3末端反向重复序列末端反向重复序列（inverted terminal repeats，ITR）及病毒包装序列）及病毒包装序列，病毒载体外壳的包装需要辅助病毒提供编码序列；，病毒载体外壳的包装需要辅助病毒提供编码序列；l第三代第三代AV载体能容纳较大的载体能容纳较大的DNA片段，能较长时间地片段，能较长时间地表达外源基因，其毒性和免疫原性都大大降低。表达外源基因，其毒性和免疫原性都大大降低。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。腺腺相相关关病病毒毒（adenovirus-associated virus，AAV）载体）载体lAAV属于线性属于线性ssDNA病毒。病毒。l构构建建AAV载载体体时时，用用外外源源基基因因及及其其调调节节序序列列取取代代病病毒毒的的rep和和cap编编码码区区，仅仅保保留留两两端端145 bp的的ITRs，负负责责病病毒毒的的获获救救、复复制制、包包装装与与整整合合；而而辅辅助助质质粒粒则则保保留留所所有有编编码码序序列列而而无无ITRs。两两种种质质粒粒间间无无重重复复序序列列，重重组组AAV复复制制和和壳壳化化所所需需的的rep和和cap基基因因，由由辅辅助助质质粒粒直直接接以以蛋蛋白白表表达达方方式式提提供供，故故不不会会发发生生野野生生型型病病毒毒序序列列的的重重组组、复复制制和和包包装装。当当AAV载载体体与与辅辅助助质质粒粒共共转转染染辅辅助助病病毒毒（AV）感感染染的的细细胞时，即能获救、复制并包装成重组胞时，即能获救、复制并包装成重组AAV 颗粒。颗粒。lAAV载载体体具具有有能能稳稳定定表表达达外外源源基基因因、特特异异整整合合至至人人的的19号号染染色色体体长长臂臂末末端端、病病毒毒稳稳定定且且宿宿主主范范围围广广、不不引引发发免免疫疫反反应等优点应等优点。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（一）黏粒兼具质粒和噬菌体（一）黏粒兼具质粒和噬菌体DNA的特性的特性黏黏粒粒（cosmid）：又又称称粘粘性性质质粒粒或或装装配配型型质质粒粒，是是由由 DNA的的cos区区与与质质粒粒重重新新构建而成的杂合双链环状构建而成的杂合双链环状DNA载体。载体。黏黏粒粒的的特特点点：含含有有质质粒粒的的抗抗性性标标记记基基因因及及复复制制起起点点和和多多克克隆隆位位点点，可可按按质质粒粒的的方方式式在在宿宿主主菌菌中中进进行行自自主主复复制制；带带有有噬噬菌菌体体DNA的的cos序序列列，可可像像噬噬菌菌体体DNA一一样样进进行行体体外外包包装装；黏黏粒粒本本身身较较小小，通通常常只只有有几几kb，但但能能容容纳纳高高达达50 kb的的外外源源DNA片片段段；非非重重组组体体黏黏粒粒很很小小，故故不不能能在在体体外外进进行行包包装装，所所以以有有利利于于后后续续阳阳性性克克隆隆的的筛筛选选；黏黏粒粒因因缺缺乏乏全全部部基基因因，不不会会产产生生噬噬斑斑，但但在在选选择择培培养养基基平平板板上上形形成成菌菌落落，这这一一点点也也与与质质粒粒载载体体一致。一致。三、特殊载体具有特定用途三、特殊载体具有特定用途黏粒pJB8图谱本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（二）（二）BAC、PAC和和YAC用于大片段用于大片段DNA的的克隆克隆细细菌菌人人工工染染色色体体（bacterial artificial chromosome，BAC）基基于于F质质粒粒构构建建而而成成。BAC能能容容纳纳高高达达400 kb（一一般为般为50 kb250 kb）的外源）的外源DNA。基基于于大大肠肠杆杆菌菌P1噬噬菌菌体体的的载载体体（E.coli bacteriophage P1-based vector,PAC）与）与BAC的克隆容量相当。的克隆容量相当。酵酵母母人人工工染染色色体体（yeast artificial chromosome，YAC）载载体体能能携携带带更更大大的的DNA片片段段，其其由由酵酵母母线线性性质质粒粒（YLp）发发展展而而来来，含含有有染染色色体体的的两两个个端端粒粒片片段段，能能复复制制出出线线性性DNA，其其克克隆隆容容量量可可高高达达3 Mb（一一般般为为500 kb2Mb）。利利用用重重组组线线性性DNA转转化化细细胞胞，可可建建成成包包含含人人全全部部基基因因组组DNA的巨型的巨型YAC文库。文库。BAC、PAC和和YAC的的使使用用为为人人类类基基因因组组物物理理图图谱谱和和序序列列测测定定提提供供了了强强有有力力的的工工具具，大大大大促促进进了了人人类类基基因因组组计计划划的的完完成。成。本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。（三）启动子探针型载体用于分离和分析（三）启动子探针型载体用于分离和分析基因启动子基因启动子启启动动子子探探针针型型载载体体（即即通通常常所所说说的的报报告告基基因因载载体体）是是一一种种快快速速分分离离和和鉴鉴定定基基因因启动子的工具型载体启动子的工具型载体包包含含两两个个基基本本部部分分：转转化化单单元元和和检检测测单单元元。其其中中，转转化化单单元元包包含含质质粒粒克克隆隆载载体体必必备备的的转转化化系系统统（复复制制起起点点和和抗抗生生素素抗抗性性基基因因，用用于于选选择择被被转转化化的的细细胞胞）；检检测测单单元元则则包包括括一一个个已已失失去去转转录录功功能能且且易易于检测的遗传标志基因以及多克隆位点。于检测的遗传标志基因以及多克隆位点。例例如如，pGL3-basic就就是是一一个个典典型型的的启启动动子子探探针针型型载载体体，它它不不含含启启动动子子，含含有有一一个个荧荧光光素素酶酶（luciferase，luc）标标志志基基因