抗原和抗体的制备课件

免疫学技术有在食品安全免疫学技术有在食品安全 检测中的应用检测中的应用抗原的准备抗体的制备 常用的免疫学检测技术免疫学技术有在食品安全 检测中的应用抗原的准1第一节抗原的准备第一节抗原的准备l天然抗原的制备l人工抗原的制备l合成抗原第一节抗原的准备天然抗原的制备2抗原制备的主要技术途径抗原制备的主要技术途径天然抗原分离、纯化半抗原人工合成、载体联接抗原肽 合成、基因工程制备抗原制备的主要技术途径天然抗原分离、纯化3天然抗原的制备天然抗原的制备l颗粒抗原的制备l可溶性抗原 蛋白抗原 多糖抗原 天然抗原的制备颗粒抗原的制备4颗粒抗原的制备颗粒抗原的制备1、血红细胞抗原的制备：动物的新鲜血液+抗凝剂 离心去上清 NS悬浮 离心洗涤三次（2000转/分）颗粒抗原的制备5 绵羊红细胞的制备流程图44可保存可保存3 3周周 取适量取适量 NSNS洗涤洗涤3 3次次2000r/min2000r/min 10min 10minNSNS稀释至稀释至 2 25%5%摇动15-20min 绵羊红细胞的制备流程图4可保存3周 取6颗粒抗原的制备颗粒抗原的制备2、细菌抗原的制备 细菌培养（37 ，24小时）杀菌（100 ，2小时）NS稀释 菌体抗原颗粒抗原的制备2、细菌抗原的制备7 细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或液体培养或 斜面培养斜面培养 3724h 3724h100100水浴水浴 2 22.5h2.5h 杀菌杀菌无活菌试验无活菌试验NSNS稀释成稀释成8 81010亿亿/ml/mlO O菌体抗原菌体抗原 细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或1008种类：蛋白质多糖和细菌毒素。种类：蛋白质多糖和细菌毒素。细胞内存在的部位：胞外抗原和胞内抗原。细胞内存在的部位：胞外抗原和胞内抗原。胞外抗原胞外抗原:收集培养液或分泌物。收集培养液或分泌物。胞内抗原胞内抗原:提取、分离和纯化。提取、分离和纯化。可溶性抗原的分离纯化可溶性抗原的分离纯化可溶性抗原的分离纯化9胞内抗原的提取、分离和纯化l细胞的破碎细胞的破碎l分离纯化分离纯化胞内抗原的提取、分离和纯化细胞的破碎10 1.1.酶处理法酶处理法2.2.冻融法冻融法3.3.超声破碎法超声破碎法4.4.表面活性剂处理表面活性剂处理细胞的破碎细胞的破碎 1.酶处理法细胞的破碎111、酶处理法、酶处理法常用酶类：常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 特点：特点：适用于多种微生物；适用于多种微生物；作用条件温和；作用条件温和；内含物成分不易受到破坏；内含物成分不易受到破坏；细胞壁损坏的程度可以控制。细胞壁损坏的程度可以控制。1、酶处理法常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 122、冻融法、冻融法原理：原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。浓度的突然改变而破坏细胞。方法：方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化，将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。融破。特点：特点：适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。2、冻融法原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓133、超声破碎法、超声破碎法原理：原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。利用超声波的机械振动而使细胞破碎。超声波使用的频率从超声波使用的频率从1kHz20kHz，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。特点：特点：操作简单，重复性较好，节省时间；操作简单，重复性较好，节省时间；多用于微生物和组织细胞的破碎。多用于微生物和组织细胞的破碎。3、超声破碎法原理：144、表面活性剂处理法、表面活性剂处理法原理：原理：在适当的温度、在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。性改变或使之溶解。常用的有：常用的有：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型阴离子型)、二乙胺、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。型）、新洁尔灭等。应用：应用：破碎细菌，且作用比较温和。破碎细菌，且作用比较温和。4、表面活性剂处理法原理：15抗原的纯化抗原的纯化l1.超速离心法超速离心法l2.选择性沉淀法选择性沉淀法l3.凝胶层析法凝胶层析法l4.离子交换层析法离子交换层析法l5.亲合层析法亲合层析法抗原的纯化1.超速离心法161、超速离心法、超速离心法l原理原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。度层内，达到彼此分离的目的。l应用：应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗原物质的分离，如原物质的分离，如IgM、载脂蛋白、载脂蛋白A、B等。等。1、超速离心法172、选择性沉淀法、选择性沉淀法原理：原理：根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。从而达到纯化的目的。常用方法：常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解度不同），盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解度不同），常用常用3350饱和度的硫酸胺饱和度的硫酸胺。特点特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。应用：应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。在大量制备中先用此法粗提，再纯化。2、选择性沉淀法原理：183、凝胶层析法、凝胶层析法原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分子大小不当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，由于分子大小的不同先一的混合物加在凝胶床面时，由于分子大小的不同先后被洗脱出来，从而实现对不同分子大小的物质进行后被洗脱出来，从而实现对不同分子大小的物质进行分离。分离。常用的如：如葡聚糖凝胶填料（常用的如：如葡聚糖凝胶填料（sephadex 柱）3、凝胶层析法原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适19凝胶层析（分子筛）凝胶层析（分子筛）凝胶层析（分子筛）204、离子交换层析法、离子交换层析法原理：原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位与蛋白质竞争纤维素上的电荷位 置，从而使血清中的置，从而使血清中的蛋白质分成蛋白质分成球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白和清蛋白等球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。4、离子交换层析法原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交21离子交换层析离子交换层析+离子交换层析+225、亲和层析法、亲和层析法原理：原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗洗脱下来，达到纯化的目的。脱下来，达到纯化的目的。优点：优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。提取纯度高、抗原抗体不失活性。5、亲和层析法原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的23正常细胞正常细胞 标记细胞标记细胞洗滴洗滴标记细胞标记细胞被酶裂解被酶裂解加入特异加入特异性抗体性抗体其它蛋白其它蛋白洗涤流失洗涤流失SDS-PAGESDS-PAGE分离蛋白分离蛋白 亲和层析法示意图正常细胞标记细胞标记细胞加入特异其它蛋白SDS-PAGE 24亲和层析亲和层析亲和层析25抗原的鉴定抗原的鉴定1.含量鉴定：凯氏定氮法含量鉴定：凯氏定氮法 2.理化性质鉴定理化性质鉴定 凝胶层析技术测定凝胶层析技术测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶管状电泳凝胶管状电泳 超速离心超速离心3.纯度鉴定纯度鉴定 常用醋酸纤维膜电泳常用醋酸纤维膜电泳 4.免疫活性鉴定免疫活性鉴定 常用双向琼脂扩散试验常用双向琼脂扩散试验抗原的鉴定1.含量鉴定：凯氏定氮法 26半抗原免疫原的制备半抗原免疫原的制备1.半抗原：半抗原：低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物(包括抗生素）及其包括抗生素）及其他化学物品等。他化学物品等。2.载体：载体：蛋白质类蛋白质类 多肽聚合物多肽聚合物 大分子聚合物大分子聚合物3.半抗原半抗原-载体连接方法载体连接方法 半抗原免疫原的制备1.半抗原：27载体类型载体类型1.蛋白质：蛋白质：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。甲状腺球蛋白等。2.多肽聚合物：多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万（可达十几万到几十万)，这种多聚物和半抗原结合后，这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动物产生高效价、高亲和力的抗体。可刺激免疫动物产生高效价、高亲和力的抗体。3.大聚合物：大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，可与半抗原结羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦可诱发动物产生抗体。合，加入弗氏完全佐剂亦可诱发动物产生抗体。载体类型1.蛋白质：29 半抗原-载体连接方法1碳化二亚胺法：碳化二亚胺法：R-NH=CH-R-NH=CH-RR半抗原载体蛋白质半抗原载体蛋白质搅拌搅拌1 12h2h室温室温2424h h透析除去未反透析除去未反应的半抗原应的半抗原人工免疫原人工免疫原混合混合 半抗原-载体连接方法1碳化二亚胺法：R-30混合混合戊二醛法戊二醛法:半抗原半抗原-NH-NH2 2载体蛋白载体蛋白-NH-NH2 2半抗原半抗原-N=-N=CH-(CHCH-(CH2 2)3 3-CH=-CH=NH-NH-载体蛋白载体蛋白OHC-(CHOHC-(CH2 2)3 3-CHO-CHO*戊二醛是常用的带有两个活性基团的双戊二醛是常用的带有两个活性基团的双 功能联接剂功能联接剂混合戊二醛法:半抗原-NH2载体蛋白-NH2半抗原-N=CH31 半抗原-载体连接方法3氯甲酸异丁脂法：氯甲酸异丁脂法：半抗原半抗原-COOH-COOH载体蛋白载体蛋白-NH-NH2 2Cl-COO-CHCl-COO-CH2 2CH(CHCH(CH3 3)2 2半抗原半抗原-COO-COO-CH-COO-COO-CH2 2CH(CHCH(CH3 3)2 2半抗原半抗原-CO-CO-NHNH-载体蛋白载体蛋白简便，用于类固醇抗原制备简便，用于类固醇抗原制备HO-HO-CHCH2 2CH(CHCH(CH3 3)2 2 半抗原-载体连接方法3氯甲酸异丁脂法：半32 半抗原-载体连接方法4琥珀酸酐法：琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备用于不含羧基衍生物半抗原制备半抗原半抗原-CH-CH2 2OHOHCHCH2 2-CO -CO CHCH2 2-CO-CO 带羧基的半抗原带羧基的半抗原琥珀酸衍生物琥珀酸衍生物半抗原半抗原-CH-CH2 2-OOC-CH-OOC-CH2 2-CH-CH2 2-COOH-COOH吡啶吡啶再经氯甲酸异丁脂法或碳化再经氯甲酸异丁脂法或碳化二亚胺法制备载体半抗原二亚胺法制备载体半抗原 半抗原-载体连接方法4琥珀酸酐法：用于不33 佐剂佐剂概念：概念：能非特异地通过物理或化学方法与抗原结合从而增强能非特异地通过物理或化学方法与抗原结合从而增强其特异性免疫原性的物质。其特异性免疫原性的物质。条件：条件：增加抗原的表面积；增加抗原的表面积；改变抗原的活性基团构型；改变抗原的活性基团构型；佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间；佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间；可直接或间接激活免疫活性细胞可直接或间接激活免疫活性细胞 ；无毒性或无副作用。无毒性或无副作用。34 （二）常用佐剂的种类和制备1.1.氢氧化铝佐剂：氢氧化铝佐剂：5%5%硫酸铝硫酸铝5%5%氢氧化钠氢氧化钠氢氧化氢氧化铝沉淀铝沉淀制成悬液制成悬液即为佐剂即为佐剂强烈搅拌强烈搅拌NSNS洗洗二次二次NSNS等体积抗原等体积抗原免疫接种免疫接种常用佐剂的种类及制备常用佐剂的种类及制备 （二）常用佐剂的种类和制备1.氢氧化铝佐剂：535 2.2.明矾佐剂明矾佐剂10%10%硫酸钾铝硫酸钾铝氢氧化钠校正氢氧化钠校正pHpH值至值至6.56.5沉淀沉淀乳状悬液乳状悬液*明矾佐剂抗原常用于肌肉注射，皮下注射明矾佐剂抗原常用于肌肉注射，皮下注射 易引起肉芽种和脓肿。易引起肉芽种和脓肿。NSNS搅拌搅拌NSNS洗洗二次二次离心离心抗原抗原备用备用防腐剂防腐剂 2.明矾佐剂10%硫酸钾铝氢氧化钠校36作用大于不完全佐剂作用大于不完全佐剂局部形成肉芽种和溃疡局部形成肉芽种和溃疡不能用于人体不能用于人体弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂 3.3.弗氏佐剂弗氏佐剂(Freund adjuvant)液体石蜡液体石蜡完全完全乳化乳化备用备用高压高压灭菌灭菌加热加热抗原抗原弗氏不完全佐剂弗氏不完全佐剂卡介苗卡介苗羊毛脂羊毛脂鉴定鉴定一滴一滴乳剂乳剂乳剂不散乳剂不散浮于液面浮于液面水中水中混合混合作用大于不完全佐剂弗氏完全佐剂 3.弗37 增强抗原对机体的免疫原性；增强抗原对机体的免疫原性；增强抗体的产生能力；增强抗体的产生能力；为制备出高效价的免疫血清；为制备出高效价的免疫血清；在某种情况下，改变在某种情况下，改变AgAg免疫应答类型；免疫应答类型；延长抗原在免疫动物的时间；延长抗原在免疫动物的时间；增强局部对变应原的超敏反情况。增强局部对变应原的超敏反情况。佐剂的作用佐剂的作用 增强抗原对机体的免疫原性；佐剂的作用38人工抗原及基因工程抗原人工抗原及基因工程抗原l用化学合成法或基因重组法制备含有已知化学结构决定簇的抗原，称之为人工抗原。l它可包括人工结合抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。人工抗原及基因工程抗原用化学合成法或基因重组法制备含有已知化39人工合成抗原人工合成抗原l用化学方法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽。应用这种人工合成多肽可作为抗原。l只由一种氨基酸形成的聚合体称为同聚多肽，如由左旋赖氨酸形成的同聚多肽。l由二种或二种以上氨基酸形成的聚合多肽称为共聚多肽，如由酪氨酸、谷氨酸与多聚丙氨酸和赖氨酸组成的聚合成多肽。人工合成抗原用化学方法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽。应40基因工程抗原基因工程抗原l 将编码免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并与适当载体DNA分子相结合，然后引入受体细胞中使之表达，即能获得免疫原性之融合蛋白，经纯化后即基因工程疫苗。l 基因工程乙型肝炎病毒疫苗和在牛痘苗表达系统中研制乙肝病毒的重组感染载体的多价疫苗。基因工程抗原 将编码免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并41小结小结l抗原的种类l颗粒性抗原的制备l可溶性抗原提取分离纯化方法l抗原的鉴定l半抗原免疫原的制备l佐剂的作用小结抗原的种类42 第二第二节抗体的制抗体的制备l多克隆抗体的制备l单克隆抗体技术l基因工程抗体 第二节 抗体的制备多克隆抗体的制备43多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备l1.免疫动物选择免疫动物选择l2.免疫方法免疫方法l3.动物采血法动物采血法l4.免疫血清的分离及保存免疫血清的分离及保存 多克隆抗体的制备1.免疫动物选择44免疫动物的选择免疫动物的选择l能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。兔、绵能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。羊、豚鼠、鸡、山羊和马。l免疫动物的选择原则：免疫动物的选择原则：1.抗原与免疫动物种属差异越远越好；抗原与免疫动物种属差异越远越好；2.动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、体重合乎体重合乎要求；要求；3.不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答；不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答；4.按需要量选择大小不同的动物。按需要量选择大小不同的动物。免疫动物的选择能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。兔、绵45免疫方法免疫方法1.免疫原的注射剂量免疫原的注射剂量2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉 腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌3.免疫方案免疫方案 全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射 微量免疫法：卡介苗微量免疫法：卡介苗 弗氏佐剂弗氏佐剂 抗原抗原 混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉7天1月免疫方法1.免疫原的注射剂量7天1月46l1.颈动脉放血法颈动脉放血法l2.心脏采血法心脏采血法l3.静脉采血法静脉采血法动物采血法动物采血法1.颈动脉放血法动物采血法47免疫血清的分离和保存免疫血清的分离和保存免疫血清的分离免疫血清的分离 1、室温自然凝固，然后放置、室温自然凝固，然后放置37或或4待凝待凝 块收缩，分离血清。块收缩，分离血清。2、抗血清分出后要经抗血清分出后要经5630min灭活。灭活。免疫血清的保存免疫血清的保存 1.4保存：可保存保存：可保存36个月个月 2.低温保存：低温保存：-20-40，可保存，可保存23年年 3.冰冻干燥保存：可保存冰冻干燥保存：可保存35年年免疫血清的分离和保存免疫血清的分离48特异性抗体的纯化特异性抗体的纯化1.亲合层析法：亲合层析法：将交叉抗原交联到将交叉抗原交联到Sepharose 上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层 析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异 性抗体。性抗体。2.吸附法：吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直利用不含特异性抗原的抗原液，直 接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上 清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。特异性抗体的纯化1.亲合层析法：将交叉抗原交联到Sephar49特异性特异性IgG抗体的纯化抗体的纯化1.盐吸沉淀法：盐吸沉淀法：经硫酸铵盐析提取经硫酸铵盐析提取球蛋白球蛋白 3次，基本为次，基本为IgG类抗体，但不纯。类抗体，但不纯。2.A蛋白亲和层析：蛋白亲和层析：SPA与与IgG的的Fc段有很强的段有很强的 特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地 与抗体结合，一个与抗体结合，一个A蛋白至少可以结合二个蛋白至少可以结合二个 IgG分子。适合纯化细胞培养上清中的分子。适合纯化细胞培养上清中的McAb。3.其它：其它：凝胶过滤、离子交换层析等凝胶过滤、离子交换层析等特异性IgG抗体的纯化1.盐吸沉淀法：经硫酸铵盐析提取球蛋50特异性抗体的鉴定特异性抗体的鉴定1.抗体效价的鉴定：抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定即为抗体活性滴定2.抗体特异性鉴定抗体特异性鉴定 细菌类抗原的抗体用凝集试验细菌类抗原的抗体用凝集试验 可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验3.抗体的纯度鉴定：抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法免疫电泳分析法4.抗体亲和力鉴定：抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好亲和力高则灵敏度好特异性抗体的鉴定1.抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定51亲合力亲合力l亲合力是指抗体与结合抗原的活度或牢固度。抗体与抗原结合疏松，结合后会迅速解离，称为亲合力低，反之，亲合力高。l亲合力的高低是由抗原分子的大小，抗体分子的结合位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。l亲合力常以亲合常数K表示。K的单位是升/摩尔（L/mol）。l在RIA中，K是该抗血清能达到的最小检出量（灵敏度）的倒数，K=1/H，H是最小检出量，通常，K的范围在1081012L/mol之间。亲合力亲合力是指抗体与结合抗原的活度或牢固度。抗体与抗原结合52 单克隆抗体技术单克隆抗体：单克隆抗体：由由B细胞杂交瘤产生的只识别抗原细胞杂交瘤产生的只识别抗原分子上一种抗原决定簇的抗体分子。分子上一种抗原决定簇的抗体分子。单克隆抗体技术单克隆抗体：由B细胞杂交瘤产生的只识别抗原分53 杂交瘤技术的原理及流程 杂交瘤技术的原理及流程54lHAT培养基是含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的完全培养基。在氨基蝶呤(二氢叶酸类似物)存在下，这种酶缺陷的细胞不能通过核苷酸合成旁路合成次黄嘌呤和胸苷。l制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。l融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。lPEG：聚乙二醇HAT培养基是含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)55单克隆抗体的特性单克隆抗体的特性l高度均一性高度均一性 纯度很高的均一性抗体纯度很高的均一性抗体l高度专一性高度专一性 只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应l 大量产生及稳定性大量产生及稳定性 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖并传代杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖并传代 单克隆抗体的特性高度均一性56基因工程抗体基因工程抗体(Genetic engineering antibody)根据研究者的意图，采用基因工程方根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括行表达，产生新型抗体。主要包括 嵌合嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。体和双特异性抗体。基因工程抗体(Genetic engineering an57一.嵌合抗体(chimeric antibody)从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。鼠嵌合抗体。特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。一.嵌合抗体(chimeric antibody)58二.单链抗体(single chain antibody)用基因工程方法，将抗体重链和轻链可用基因工程方法，将抗体重链和轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。白。特点：能保持与抗原结合的性能，分特点：能保持与抗原结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。免疫原性低。二.单链抗体(single chain antibody)59三.人源化抗体(humanized antibody)1.将小鼠的将小鼠的CDR（互补决定区）序列移植（互补决定区）序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为为CDR移植抗体。移植抗体。2.将小鼠将小鼠Ig基因敲除，转染人基因敲除，转染人Ig基因，在基因，在小鼠体内产生人小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体。产生大量完全人源化抗体。三.人源化抗体(humanized antibody)160小结小结l抗血清的制备及纯化l单克隆抗体的制备l基因工程抗体技术小结抗血清的制备及纯化61作业作业1、抗原2、半抗原3、载体4、单克隆抗体5、试述针对食品中抗生素残留的多克隆抗体制备的流程。作业1、抗原62