遗传学第五章基因组课件

第五章第五章 基基 因因 组组本章重点本章重点:基因定位基因定位序列作图序列作图基因克隆基因克隆1n基因组：单倍体细胞中所含的整套染色体。基因组：单倍体细胞中所含的整套染色体。基因组：单倍体细胞中所含的整套染色体所包含的基因组：单倍体细胞中所含的整套染色体所包含的DNA分分子以及子以及DNA分子所携带的全部遗传指令。分子所携带的全部遗传指令。n人类基因组：人类基因组：22条常染色体和条常染色体和X、Y染色体的染色体的DNA组成组成。基因组2 生物体单倍体生物体单倍体DNA总量称为总量称为 C值。值。C值最大最小相差值最大最小相差10万倍。万倍。C值同生物进化是什么关系？值同生物进化是什么关系？一、一、C值悖论和序列复杂性值悖论和序列复杂性1 1、C值悖理值悖理（C-value paradox）第一节第一节 基因组基因组DNA序列组成序列组成3基因组大小基因组大小 种种 类类 Mb大肠杆菌大肠杆菌 4.64啤酒酵母啤酒酵母 12.1线线 虫虫 100.0果果 蝇蝇 140.0蝗蝗 虫虫 5000.0小小 鼠鼠 3300.0豌豌 豆豆 4800.0玉玉 米米 5000.0小小 麦麦 17000.0 人人 3000.0 4霉菌藻类藻类G+细菌细菌G-细菌细菌显花植物显花植物鸟类鸟类哺乳类哺乳类爬行类爬行类两栖类两栖类硬骨鱼类硬骨鱼类软骨鱼类软骨鱼类赖皮类赖皮类甲壳类甲壳类昆虫类昆虫类软体动物软体动物蠕虫类蠕虫类真菌真菌枝原体枝原体A 生物体进化程度高低生物体进化程度高低 与大与大C值不成明显正相关值不成明显正相关 B 亲缘关系相近的生亲缘关系相近的生 物大物大C值相差较大值相差较大C 同一类生物内大同一类生物内大C值值 与小与小c值相差极大值相差极大 （Euk.人体人体 c=C/10）(Prok.x174 c C)5 在同一类生物中，不同种的基因组大小也有很大差别。在同一类生物中，不同种的基因组大小也有很大差别。C值悖理值悖理，从总体上说，生物基因组的大小同生物在进化上，从总体上说，生物基因组的大小同生物在进化上所处的地位高低无关，这种现象称为所处的地位高低无关，这种现象称为C值悖论。值悖论。6 2、序列复杂性、序列复杂性在同一类生物中，不同种的基因组大小悬殊差别。主要差别在于在同一类生物中，不同种的基因组大小悬殊差别。主要差别在于“多余多余”（excess）DNA的量的差别。的量的差别。“多余多余”DNA量多，则基因组大；量多，则基因组大；“多余多余”DNA量少，则基因组小。量少，则基因组小。“多余多余”DNA主要是重复序列。主要是重复序列。序列复杂性序列复杂性:不同序列的总长度称为序列复杂性不同序列的总长度称为序列复杂性,用用bp表示。表示。140bp:(1)20bp,30bp,40bp,50bp 20+30+40+50=140bp (2)70bp(2个拷贝个拷贝)70=70bp序列复杂性高低反映了序列包含的遗传信息量的大小。序列复杂性高低反映了序列包含的遗传信息量的大小。生物体基因组的复杂程度还表现在基因的外显子数目的多寡。生物体基因组的复杂程度还表现在基因的外显子数目的多寡。7二二、基因组、基因组DNADNA序列的分类序列的分类1、编码序列和非编码序、编码序列和非编码序 编码序列：编码编码序列：编码RNA和蛋白质的和蛋白质的DNA序列。序列。非编码序：内含子和基因的间隔序列。非编码序：内含子和基因的间隔序列。2、单一序列和重复序列、单一序列和重复序列 单一序列：单一序列：基因组中只有一份的基因组中只有一份的DNA序列。序列。重复序列：基因组中重复出现的序列。如重复序列：基因组中重复出现的序列。如STR,微卫星微卫星DNA等等8重复序列重复序列高度重复序列。几百高度重复序列。几百-几百万个拷贝。几百万个拷贝。Alu family 轻度重复序列。轻度重复序列。210个拷贝。个拷贝。中度重复序列。中度重复序列。10几百个拷贝。几百个拷贝。rDNA、tDNA原核生物基因组几乎不含重复序列；原核生物基因组几乎不含重复序列；低等真核生物基因组中，中度重复和高度重复序列不超过低等真核生物基因组中，中度重复和高度重复序列不超过20%；动物细胞基因组中，中度重复和高度重复序列约占动物细胞基因组中，中度重复和高度重复序列约占50%；显花植物和两栖动物基因组中，中度重复和高度重复序列几乎可达显花植物和两栖动物基因组中，中度重复和高度重复序列几乎可达80%重复序列重复序列9三三、DNADNA复性动力学复性动力学 D.S.DNAS.S.DNA(加温加温,极端极端pH)Renaturation 复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞(DependsonthecollisionofcomplementaryS.S.DNA)10影响复性的因素：影响复性的因素：真核生物：真核生物：第第1组分（组分（25%），快，高度重复序列；），快，高度重复序列；第第2组分（组分（30%），中，中度重复序列；），中，中度重复序列；第第3组分（组分（45%），慢，单一或少拷贝；），慢，单一或少拷贝；温度温度时间时间离子强度离子强度DNA片段大小片段大小DNA序列复杂性序列复杂性DNA分子浓度分子浓度11四四、重复序列家族、重复序列家族重复序列家族重复序列家族:是指一类核苷酸序列高度相似的重复序列，这些重是指一类核苷酸序列高度相似的重复序列，这些重复序列包括基因和基因以外的序列。复序列包括基因和基因以外的序列。基因家族基因家族:真核生物基因组中来源相同，结构相似、功能相关的真核生物基因组中来源相同，结构相似、功能相关的一组基因可归为一个基因家族。基因家族可归入重复序列家族，一组基因可归为一个基因家族。基因家族可归入重复序列家族，但不是其主要组成，主要组成基因以外的序列。但不是其主要组成，主要组成基因以外的序列。12散在重复序列散在重复序列散在重复序列：散在的方式分布于基因组内的重复序列。散在重复序列：散在的方式分布于基因组内的重复序列。短短散在重复序列（散在重复序列（SINEs）,500bp长散在重复序列（长散在重复序列（LINEs）,1000bpAlu序列家族：人类序列家族：人类50-70万拷贝；万拷贝；人和灵长类基因标志。人和灵长类基因标志。多聚（多聚（dT-dG）家族：）家族：10万拷贝万拷贝13基因组学基因组学结构基因组学结构基因组学功能基因组学功能基因组学基因和基因组的结构基因和基因组的结构各种元件的序列特征各种元件的序列特征基因作图和基因定位基因作图和基因定位不同序列结构具有不同功能不同序列结构具有不同功能基因表达的调控基因表达的调控基因与环境相互作用基因与环境相互作用转录物组学转录物组学蛋白质组学蛋白质组学表型组学表型组学第二节第二节 基因组研究基因组研究14一、人类基因组研究人类基因组研究1986 1986 美美 Dulbecco Dulbecco首次提出了首次提出了“人类基因组工程人类基因组工程”1990.41990.4月美国宣布人类基因组测序工作的月美国宣布人类基因组测序工作的5 5 年计划。年计划。2001.1.12 2001.1.12 中中、美美、日日、德德、法法、英英等等国国科科学学家家（Nature,15Nature,15日日)和和美美国国塞塞莱莱拉拉公公司司(Science,16(Science,16日日)各各自自公公布布人人类类基基因因组组图图谱谱和和初初步步分分析析结结果。约果。约3 3万基因。万基因。我我国国参参与与研研究究的的第第3 3号号染染色色体体，共共计计30003000万万个个碱碱基基对对，约约占占人人类类基基因因组组全部序列全部序列1%1%（1999.91999.9月加入这一研究计划）。月加入这一研究计划）。151、遗传图：、遗传图：遗传图以染色体上某遗传图以染色体上某一点为遗传标记，以与之相伴遗传的一点为遗传标记，以与之相伴遗传的特征为对象，通过计算连锁的遗传标特征为对象，通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定它们的相对志之间的重组频率，确定它们的相对距离距离(单位：单位：cM,cM,厘摩厘摩)；2、物理图：、物理图：以特定的以特定的DNA序列为序列为标界，标界，将各种标记直接定位在基因库将各种标记直接定位在基因库中的某一点上。中的某一点上。物理图上标界之间的距离以物理长度物理图上标界之间的距离以物理长度来表示，即以核苷酸对的数目来表示来表示，即以核苷酸对的数目来表示（单位：（单位：bp,kbbp,kb）；）；3、序列图：、序列图：核苷酸组成的基因组核苷酸组成的基因组全部全部DNA序列序列。4、基因图：、基因图：测定这些可表达片段测定这些可表达片段（EST）的标记图）的标记图。人类基因组框架图人类基因组框架图16人类基因组计人类基因组计划（划（HGP）遗传图遗传图物理图物理图序列图序列图基因图基因图基因定位基因定位 基因克隆基因克隆 基因转移基因转移 比较基因组研究比较基因组研究物种的起源与进化基因的证实与克隆生物学的发展 水稻等作物基因组计划水稻等作物基因组计划猪，牛等家畜基因组计划猪，牛等家畜基因组计划17二、二、基因定位基因定位和作图和作图1 1、基因标记和作图界标、基因标记和作图界标基因标记：利用可鉴别的形态、生化等表型性状基因标记：利用可鉴别的形态、生化等表型性状作标记。作标记。如：血型、蛋白质氨基酸、等位基因等如：血型、蛋白质氨基酸、等位基因等图谱标记：图谱标记：可用基因或可用基因或DNA作为可鉴别的标记作为可鉴别的标记(marker)。基因标记和。基因标记和DNA的分子的分子标记。标记。分子分子标记标记：特定特定DNA序列构建遗传图谱的标记序列构建遗传图谱的标记。每种生物每种生物DNA具有稳定性。具有稳定性。18n（1）RFLP restrict fragment length polymorphism 限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性n（2）SSLP simple sequence length polymorphism 简单序列长度多态性简单序列长度多态性 n（3）SNP single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性单核苷酸多态性 n（4）STS/EST 非多态的短单一序列作为标界非多态的短单一序列作为标界DNA的分子的分子标记标记nRAPD random amplified polymorphism DNA 随机扩增多态性随机扩增多态性nAFLP amplified fragment length polymorphism 扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性19如一对同源染色体二个如一对同源染色体二个DNA分子，一个具有某种酶分子，一个具有某种酶的酶切位点，另一个无此位的酶切位点，另一个无此位点点 酶切后形成的酶切后形成的DNA片段长度片段长度就会有差异，即多态性就会有差异，即多态性(RFLP)根据该等位基因的遗传，将根据该等位基因的遗传，将RFLP作为标记定位在基因作为标记定位在基因组的某一位置上。组的某一位置上。限制性内切酶多态性限制性内切酶多态性:限制性内切酶能识别和切割特异核苷酸序列，限制性内切酶能识别和切割特异核苷酸序列，DNA序列能或不能被某一酶酶切，实际上相当于一对等位基因的差异。序列能或不能被某一酶酶切，实际上相当于一对等位基因的差异。（1）RFLP限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性20（2 2）简单序列长度多态性简单序列长度多态性(simplesequencelengthpolymor-phisms,SSLP)简单序列长度多态性简单序列长度多态性,又称为又称为VNTR variable number tandem repeat 数数目可变的串联重复多态性。目可变的串联重复多态性。指重复单位相对较小指重复单位相对较小,由重复单位的序列差异和由重复单位的序列差异和数目变化数目变化,可形成丰富的多态性。可形成丰富的多态性。包括包括:小卫星序列、微卫星序列小卫星序列、微卫星序列。小卫星序列小卫星序列(microsatellite):(microsatellite):又称简单重复序列又称简单重复序列(STRs)(STRs)，常只有，常只有2424个核个核苷酸重复单位。苷酸重复单位。微卫星微卫星(minisatellite)(minisatellite)也称多次重复序列也称多次重复序列(VNTR)(VNTR)，重复序列长度为几十个核，重复序列长度为几十个核苷酸。苷酸。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，据串联重复排列微卫星基序两侧的单一序列可以人工合成引物据串联重复排列微卫星基序两侧的单一序列可以人工合成引物,对微卫星序对微卫星序列（列（microsatellite DNAmicrosatellite DNA或或simple sequence repeatssimple sequence repeats，SSRSSR）进行扩增，从）进行扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来而将单个微卫星位点扩增出来,由微卫星基序重复数目的变异而产生多态性。由微卫星基序重复数目的变异而产生多态性。21随机扩增片段长度多态性随机扩增片段长度多态性DNA，简称，简称RAPD技术，是由技术，是由Williams和和Welsh（1990）同时发展起来的一项新的遗传标记技术。）同时发展起来的一项新的遗传标记技术。RAPD以以PCR为基为基础而又不同于经典的础而又不同于经典的PCR，一般采用，一般采用10个核苷酸的个核苷酸的DNA序列为引物，扩增序列为引物，扩增时退火温度降至时退火温度降至35左右。与其他标记相比左右。与其他标记相比,RAPD具有以下优点：具有以下优点：不依赖于种属的特异性和基因组的结构，合成的一套引物可用于不同生物不依赖于种属的特异性和基因组的结构，合成的一套引物可用于不同生物的分析。的分析。操作简单，可实现自动化，短期内可利用大量引物完成覆盖的分析。操作简单，可实现自动化，短期内可利用大量引物完成覆盖的分析。不需制备探针、杂交等程序，成本较低。不需制备探针、杂交等程序，成本较低。DNA用量少（用量少（10ngDNA即可完成一次分析）即可完成一次分析）,允许快速、简单地分离允许快速、简单地分离DNA。已在遗传图谱构建、种质资源分析、基因标记等方面得到了广泛的应用。已在遗传图谱构建、种质资源分析、基因标记等方面得到了广泛的应用。RAPD是一种显性标记是一种显性标记,分离群体中纯合体和杂合体通过后代才能区别，并且分离群体中纯合体和杂合体通过后代才能区别，并且由于该技术采用的是随机引物扩增，扩增结果的稳定性较差，这在一定程度由于该技术采用的是随机引物扩增，扩增结果的稳定性较差，这在一定程度上限制了其发展。上限制了其发展。（3）随机扩增片段长度多态性）随机扩增片段长度多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD）22AFLP是指通过是指通过PCR扩增经限制性内切酶酶切后的基因组扩增经限制性内切酶酶切后的基因组DNA模板产生显示模板产生显示多态性的多态性的DNA片段。这一方法最初是在片段。这一方法最初是在1992年由荷兰一家私人公司提出的。年由荷兰一家私人公司提出的。其原理和步骤其原理和步骤大致为：将基因组大致为：将基因组DNA用限制性内切酶酶切成片段，在用限制性内切酶酶切成片段，在DNA片片段两端连接上一段已知序列，再以该已知序列为基础，加上段两端连接上一段已知序列，再以该已知序列为基础，加上23个随机变化个随机变化的核苷酸序列设计引物，进行的核苷酸序列设计引物，进行PCR扩增和进一步检测。扩增和进一步检测。AFLP技术是在技术是在RAPD技术基础上，结合技术基础上，结合RFLP技术产生的。由于技术产生的。由于AFLP引物引物的特异性比的特异性比RAPD的随机引物强，从而克服了的随机引物强，从而克服了RAPD重复性差的问题，还可重复性差的问题，还可以通过增减引物的长度来控制以通过增减引物的长度来控制PCR扩增带型的复杂程度。这一方法的缺点是扩增带型的复杂程度。这一方法的缺点是技术操作较为复杂、成本也较高。技术操作较为复杂、成本也较高。对基因组对基因组DNA进行双酶切，形成分子量大小不同的随机限制片段，再进行进行双酶切，形成分子量大小不同的随机限制片段，再进行PCR扩增，根据扩增片段长度的多态性的比较分析，可用于构建遗传图谱、扩增，根据扩增片段长度的多态性的比较分析，可用于构建遗传图谱、标定基因和杂种鉴定以辅助育种。标定基因和杂种鉴定以辅助育种。（4）扩增片段长度多态性分析）扩增片段长度多态性分析 23DNA指纹图谱指纹图谱24主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有个碱基对中就有1个，估计其总个，估计其总数可达数可达300万个甚至更多。万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（换（transition）或颠换（）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。并不包括后两种情况。单核苷酸多态性单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）氯吡格雷氯吡格雷(抗凝药抗凝药)252 2、基因定位、基因定位(1)(1)植物基因定位：植物基因定位：借助基因标记和借助基因标记和DNA的分子的分子标标记，可使基因定位在精度、深记，可使基因定位在精度、深度、广度等方面有极大的提高。度、广度等方面有极大的提高。已陆续在一些农作物上定位了已陆续在一些农作物上定位了许多重要农艺性状和经济性状许多重要农艺性状和经济性状的基因，在复杂数量性状位点的基因，在复杂数量性状位点(quantitativetraitloci，QTL)定位分析方面，也取得了很大定位分析方面，也取得了很大进展。进展。26中断杂交实验中断杂交实验(min)：F+FHfrF（2）细菌的）细菌的基因定位基因定位27（3）人类家系分析）人类家系分析定位定位Y染色体染色体X染色体染色体常染色体：常染色体：28（4）原位杂交定位）原位杂交定位DNA或或RNA分子探针分子探针放射性标记放射性标记分子杂交分子杂交显影显影/显色显色基因定位基因定位29（1）酶切）酶切完全酶切完全酶切部分酶切部分酶切3 3、序列图序列图作图作图（1）酶切）酶切（2）叠连群建立）叠连群建立（3）序列测定）序列测定30（2）叠连群建立）叠连群建立31（3 3）序列测定）序列测定DNADNA测定的酶法，测定的酶法，化学测序法化学测序法 DNADNA自动测序自动测序32DNADNA测定的酶法：测定的酶法：即即SangerSanger法、终止法、双脱氧法法、终止法、双脱氧法 DNADNA聚合酶，聚合酶，单链单链DNADNA模板，引物复性后分模板，引物复性后分4 4份份 加加4 4种种dNTPdNTP（dATPdATP、dGTPdGTP、dTTPdTTP和和 dCTPdCTP），其中一种为，其中一种为-3232P P标记标记 各加一种双脱氧核苷三磷酸（各加一种双脱氧核苷三磷酸（ddNTPddNTP）,3,3 缺少一个羟基，故不能同后续的缺少一个羟基，故不能同后续的dNTPdNTP形成形成 磷酸二酯键。磷酸二酯键。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离制得的放射性自显影区带图谱分离制得的放射性自显影区带图谱 直接读得直接读得DNADNA的碱基序列的碱基序列序列测定方法之一序列测定方法之一AGTTGCTA33化学测序法又称化学测序法又称Maxam-GilbertMaxam-Gilbert法法序列测定方法之二序列测定方法之二把待把待测序的序的DNA分子成分子成单链分子，其分子，其5端用端用32P进行放射性行放射性标记。分成分成4份，每份用一种化学份，每份用一种化学试剂处理理DNA片段，片段，每种每种试剂可使可使DNA分子在一种碱基的分子在一种碱基的5端的磷酸端的磷酸二二酯键处发生断裂。使每个生断裂。使每个DNA分子只分子只发生一次生一次断裂。断裂。把把这4种反种反应产物用聚丙物用聚丙烯凝胶凝胶电泳泳进行分离，行分离，用用X光胶片光胶片进行曝光，得到一行曝光，得到一张由不同条由不同条带组成成的序列的序列图。从从图上就可以上就可以读出待出待测DNA片段的碱基序列。片段的碱基序列。34序列测定方法之三序列测定方法之三DNADNA自动测序仪：自动测序仪：根据根据SangerSanger法酶促原理法酶促原理 4 4种荧光染料标记引物种荧光染料标记引物 激光照射激光照射 阅读阅读4 4种颜色种颜色35GACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAA1.部分酶切部分酶切3.叠连群建立叠连群建立2.DNA2.DNA测序测序CTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCACTGGACCAGCACTGGACCAGCACTGGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCA36克隆克隆:是英文是英文Clone一词的单译，意为无性繁殖系，即通过无性繁殖（如细胞一词的单译，意为无性繁殖系，即通过无性繁殖（如细胞丝分裂）丝分裂）可连续传代并形成的群体，常用于细胞水平的描述。可连续传代并形成的群体，常用于细胞水平的描述。克隆技术（克隆技术（Cloning）:则指由众多则指由众多 的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得目的基因或细胞的技术操作。获得目的基因或细胞的技术操作。基因克隆基因克隆:是指某种目的基因的分离过程，通常是将生物材料的遗传物质如是指某种目的基因的分离过程，通常是将生物材料的遗传物质如DNA以酶切成片断，以酶切成片断，插入到载体中，通过无性繁殖（细菌或细胞的倍增）插入到载体中，通过无性繁殖（细菌或细胞的倍增）使其扩增，然后再以某种探针选使其扩增，然后再以某种探针选 择、钓取目的基因。择、钓取目的基因。2、基因克隆（基因克隆（Clone）基因克隆策略：基因克隆策略：1）功能克隆：）功能克隆：2）定位克隆；）定位克隆；371）功能克隆）功能克隆n克隆（致病）基因的一种策略。克隆（致病）基因的一种策略。n收收集集所所要要克克隆隆的的基基因因的的蛋蛋白白质质产产物物及及其其功功能能的的信信息息，用用以以分分离基因，并对基因进行定位。离基因，并对基因进行定位。性状（疾病）蛋白质产物（生物学功能）从氨基酸序列出发设计DNA引物，从文库调取基因得到基因序列染色体定位疾病疾病疾病疾病功能功能功能功能基因基因38血红蛋白病血红蛋白病镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症正常正常HbAHbA四条多肽链（四条多肽链（2 2条条 链，两条链，两条 链）链）39 2）定位克隆）定位克隆n又称为又称为“逆向遗传学逆向遗传学”，始于，始于2020世纪世纪8080年代后期年代后期n利用遗传连锁或细胞学定位技利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体的术将致病基因定位于染色体的特定区带特定区带n定位：通过连锁分析找出与目定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置染色体上的位置n克隆：从定位的染色体区段内克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。步研究其功能。疾病遗传标记，染色体定位基因序列mRNAcDNA蛋白质产物生物学功能 疾病疾病 基因基因功能功能40贺林实验室利用布依族、苗贺林实验室利用布依族、苗族和汉族的三个族和汉族的三个A-1型短指型短指（趾）症大家系，对该病的（趾）症大家系，对该病的致病基因进行了精确定位致病基因进行了精确定位（位点定在（位点定在2q35-36区）、区）、克隆，并首次发现了人克隆，并首次发现了人IHH基因和该基因上的三个突变基因和该基因上的三个突变位点是导致位点是导致A-1型短指（趾）型短指（趾）症的直接原因。症的直接原因。A-1型短指（趾）型短指（趾）症位点定在症位点定在2q35-36区区411 1）构建基因文库：）构建基因文库：用用DNADNA重组技术将某种生物重组技术将某种生物的总的总DNADNA用特定的限制性内用特定的限制性内切酶切割成一个个片段，然切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上，再某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到（克隆），当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。称为该种生物的基因文库。cDNA文库文库基因克隆具体方法：基因克隆具体方法：422 2）筛选文库）筛选文库：用放射性同位素或非放射性化学物质标记用放射性同位素或非放射性化学物质标记探针（待克隆的基因或探针（待克隆的基因或cDNA的一段同源的一段同源序列）序列）同文库的细菌克隆或噬菌斑作核酸分子杂同文库的细菌克隆或噬菌斑作核酸分子杂交交经放射自显影或显色反应后，可以筛选出经放射自显影或显色反应后，可以筛选出含有同探针互补序列的细菌克隆或噬菌斑含有同探针互补序列的细菌克隆或噬菌斑然后分析这些重组载体中所插入的然后分析这些重组载体中所插入的DNA片段或片段或cDNA最后分离出所要的基因或最后分离出所要的基因或cDNA。433 3）染色体步移）染色体步移知道距该基因一定距离上的一段知道距该基因一定距离上的一段DNA序列序列用该用该DNA序列作探针序列作探针,筛查文库筛查文库,得到阳性克隆得到阳性克隆分离出来重组载体中的插入片段分离出来重组载体中的插入片段用这个片段的末端部分作探针用这个片段的末端部分作探针再一轮筛查文库再一轮筛查文库得到新的重组载体中的插入片段得到新的重组载体中的插入片段再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库筛查文库通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因伸，最后可以步移到待克隆的基因444 4）电子杂交）电子杂交EST expressed sequence tag,EST EST expressed sequence tag,EST 表达序列标签，短的、单表达序列标签，短的、单次（测序）阅读的次（测序）阅读的cDNAcDNA序列。序列。EST1 200-300bp EST1 200-300bp的的cDNAcDNA片段片段 用用EST1EST1搜索搜索ESTEST数据库数据库 得到含一段共同序列另一个新得到含一段共同序列另一个新EST2EST2 EST1 EST1、EST2EST2拼接延伸成为拼接延伸成为EST3EST3 用用EST3EST3搜索搜索ESTEST数据库数据库 得到得到EST4EST4 EST3 EST3、EST4EST4拼接延伸拼接延伸EST5EST5 用用EST5EST5搜索搜索ESTEST数据库数据库 全长全长cDNAcDNA序列。序列。全全cDNAcDNA序列序列探针，探针，cDNAcDNA文库筛查，文库筛查，PCRPCR扩增扩增 全全cDNAcDNA基因基因45四、基因组功能研究四、基因组功能研究基因时空专一表达：基因时空专一表达：只在特定时间、特只在特定时间、特定空间（组织）的定空间（组织）的表达。表达。PCR463 AATTTTTTTTTTTpoly(T)55-CUUUGATGAAAAAAAAA-poly(A)33 TTTTTTTTTTTpoly(T)53 ACTTTTTTTTTTTpoly(T)53 GATTTTTTTTTTTpoly(T)53 CGTTTTTTTTTTTpoly(T)5mRNAcDNA1、mRNA差别显示反转录差别显示反转录PCR随机引物10bp472 2、削减杂交和抑制削减杂交、削减杂交和抑制削减杂交杜兴氏营养不良症杜兴氏营养不良症(DMD,X2p21有有微小缺失微小缺失)平末端（平末端（200倍倍）与受体与受体DNA一起变性一起变性复性复性克隆缺失基因克隆缺失基因483 3、微阵列和基因芯片、微阵列和基因芯片1）微阵列：）微阵列：微阵列上微阵列上“印印”有大量已知部分有大量已知部分序列的序列的DNA探针探针微阵列技术就是利用分子杂交原微阵列技术就是利用分子杂交原理理,使同时被比较的标本使同时被比较的标本(用同位用同位素或荧光素标记素或荧光素标记)与微阵列杂交与微阵列杂交通过检测杂交信号强度及数据处通过检测杂交信号强度及数据处理理,把他们转化成不同标本中特异把他们转化成不同标本中特异基因的丰度基因的丰度,从而全面比较不同标从而全面比较不同标本的基因表达水平的差异本的基因表达水平的差异微阵列技术是一种探索基因组功微阵列技术是一种探索基因组功能的有力手段能的有力手段492）基因芯片）基因芯片(genechip)基因芯片：基因芯片：又称又称DNA芯片、生物芯片。基因芯芯片、生物芯片。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法行核酸序列测定的方法该技术系指将大量（通常每平方厘米该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于点阵密度高于400）探针分子固定）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息序列信息探针固相原位合成技术和激光共聚焦探针固相原位合成技术和激光共聚焦显微技术显微技术 50512、基因转入、基因剔除及基因受抑、基因转入、基因剔除及基因受抑1、基因转入（、基因转入（geneknock-in）：）：就是通过将外源基因转入动物或植物，就是通过将外源基因转入动物或植物，研究该基因对表型有什么影响，从而认识基因的功能，也即转基因研究。研究该基因对表型有什么影响，从而认识基因的功能，也即转基因研究。由此获得的生物体使其表达出原来没有的某种新性状，便称为转基因动物或由此获得的生物体使其表达出原来没有的某种新性状，便称为转基因动物或转基因植物。转基因植物。2、基因剔除（、基因剔除（geneknock-out）：就是通过将基因组中某个基因破坏，就是通过将基因组中某个基因破坏，观察由此引起的表型变化，从而认识基因的功能，也即基因剔除研究。观察由此引起的表型变化，从而认识基因的功能，也即基因剔除研究。3、基因受抑（、基因受抑（geneknock-down）：）：主要利用反义核酸技术来降低或抑主要利用反义核酸技术来降低或抑制某基因的活性。制某基因的活性。52反义反义RNA：一种由两条一种由两条互补链转录成的两互补链转录成的两条完全互补的条完全互补的RNA链，链，结果形成复合体，不能翻结果形成复合体，不能翻译出蛋白多肽。译出蛋白多肽。RNA干涉干涉,RNAi53本章结束，谢谢！本章结束，谢谢！54