发酵工程第二章发酵工业微生物菌种课件

第二章第二章 发酵工业微生物菌种发酵工业微生物菌种制备原理与技术制备原理与技术第二章第二章 发发酵工酵工业业微生物菌种微生物菌种制制备备原理与技原理与技术术第第 二二 章章第一第一节 发酵工酵工业微生物菌种的微生物菌种的选育育第二第二节 工工业微生物种子的微生物种子的扩大培养大培养第三第三节 种子培养基及其制种子培养基及其制备第第 二二 章第一章第一节节 发发酵工酵工业业微生物菌种的微生物菌种的选选育育第一第一节 发酵工酵工业微生物菌种的微生物菌种的选育育1工工业微生物的特点微生物的特点2发酵工酵工业常用微生物菌种及要求常用微生物菌种及要求3发酵工酵工业微生物菌种的分离和微生物菌种的分离和选育育4发酵工酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏微生物菌种的退化、复壮与保藏第一第一节节 发发酵工酵工业业微生物菌种的微生物菌种的选选育工育工业业微生物的特点微生物的特点一、工一、工业微生物的特点微生物的特点我我们把用于把用于发酵工酵工业的微生物也叫做工的微生物也叫做工业微生物。微生物。工工业微生物具微生物具备个体小、种个体小、种类多、繁殖快、分布多、繁殖快、分布广、代广、代谢强和易和易变异等特点。异等特点。发酵工程是以微生物的生命活酵工程是以微生物的生命活动为中心的，各种中心的，各种发酵生酵生产都必都必须有相有相应的微生物。的微生物。所以微生物所以微生物对于于发酵酵过程就十分重要。程就十分重要。一、工一、工业业微生物的特点我微生物的特点我们们把用于把用于发发酵工酵工业业的微生物也叫做工的微生物也叫做工业业微生微生发酵工酵工业微生物菌种的微生物菌种的选育育1工工业微生物的特点微生物的特点2发酵工酵工业常用微生物菌种及要求常用微生物菌种及要求3发酵工酵工业微生物菌种的分离和微生物菌种的分离和选育育4发酵工酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏微生物菌种的退化、复壮与保藏发发酵工酵工业业微生物菌种的微生物菌种的选选育工育工业业微生物的特点微生物的特点二、二、发酵工酵工业常用微生物菌种及要求常用微生物菌种及要求l微生物菌种能否微生物菌种能否满足工足工业生生产的的实际需求，是否需求，是否有工有工业生生产价价值是极是极为重要的。重要的。l发酵工酵工业对菌种的要求：菌种的要求：l能在廉价原料制能在廉价原料制备的培养基上迅速的生的培养基上迅速的生长并生成并生成所需的代所需的代谢产物，而且物，而且产量高；量高；l培养条件易于控制；培养条件易于控制；l生生长迅速，迅速，发酵周期短；酵周期短；l满足代足代谢控制的要求；控制的要求；二、二、发发酵工酵工业业常用微生物菌种及要求微生物菌种能否常用微生物菌种及要求微生物菌种能否满满足工足工业业生生产产的的发酵工酵工业对菌种的要求菌种的要求抗噬菌体和抗噬菌体和杂菌的能力菌的能力强；遗传性状性状稳定，不易定，不易变异退化；异退化；在在发酵酵过程中程中产生的泡沫要少，生的泡沫要少，这对提高装料系提高装料系数、提高数、提高单产量、降低成本有重要意量、降低成本有重要意义；对需要添加的前体物需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将有耐受能力，并且不能将这些前体作些前体作为一般碳源使用；一般碳源使用；不是病原菌，而且在系不是病原菌，而且在系统发育上与病原菌无关，育上与病原菌无关，不不产生任何有害的生物活性物生任何有害的生物活性物质。具具备以上条件的微生物才能保以上条件的微生物才能保证发酵酵产品的品的质量量和和产量。量。发发酵工酵工业对业对菌种的要求抗噬菌体和菌种的要求抗噬菌体和杂杂菌的能力菌的能力强强；二、二、发酵工酵工业常用微生物菌种及要求常用微生物菌种及要求l不是所有的微生物都能用于不是所有的微生物都能用于发酵工酵工业，目前工，目前工业上能利用的微生物菌种只有区区数百种。上能利用的微生物菌种只有区区数百种。l工工业上常用的微生物菌种：上常用的微生物菌种：l细菌：菌：工工业上常用的有枯草芽上常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆杆菌、醋酸杆菌、乳酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于生菌、乳酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于生产酶制制剂、乳酸、醋酸等。、乳酸、醋酸等。l酵母菌酵母菌 工工业上常用的酵母菌有啤酒酵母、假上常用的酵母菌有啤酒酵母、假丝酵母、酵母、类酵母等，用于酵母等，用于酿酒、制造面包、酒、制造面包、酶制制剂和生和生产菌体蛋白。菌体蛋白。二、二、发发酵工酵工业业常用微生物菌种及要求不是所有的微生物都能用于常用微生物菌种及要求不是所有的微生物都能用于发发酵酵工工业上常用的微生物菌种上常用的微生物菌种霉菌：霉菌：工工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲曲霉、青霉等，主要生霉、青霉等，主要生产酶制制剂、抗生素、有机酸、抗生素、有机酸和甾体激素等。和甾体激素等。放放线菌：菌：工工业上常用的有上常用的有链霉菌属、小霉菌属、小单胞菌胞菌属和属和诺卡菌属，主要用于生卡菌属，主要用于生产多种抗生素。多种抗生素。担子菌：担子菌：即常即常说的蕈菌，主要用于生的蕈菌，主要用于生产多糖、多糖、药物开物开发。藻藻类：工工业上常用的藻上常用的藻类有螺旋藻、有螺旋藻、单烈藻等，烈藻等，主要用于生主要用于生产食品，替代能源等。食品，替代能源等。工工业业上常用的微生物菌种霉菌：上常用的微生物菌种霉菌：工工业业上常用的霉菌有根霉、毛霉上常用的霉菌有根霉、毛霉发酵工酵工业微生物菌种的微生物菌种的选育育1工工业微生物的特点微生物的特点2发酵工酵工业常用微生物菌种及要求常用微生物菌种及要求3发酵工酵工业微生物菌种的分离和微生物菌种的分离和选育育4发酵工酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏微生物菌种的退化、复壮与保藏发发酵工酵工业业微生物菌种的微生物菌种的选选育工育工业业微生物的特点微生物的特点三、三、发酵工酵工业微生物菌种的微生物菌种的分离和分离和选育育工工业生生产使用的菌种，有两种来源：根据使用的菌种，有两种来源：根据资料直料直接向有科研接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或索取或购买；从大自然中分离；从大自然中分离筛选新的微生物新的微生物菌种。菌种。对于从自然界中分离于从自然界中分离筛选新的微生物菌种，必新的微生物菌种，必须制定相制定相应的策略，才能保的策略，才能保证好的好的结果。果。三、三、发发酵工酵工业业微生物菌种的微生物菌种的分离和分离和选选育工育工业业生生产产使用的菌种，有两使用的菌种，有两三、三、发酵工酵工业微生物菌种的微生物菌种的分离和分离和选育育（一）微生物菌种的分离（一）微生物菌种的分离（二）微生物菌种的（二）微生物菌种的选育育三、三、发发酵工酵工业业微生物菌种的微生物菌种的分离和分离和选选育（一）微生物菌种的分离育（一）微生物菌种的分离（一）微生物菌种的分离（一）微生物菌种的分离自然界自然界获得的微生物得的微生物样品通常都是品通常都是许多种微生物多种微生物共存，必共存，必须把目把目标菌种与菌种与杂菌分开，才能用于生菌分开，才能用于生产。目前。目前进行微生物分离的方法主要包括两个：行微生物分离的方法主要包括两个：施加施加选择性性压力分离法力分离法随机分离法随机分离法这两种方法都是两种方法都是针对菌种从菌种从样品中分离所采用的品中分离所采用的方法，方法，实际发酵工酵工业上菌种分离的步上菌种分离的步骤要有很多要有很多步步骤。（一）微生物菌种的分离自然界（一）微生物菌种的分离自然界获获得的微生物得的微生物样样品通常都是品通常都是许许多种微多种微新种分离与新种分离与筛选的步的步骤定定方方案案：首首先先要要查阅资料料，了了解解所所需需菌菌种种的的生生长培养特性。培养特性。采采样：有：有针对性地采集性地采集样品。品。增增殖殖：人人为的的通通过控控制制养养分分或或培培养养条条件件，使使所所需需菌种增殖培养后，在数量上占菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技分离：利用分离技术得到得到纯种。种。发酵酵性性能能测定定：进行行生生产性性能能测定定。这些些特特性性包包括括形形态、培培养养特特征征、营养养要要求求、生生理理生生化化特特性性、发酵酵周周期期、产品品品品种种和和产量量、耐耐受受最最高高温温度度、生生长和和发酵最适温度、最适酵最适温度、最适值、提取工、提取工艺等。等。新种分离与新种分离与筛选筛选的步的步骤骤定方案：首先要定方案：首先要查阅资查阅资料，了解所需菌种的生料，了解所需菌种的生从从自自然然界界中中分分离离培培养养微微生生物物是是菌菌种种选育育的的重重要要和和基基础的的步步骤。到到目目前前为止止，还没没有有一一种种分分离离培培养养方方法法能能揭揭示示一一个个试样中所包含的所有微生物中所包含的所有微生物总数和种数和种类。在在任任一一试样中中所所存存在在的的微微生生物物仅为极极少少数数特特定定种种类的的菌菌株株；在在工工业微微生生物物筛选过程程中中，应及及时调整整检测方方法法，以与各种不同以与各种不同类型的生型的生长和代和代谢之微生物相适之微生物相适应。因因此此，建建立立更更为科科学学的的和和针对性性不不强的的分分离离方方法法是是必必要要的。的。新种分离与新种分离与筛选的步的步骤从自然界中分离培养微生物是菌种从自然界中分离培养微生物是菌种选选育的重要和基育的重要和基础础的步的步骤骤。新种分。新种分（一）采（一）采样1、采、采样对象象 以采集土壤以采集土壤为主。一般园田土和耕作主。一般园田土和耕作过的沼的沼泽土中，以土中，以细菌和放菌和放线菌菌为主；富含主；富含碳水化合物的土壤和沼碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉地中，酵母和霉菌菌较多，如一些野果生多，如一些野果生长区和果园内。采区和果园内。采样的的对象也可以是植物，腐象也可以是植物，腐败物品，某些物品，某些水域等。水域等。新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤（一）采（一）采样样新种分离与新种分离与筛选筛选的步的步骤骤（一）采（一）采样2、采、采样季季节：以温度适中，雨量不多的秋初：以温度适中，雨量不多的秋初为好。好。3、采采土土方方式式：在在选好好适适当当地地点点后后，用用小小铲子子除除去去表表土土，取取离离地地面面5-15处的的土土约10g，盛盛入入清清洁的的牛牛皮皮纸袋袋或或塑塑料料袋袋中中，扎扎好好，标记，记录采采样时间、地地点点、环境境条条件件等等，以以备查考考。为了了使使土土样中中微微生生物物的的数数量量和和类型型尽尽少少变化化，宜宜将将样品品逐逐步步分分批批寄回，以便及寄回，以便及时分离。分离。新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤（一）采（一）采样样新种分离与新种分离与筛选筛选的步的步骤骤（二）增殖培养（二）增殖培养为了了容容易易分分离离到到所所需需的的菌菌种种，让无无关关的的微微生生物物至至少少是是在在数数量量上上不不要要增增加加，可可以以通通过配配制制选择性性培培养基，养基，选择一定的培养条件来控制。一定的培养条件来控制。例例如如碳碳源源利利用用的的控控制制，可可选定定糖糖，淀淀粉粉、纤维素素，或或者者石石油油等等，以以其其中中的的一一种种为唯唯一一碳碳源源，那那么么只只有有利利用用这一一碳碳源源的的微微生生物物才才能能大大量量正正常常生生长，而而其其它它微微生生物物就就可可能能死死亡亡或或淘淘汰汰。这样对下下阶段段的的纯种分离就会种分离就会顺利得多。利得多。新种分离与新种分离与筛选的步的步骤（二）增殖培养新种分离与（二）增殖培养新种分离与筛选筛选的步的步骤骤（三）培养分离（三）培养分离尽尽管管通通过增增殖殖培培养养效效果果显著著，但但还是是处于于微微生生物物的的混混杂生生长状状态。因因此此还必必须分分离离，纯化化。在在这一一步步，增增殖殖培培养养的的选择性性控控制制条条件件还应进一一步步应用用，而而且且控控制制得得细一一点点，好好一一点点。纯种种分分离的方法有划离的方法有划线分离法、稀分离法、稀释分离法。分离法。新种分离与新种分离与筛选的步的步骤（三）培养分离新种分离与（三）培养分离新种分离与筛选筛选的步的步骤骤施加施加选择性性压力分离法力分离法施加施加选择性性压力分离法：利用不同种力分离法：利用不同种类微生物生微生物生长繁殖繁殖对环境和境和营养要求不同，人养要求不同，人为控制控制这些条些条件，使之利于某件，使之利于某类或者某种微生物生或者某种微生物生长，不利于，不利于其他微生物生存，以达到使目的菌占其他微生物生存，以达到使目的菌占优势，从而，从而快速分离快速分离纯化的目的。化的目的。此方法一般用于富集培养，即采集此方法一般用于富集培养，即采集样品后的第一品后的第一步，可以使步，可以使样品中目品中目标微生物能大量繁殖。微生物能大量繁殖。目前，分离培养基中也广泛加入目前，分离培养基中也广泛加入选择性性压力因素，力因素，进一步一步获得目得目标微生物。微生物。施加施加选择选择性性压压力分离法施加力分离法施加选择选择性性压压力分离法：利用不同种力分离法：利用不同种类类微生物微生物（四）（四）筛 选 这一一步步是是采采用用与与生生产相相近近的的培培养养基基和和培培养养条条件件，通通过三三角角瓶瓶的的容容量量进行行小小型型发酵酵试验，以以求求得得适适合合于于工工业生生产用菌种。用菌种。新种分离与新种分离与筛选的步的步骤（四）（四）筛筛 选选新种分离与新种分离与筛选筛选的步的步骤骤（五）毒性（五）毒性试验 自自然然界界的的一一些些微微生生物物是是在在一一定定条条件件下下产毒毒的的，将将其其作作为生生产菌菌种种应当当十十分分当当心心，尤尤其其与与食食品品工工业有有关关的的菌菌种种，更更应慎慎重重。据据有有的的国国家家规定定，微微生生物物中中除除啤啤酒酒酵酵母母、脆脆壁壁酵酵母母、黑黑曲曲霉霉、米米曲曲霉霉和和枯枯草草杆杆菌菌作作为食食用用无无须作作毒毒性性试验外外，其其他他微微生生物物作作为食食用用，均均需需通通过两两年年以以上上的的毒毒性性试验。新种分离与新种分离与筛选的步的步骤（五）毒性（五）毒性试验试验新种分离与新种分离与筛选筛选的步的步骤骤不同微生物分离的方法不同微生物分离的方法细菌的分离菌的分离放放线菌的分离菌的分离霉菌的分离霉菌的分离不同微生物分离的方法不同微生物分离的方法细细菌的分离菌的分离(一一)采采样样和采集方法和采集方法为为了了从从一一特特定定生生态态系系统统中中分分离离出出具具有有代代表表性性的的细细菌菌菌菌群群，特特别别是是分分离离那那些些在在唯唯一一微微环环境境区区域域中中出出现现的的菌菌群群时时，必必须须十分重十分重视样视样本的采集。本的采集。样样本本采采集集时时所所需需的的工工具具通通常常有有无无菌菌刮刮铲铲、土土样样采采集集器器、镊镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。细菌的分离细菌的分离(一一)采采样样和采集方法和采集方法细细菌的分离菌的分离l采采样的注意事的注意事项l1、采、采样时应尽可能保持相尽可能保持相对无菌；无菌；l2、所采集的、所采集的样本必本必须具有某种代表性；具有某种代表性；l3、采采好好的的样必必须完完整整地地标上上样本本的的种种类及及采采集集日日期期、地点以及采集地点的地理、生地点以及采集地点的地理、生态参数等；参数等；l4、应充充分分考考虑采采样的的季季节性性和和时间因因素素，因因为真真正正的的原地菌群的出原地菌群的出现可能是短可能是短暂的；的；l5、采采好好的的样应及及时处理理，暂不不能能处理理的的也也应贮存存于于4下下，但但贮存存时间不不宜宜过长。这是是因因为一一旦旦采采样结束束，试样中中的的微微生生物物群群体体就就脱脱离离了了原原来来的的生生态环境境，其其内内部部生生态环境就会境就会发生生变化，微生物群体之化，微生物群体之间就会出就会出现消消长细菌的分离细菌的分离采采样样的注意事的注意事项细项细菌的分离菌的分离土土样采集方法采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上向上层顺序采集；序采集；水水田田等等浸浸水水土土壤壤在在不不损土土层结构构的的情情况况下下插插入入圆筒筒采采集集。如如果果层次次要要求求不不严格格，可可取取离离地地面面515处的的土土。将将采采集集到的土到的土样盛入聚乙盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。袋或玻璃瓶中。在在采采集集植植物物根根际土土样时，一一般般方方法法是是自自土土壤壤中中慢慢慢慢拔拔出出植植物物根根，在在大大量量无无菌菌水水中中浸浸渍约20，洗洗去去粘粘附附在在根根上上的的土土壤壤，然然后后再再用用无无菌菌水水漂漂洗洗下下根根部部残残留留的的土土，这部部分分即即为根根际土土样。土土样样采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层层向上向上层顺层顺序采序采植物体采集方法植物体采集方法在在采采集集叶叶面面时，一一般般是是用用灭菌菌的的剪剪刀刀、打打孔孔器器、安安全全刀刀片片等等，由由几几片片新新鲜叶叶片片的的同同一一部部位位切切取取一一小小块，并并注注意意不要不要损伤周周围边缘。选择叶叶面面时应考考虑叶叶位位、叶叶龄、叶叶片片正正反反面面和和在在一一片片叶叶上的取上的取样部位。部位。采采集集植植物物根根及及根根系系时，方方法法与与根根际土土样采采集集方方法法相相似似。将将洗洗净的的根根装装入入采采样袋袋中中，采采集集根根系系时，一一般般与与根根际土土样一起保存。一起保存。植物体采集方法在采集叶面植物体采集方法在采集叶面时时，一般是用，一般是用灭灭菌的剪刀、打孔器、安全菌的剪刀、打孔器、安全 水水样样采集方法采集方法用用于于细菌菌检测的的水水样应收收集集于于100干干净、灭菌菌的的广广口口塑塑料料瓶中。瓶中。由由于于表表层水水中中含含有有泥泥沙沙，故故在在采采样时应在在较深深的的静静水水层中中采集水采集水样。方方法法是是：握握住住采采样瓶瓶底底浸浸入入水水中中30-50处，然然后后瓶瓶口口朝朝下下打打开开瓶瓶盖盖，让水水样进入入。如如果果有有急急流流存存在在的的话，应直直接接将将瓶瓶口口反反向向于于急急流流。采采集集瓶瓶从从水水中中取取出出时应迅迅速速并并带有有较大大的的弧弧度度。水水样不不应装装满采采样瓶瓶。所所有有水水样都都应在在24h之之内内迅速迅速进行行检测，或者，或者4下下贮存。存。水水样样采集方法用于采集方法用于细细菌菌检测检测的水的水样应样应收集于收集于100干干净净、灭灭菌的广菌的广玻璃水样采集器玻璃水样采集器不锈钢水样采集器不锈钢水样采集器卡盖式水样采集器卡盖式水样采集器玻璃水玻璃水样样采集器不采集器不锈钢锈钢水水样样采集器卡盖式水采集器卡盖式水样样采集器采集器培养基的培养基的组成原成原则1、加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物种种类类和和用用量量、环环境境生生物物物物理理学学参参数数以以及及用用于于平平板板涂涂布布分分离离样样本本的的溶溶剂剂都都会会影影响响实实验验中所要分离的中所要分离的细细菌的数量和种菌的数量和种类类。2、就就分分离离培培养养基基的的组组成成而而言言，部部分分培培养养基基中中必必须须含含有有10-50%的的天天然然提提取取物物。加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物，部部分分培培养养基基中中则则应应含含有有多多种种碳碳、氮氮源源，如如几几丁丁质质、纤纤维维素素或或果胶。果胶。培养基的培养基的组组成原成原则则1、加入培养基中的天然提取物种、加入培养基中的天然提取物种类类和用量、和用量、环环境境3、所有分离培养基中都、所有分离培养基中都应应含有抗真菌含有抗真菌剂剂(如放如放线线菌菌酮酮和制和制霉素霉素)，掺掺加加浓浓度一般度一般为为50gm1，以抑制真菌的生以抑制真菌的生长长。4、琼琼脂平板在使用前脂平板在使用前应应置于置于37培养箱中孵育培养箱中孵育l、2天。天。5、培养基的生物物理学参数，如及、培养基的生物物理学参数，如及盐盐分也分也应调节应调节到与到与试样试样的生的生态态系系统统参数参数值值相近。相近。培养基的培养基的组成原成原则3、所有分离培养基中都、所有分离培养基中都应应含有抗真菌含有抗真菌剂剂(如放如放线线菌菌酮酮和制霉素和制霉素)，土中土中细菌的富集培养与分离菌的富集培养与分离分离土分离土样中的大部分中的大部分细菌的分离程序中无需菌的分离程序中无需进行富集。行富集。但但对某些少数某些少数细菌菌则要求特殊的富集或要求特殊的富集或选择技技术才能很才能很好地被分离培养。好地被分离培养。运用运用细菌的菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、性，在分离培养基中添加若干抗生素、复复杂底物及生底物及生长因子的前体物因子的前体物质来激活来激活细菌某一特殊基菌某一特殊基因因组，可以建立起若干富集技，可以建立起若干富集技术。富集可以促富集可以促进抗性的抗性的产生并生并维持下来。持下来。土中土中细细菌的富集培养与分离分离土菌的富集培养与分离分离土样样中的大部分中的大部分细细菌的分离程序中无菌的分离程序中无水中水中细菌富集技菌富集技术在在无无菌菌的的、用用棉棉团塞塞好好的的广广口口三三角角烧瓶瓶中中连续培培养养，定定期期取取样涂布适宜分离涂布适宜分离琼脂平板上；脂平板上；在在不不同同水水体体的的水水样中中加加入入一一定定的的底底物物如如蔗蔗糖糖、多多糖糖及及蛋蛋白白质等，同等，同样可以促可以促进水中微生物的增殖。水中微生物的增殖。培养培养过程中可加入低程中可加入低浓度的抗真菌度的抗真菌剂以抑制真菌的生以抑制真菌的生长。另另一一富富集集方方法法是是在在培培养养烧瓶瓶中中添添加加细菌菌“附附着着材材料料”，如如无菌的植物无菌的植物组织或土壤浸出液。或土壤浸出液。通通过改改变培培养养温温度度和和培培养养周周期期可可选择性性富富集集嗜嗜冷冷性性细菌菌、中温菌和嗜高温菌。中温菌和嗜高温菌。水中水中细细菌富集技菌富集技术术在无菌的、用棉在无菌的、用棉团团塞好的广口三角塞好的广口三角烧烧瓶中瓶中连续连续培养培养次代培养及次代培养及纯化步化步骤1、涂涂布布的的平平板板经经培培养养后后，如如生生长长出出菌菌落落，则则按按涂涂布布不不同同稀稀释释度度的的稀稀释释液液所所得得的的单单菌菌菌菌落落和和多多菌菌菌菌落落对对琼琼脂脂平平板板进进行行分分类类。2、用用无无菌菌牙牙签签将将菌菌落落转转接接到到筛筛选选平平板板上上及及转转接接至至添添加加有有少少量量天然浸出液的适宜保藏天然浸出液的适宜保藏琼琼脂斜面上。脂斜面上。3、筛筛选选平平板板经经培培养养后后，按按生生长长出出菌菌落落的的形形态态学学特特征征如如色色素素、菌落形菌落形态态等等进进行最初分行最初分组组。4、将将认认为为有有希希望望的的菌菌落落用用牙牙签签转转接接到到另另一一模模拟拟分分离离琼琼脂脂平平板板上上进进行行筛选筛选。次代培养及次代培养及纯纯化步化步骤骤1、涂布的平板、涂布的平板经经培养后，如生培养后，如生长长出菌落，出菌落，则则按按不同微生物分离的方法不同微生物分离的方法细菌的分离菌的分离放放线菌的分离菌的分离霉菌的分离霉菌的分离不同微生物分离的方法不同微生物分离的方法细细菌的分离菌的分离放放线菌的分离菌的分离(一一)采采样样及采集方法及采集方法应应尽可能尽可能实实行无菌操作。行无菌操作。所采集的所采集的样样本本应应具有一定的代表性。具有一定的代表性。样样本采集完后，本采集完后，应应及及时处时处理或在理或在44下下贮贮存，存，贮贮存存试样处应试样处应与划与划线线，筛选筛选平板分开，平板分开，贮贮存存时间时间不宜不宜过长过长。(二二)生生态态学参数学参数放放线线菌分离培养菌分离培养过过程中所需考程中所需考虑虑的生的生态态参数有温度、离子参数有温度、离子强强度、氧化度、氧化还还原原电势电势和底物和底物浓浓度。度。放放线线菌的分离菌的分离(一一)采采样样及采集方法及采集方法（三）培养基的（三）培养基的组成原成原则大大多多数数放放线菌菌的的分分离离培培养养是是在在贫脊脊或或复复杂底底物物的的琼脂脂平平板板上上进行行的的。除除嗜嗜温温性性放放线菌菌外外，其其他他放放线菌菌一一般般在在培培养养4-204-20天内在分离平板上天内在分离平板上缓慢形成菌落。慢形成菌落。在在放放线菌菌分分离离琼脂脂中中通通常常都都加加入入抗抗真真菌菌剂制制霉霉菌菌素素或或放放线菌菌酮，以抑制真菌的繁殖。，以抑制真菌的繁殖。选择性地添加抗生素。性地添加抗生素。分分离离琼脂脂平平板板制制备好好后后，一一般般皆皆应在在3737培培养养箱箱中中存存放放3 3天。天。放放线菌的分离菌的分离（三）培养基的（三）培养基的组组成原成原则则放放线线菌的分离菌的分离放放线菌的分离菌的分离土土样中放中放线菌的非菌的非选择性分离：土性分离：土样风干，磨碎，无菌干，磨碎，无菌海海绵压印土印土样后后压印平板后培养。印平板后培养。植物体上放植物体上放线菌的分离：无菌取植物菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可后培养。也可洗下微生物后振洗下微生物后振荡培养。培养。水中放水中放线菌的分离：菌的分离：为使所要分离的放使所要分离的放线菌的数量种菌的数量种类增多，一般将水增多，一般将水样离心或离心或滤纸过滤，取离心沉，取离心沉积或或滤纸表面沉表面沉积进行稀行稀释和涂布。和涂布。放放线线菌的分离土菌的分离土样样中放中放线线菌的非菌的非选择选择性分离：土性分离：土样风样风干，磨碎，无菌干，磨碎，无菌次代培养及次代培养及纯化化菌菌落落形形成成后后可可根根据据肉肉眼眼可可见的的菌菌落落形形态上上的的差差异异，作作初初步的步的鉴定和区分。定和区分。通通过高高倍倍放放大大进行行镜检，可可了了解解气气生生和和营养养孢子子形形成成情情况。况。成成功功地地分分离离出出各各种种不不同同的的放放线菌菌属属及及种种的的关关键是是所所采采集集样本本的的本本身身及及其其分分离离用用的的琼脂脂培培养养基基；而而肉肉眼眼识别不不同同的的生生长形形态、从从而而初初步步地地加加以以鉴定定，在在分分离离放放线菌菌时尤尤为重要。重要。将将分分离离平平板板上上所所形形成成的的菌菌落落用用经火火焰焰灼灼烧灭菌菌的的钩形形针或或无无菌菌牙牙签挑挑取取，点点接接到到琼脂脂平平板板上上进行行影影印印培培养养，以以进一步一步筛选和分离。和分离。次代培养及次代培养及纯纯化菌落形成后可根据肉眼可化菌落形成后可根据肉眼可见见的菌落形的菌落形态态上的差异，作上的差异，作不同微生物分离的方法不同微生物分离的方法细菌的分离菌的分离放放线菌的分离菌的分离霉菌的分离霉菌的分离不同微生物分离的方法不同微生物分离的方法细细菌的分离菌的分离真真 菌菌 分分 离离1 1、利利用用低低碳碳氮氮比比的的培培养养基基可可使使真真菌菌生生长长菌菌落落分分散散，利利于于计计数数，分分离离和和鉴鉴定定。这这里里主主要要是是利利用用营营养养成成分分的的减减少而使生少而使生长长减慢，并由此限制真菌的迁涉生减慢，并由此限制真菌的迁涉生长长。2 2、改、改变变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3 3、有有时时，真真菌菌子子实实体体形形成成必必须须有有光光线线，这这在在分分离离培培养养时时应应加以考加以考虑虑。真真 菌菌 分分 离离1、利用低碳氮比的培养基可使真菌生、利用低碳氮比的培养基可使真菌生长长菌菌4、选择选择性富集：是通性富集：是通过过一定的方式使一定的方式使样样本中一种或一群微本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技生物数量上的增加而利于分离的一种技术术。富集可以是种水平的，如通富集可以是种水平的，如通过营过营养要求的改养要求的改变变来富集来富集分离分离镰镰刀菌；也可以是刀菌；也可以是组组成群水平的，如以成群水平的，如以纤维纤维素素为为唯唯一碳源的一碳源的选择选择性培养基可性培养基可选择选择性富集所有能降解性富集所有能降解纤维纤维素素的的纤维纤维素裂解微生物。素裂解微生物。5、选择选择性抑制培养基可使非目性抑制培养基可使非目标标微生物消除或减少到一定微生物消除或减少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑程度。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制制细细菌生菌生长长及菌落形成。及菌落形成。真真 菌菌 分分 离离4、选择选择性富集：是通性富集：是通过过一定的方式使一定的方式使样样本中一种或一群微生物数量本中一种或一群微生物数量真菌的分离方法真菌的分离方法土土中中真真菌菌的的分分离离：稀稀释法法，混混入入法法，压贴法法，粘粘附附法法，浮浮选法法，注注射射器器采采集集法法，土土过筛法法，庶庶糖糖密密度度梯梯度度离离心法。心法。植植物物材材料料中中真真菌菌的的分分离离：植植入入法法，压贴法法，洗洗涤法法，浸泡法。浸泡法。水中真菌的分离：水水中真菌的分离：水样稀稀释后涂布分离。后涂布分离。子子实体体直直接接分分离离培培养养担担子子菌菌：新新采采集集的的子子实体体组织植植入入平平板板内内或或在在放放于于液液体体培培养养基基表表面面放放一一小小块无无菌菌滤纸上培养。上培养。真菌的分离方法土中真菌的分离：稀真菌的分离方法土中真菌的分离：稀释释法，混入法，法，混入法，压贴压贴法，粘附法法，粘附法随机分离法随机分离法有些微生物在分离和有些微生物在分离和筛选的的时候并不是采用候并不是采用传统的的选择性性压力分离法，只能采用随机法力分离法，只能采用随机法进行分离。行分离。抗生素抗生素产生菌的分离生菌的分离抗抗肿瘤瘤药物物产生菌的分离生菌的分离酶抑制抑制剂产生菌的分离生菌的分离抗病毒抗病毒药物物产生菌的分离生菌的分离生生长因子因子产生菌的分离生菌的分离免疫激活免疫激活剂产生菌的分离生菌的分离多糖多糖产生菌的分离生菌的分离随机分离法有些微生物在分离和随机分离法有些微生物在分离和筛选筛选的的时时候并不是采用候并不是采用传统传统的的选择选择性性抗生素抗生素产生菌的分离生菌的分离抗生素抗生素产生菌生菌筛选方法包括：抑菌圈法、稀方法包括：抑菌圈法、稀释法、法、扩散法、生物自散法、生物自显影法等等。影法等等。如抑菌圈法，由于抗生素如抑菌圈法，由于抗生素产生菌会生菌会产生抗生素，生抗生素，因此事先在平板上涂抹适当的供因此事先在平板上涂抹适当的供试菌（菌（对抗生素抗生素敏感），如果待分离的微生物能敏感），如果待分离的微生物能够在菌落周在菌落周围形形成抑菌圈，即成抑菌圈，即说明是具有抗生素明是具有抗生素产生能力的菌种。生能力的菌种。另外也可以采用另外也可以采用专一性很一性很强的的筛选技技术，如采用，如采用与抗生素作用机制相关的与抗生素作用机制相关的酶进行行筛选。抗生素抗生素产产生菌的分离抗生素生菌的分离抗生素产产生菌生菌筛选筛选方法包括：抑菌圈法、稀方法包括：抑菌圈法、稀释释法法抗抗肿瘤瘤药物物产生菌的分离生菌的分离大部分抗大部分抗肿瘤瘤药物也具有抗菌和抗真菌活性，目物也具有抗菌和抗真菌活性，目前利用微生物前利用微生物筛选作用于的抗作用于的抗肿瘤瘤药物的方法具物的方法具有高灵敏度和有高灵敏度和简便快速的特点，如生化便快速的特点，如生化诱导分析分析法和生色法和生色检测法。法。生化生化诱导分析法也叫分析法也叫诱导检测法，通法，通过测定表达定表达的的-半乳糖苷半乳糖苷酶活性，来活性，来检测能能损伤的抗的抗肿瘤瘤药物的存在。物的存在。此外也可利用修复能力突此外也可利用修复能力突变株株进行抗行抗肿瘤瘤药物的物的筛选。抗抗肿肿瘤瘤药药物物产产生菌的分离大部分抗生菌的分离大部分抗肿肿瘤瘤药药物也具有抗菌和抗真菌活性物也具有抗菌和抗真菌活性酶抑制抑制剂产生菌的分离生菌的分离酶抑制抑制剂产生菌的生菌的筛选，主要，主要选择与生理和病理与生理和病理关系明确的关系明确的酶为靶靶酶进行行筛选。如可以用前列腺素合成如可以用前列腺素合成酶、血管、血管紧张素素转移移酶等等等作等作为靶靶酶，选择产生生酶抑制抑制剂的微生物。的微生物。酶酶抑制抑制剂产剂产生菌的分离生菌的分离酶酶抑制抑制剂产剂产生菌的生菌的筛选筛选，主要，主要选择选择与生理和病与生理和病三、三、发酵工酵工业微生物菌种的微生物菌种的分离和分离和选育育（一）微生物菌种的分离（一）微生物菌种的分离（二）微生物菌种的（二）微生物菌种的选育育三、三、发发酵工酵工业业微生物菌种的微生物菌种的分离和分离和选选育（一）微生物菌种的分离育（一）微生物菌种的分离（二）微生物菌种的（二）微生物菌种的选育育工工业菌种的育种：菌种的育种：是运用是运用遗传学原理和技学原理和技术对某个用于特定某个用于特定生物技生物技术目的的菌株目的的菌株进行的多方位的改造。通行的多方位的改造。通过改造，可使改造，可使现存的存的优良性状良性状强化，或去除不良性化，或去除不良性质或增加新的性状。或增加新的性状。工工业菌种的菌种的选育包括如下几个方法：自然育包括如下几个方法：自然选育、育、诱变选育、抗噬菌体菌种育、抗噬菌体菌种选育、育、杂交育种、原生交育种、原生质体融合技体融合技术和基因工程技和基因工程技术。（二）微生物菌种的（二）微生物菌种的选选育工育工业业菌种的育种：菌种的育种：1、自、自 然然 选选 育育不不经人工人工处理，利用微生物的自然突理，利用微生物的自然突变进行菌种行菌种选育的育的过程叫自然程叫自然选育。育。自然突自然突变可能会可能会产生两种截然不同的生两种截然不同的结果，一种果，一种是菌种退化而是菌种退化而导致目致目标产物物产量或量或质量下降，另量下降，另一种是一种是对生生产有益的突有益的突变。自然自然选育的突育的突变率率虽然很低，但是却是工厂保然很低，但是却是工厂保证稳产高高产的重要措施。的重要措施。自然自然选育育还要注意生要注意生产菌种的回复突菌种的回复突变。1、自、自 然然 选选 育不育不经经人工人工处处理，利用微生物的自然突理，利用微生物的自然突变进变进行菌种行菌种2、诱变选诱变选育育利用各种被称利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学的物理因素和化学试剂处理微生物理微生物细胞，提高基因突胞，提高基因突变频率，再通率，再通过适当适当的的筛选方法方法获得所需的高得所需的高产优质菌种的育种方法。菌种的育种方法。诱变育种包括育种包括诱变和和筛选两部分。两部分。2、诱变选诱变选育利用各种被称育利用各种被称为诱变剂为诱变剂的物理因素和化学的物理因素和化学试剂处试剂处理微生理微生诱变成功的关成功的关键，包括以下几个步，包括以下几个步骤：出出发菌株的菌株的选择，一定要考，一定要考虑目目标产物的生物的生产能能力，其他因素尽量考力，其他因素尽量考虑利于利于诱变。诱变剂使用方法，有使用方法，有单一一诱变剂和两种以上的和两种以上的诱变剂联合使用两种方法。合使用两种方法。诱变剂的的剂量量选择：诱变剂剂量与致死率有关系，量与致死率有关系，同同时与突与突变率有关系，所以一定要率有关系，所以一定要选择合适的使合适的使用用剂量。量。2、诱变选育、诱变选育诱变诱变成功的关成功的关键键，包括以下几个步，包括以下几个步骤骤：2、诱变选诱变选育育2、诱变诱变育种育种诱变处理理结束之后，菌种有可能束之后，菌种有可能发生很多生很多类型的型的变异，正向突异，正向突变的菌种往往占少数，必的菌种往往占少数，必须通通过初初筛和复和复筛之后在之后在经过发酵条件的酵条件的优化研究，确定化研究，确定最佳的条件，才能使高最佳的条件，才能使高产菌株菌株发挥生生产能力，不能力，不同菌株可以根据特性不同采用不同的同菌株可以根据特性不同采用不同的筛选方法，方法，如如营养缺陷型、抗反养缺陷型、抗反馈阻遏和抗反阻遏和抗反馈抑制型、抑制型、组成型突成型突变株、抗性突株、抗性突变株等株等类型。型。2、诱变诱变育种育种诱变处诱变处理理结结束之后，菌种有可能束之后，菌种有可能发发生很多生很多类类型的型的变变异，异，营养缺陷型突养缺陷型突变株株筛选营养缺陷型突养缺陷型突变株由于生物合成途径中某一步株由于生物合成途径中某一步发生了生了酶缺陷，合成不能完成，末端缺陷，合成不能完成，末端产物不能物不能积累，累，因此末端因此末端产物的反物的反馈调节作用被解除。作用被解除。在培养基内限量加入所要求的末端在培养基内限量加入所要求的末端产物，克服生物，克服生长障碍，就能障碍，就能积累所需的中累所需的中间产物。物。筛选时则可以利用可以利用这个个营养缺陷作养缺陷作为条件，条件，筛选出突出突变株。株。诱变、淘汰野生型、淘汰野生型、检出缺陷型、确定生出缺陷型、确定生长谱即即为营养缺陷型菌株养缺陷型菌株诱变育种的基本步育种的基本步骤。营营养缺陷型突养缺陷型突变变株株筛选营筛选营养缺陷型突养缺陷型突变变株由于生物合成途径中某一步株由于生物合成途径中某一步营养缺陷型突养缺陷型突变株育种株育种过程程淘汰野生型的方法：淘汰野生型的方法：抗抗生生素素法法：野野生生型型能能在在基基本本培培养养基基中中生生长，而而缺缺陷陷型型不不能能，于于是是将将诱变处理理液液在在基基本本培培养养基基中中培培养养短短时让野野生生型型生生长，处于于活活化化阶段段，而而缺缺陷陷型型无无法法生生长，仍仍处于于休休眠眠状状态。由由于于细菌菌或或酵酵母母对一一些些抗抗生生素素敏敏感感，于于是是就就相相应加加入入一一定定量量的的抗抗生生素素，结果果活活化化状状态的的野野生生型型就就被被杀死死，保保存存了了缺缺陷陷型型。一一般般细菌菌可可以以采采用用青青霉霉素素，酵酵母母可可采用制霉菌素。采用制霉菌素。菌菌丝过滤法法：对于于霉霉菌菌，因因孢子子生生长后后会会长出出菌菌丝体体，就就可可用用滤纸过滤法法将将菌菌丝滤去去，而而缺缺陷陷型型孢子子却却因因未未发芽而能芽而能滤过。营营养缺陷型突养缺陷型突变变株育种株育种过过程淘汰野生型的方法：程淘汰野生型的方法：营养缺陷型突养缺陷型突变株育种株育种过程程营养缺陷型的养缺陷型的检出：出：原原理理：在在固固体体基基本本培培养养基基和和完完全全培培养养基基上上，生生长情情况况完完全全不不同同，缺缺陷陷型型在在上上生生长良良好好，而而在在上上则不生不生长，野生型都能生，野生型都能生长。具体方法：影印法、点种法、具体方法：影印法、点种法、夹层法法营营养缺陷型突养缺陷型突变变株育种株育种过过程程营营养缺陷型的养缺陷型的检检出：出：营养缺陷型突养缺陷型突变株育种株育种过程程生生长谱确定确定验证确确定定是是缺缺陷陷型型后后，就就需需确确定定其其缺缺陷陷的的因因子子，即生即生长谱测定。定。利利用用固固体体培培养养基基，点点不不同同的的生生长因因子子，观察察菌菌种种的生的生长情况，来确定具体缺陷的因子。情况，来确定具体缺陷的因子。营营养缺陷型突养缺陷型突变变株育种株育种过过程生程生长谱长谱确定确定抗反抗反馈阻遏和抗反阻遏和抗反馈抑制型抑制型抗反抗反馈阻遏和抗反阻遏和抗反馈抑制是指能使抑制是指能使积累了大量末累了大量末端端产物的物的时候仍能不断合成候仍能不断合成这一一产物。物。筛选这类突突变菌株是通菌株是通过抗抗结构构类似物突似物突变的方的方法完成的。未突法完成的。未突变的的细胞会因胞会因为代代谢受阻，不能受阻，不能合成某种代合成某种代谢产物而死亡，突物而死亡，突变株仍能株仍能够合成相合成相应的末端的末端产物，形成菌落，便于区分。物，形成菌落，便于区分。抗反抗反馈馈阻遏和抗反阻遏和抗反馈馈抑制型抗反抑制型抗反馈馈阻遏和抗反阻遏和抗反馈馈抑制是指能使抑制是指能使积积累了累了组成型突成型突变株的株的筛选组成型突成型突变株是株是为了解除菌株了解除菌株对诱导物的依物的依赖而而获得的，因此可以得的，因此可以选择设计一种利于其生一种利于其生长并限并限制制诱导型菌株生型菌株生长的培养条件，来达到的培养条件，来达到筛选的效的效果。果。交替培养法就是交替培养法就是筛选组成型突成型突变株的有效方法。株的有效方法。如如-半乳糖苷半乳糖苷酶的的组成型突成型突变株和株和诱导性菌株就性菌株就可以用可以用这种方法区分。种方法区分。组组成型突成型突变变株的株的筛选组筛选组成型突成型突变变株是株是为为了解除菌株了解除菌株对诱导对诱导物的依物的依赖赖而而抗性突抗性突变株的株的筛选这包括包括对抗生素、金属离子、温度、噬菌体等的抗生素、金属离子、温度、噬菌体等的抗性抗性筛选，这些突些突变株株筛选都比都比较容易，在培养容易，在培养基内加入相基内加入相应的因子，即可去除掉野生型菌株。的因子，即可去除掉野生型菌株。如抗生素抗性突如抗生素抗性突变株的株的筛选，即在培养基内加入，即在培养基内加入相相应抗生素，比如加入青霉素，野生型的不能生抗生素，比如加入青霉素，野生型的不能生长，而青霉素抗性突，而青霉素抗性突变株株则可以生可以生长。其他的抗性突其他的抗性突变株的株的筛选方法方法类似。似。抗性突抗性突变变株的株的筛选这筛选这包括包括对对抗生素、金属离子、温度、噬菌体等的抗抗生素、金属离子、温度、噬菌体等的抗3 3、杂杂交育种交育种杂交育种：利用不同菌株之交育种：利用不同菌株之间遗传物物质的交的交换、重重组，使不同菌株的，使不同菌株的优良性状集中在重良性状集中在重组体中，体中，获得新菌株的方法。可以克服得新菌株的方法。可以克服长期期诱变引起的生引起的生活力下降等缺点。活力下降等缺点。杂交育种的交育种的优点点杂交育种的基本程序交育种的基本程序杂交育种的方法交育种的方法3、杂杂交育种交育种杂杂交育种：利用不同菌株之交育种：利用不同菌株之间遗传间遗传物物质质的交的交换换、重、重组组，杂交育种的交育种的优点点可以通可以通过育种使新菌株育种使新菌株获得多个菌株的得多个菌株的优良良遗传性状；性状；克服克服长期期诱变造成的生活力下降，同造成的生活力下降，同时提高提高对诱变剂的敏感性，降低的敏感性，降低“疲疲劳”效效应；总结遗传物物质的的转移和移和传递规律，丰富并促律，丰富并促进遗传学理学理论的的发展。展。杂杂交育种的交育种的优优点可以通点可以通过过育种使新菌株育种使新菌株获获得多个菌株的得多个菌株的优优良良遗传遗传性状性状杂交育种的基本程序交育种的基本程序标记亲和力标记亲和力 标记亲和力标记亲和力 杂杂交育种的基本程序交育种的基本程序标记亲标记亲和力和力 标记亲标记亲和力和力 杂交育种的方法交育种的方法杂交育种的方法包括如下几种：交育种的方法包括如下几种：原核微生物：接合、原核微生物：接合、转化、化、转导；真核微生物：有性生殖、准性生殖。真核微生物：有性生殖、准性生殖。大部分大部分发酵工酵工业中具有重要中具有重要经济价价值的微生物是的微生物是准性生殖的方式准性生殖的方式进行行杂交重交重组。杂杂交育种的方法交育种的方法杂杂交育种的方法包括如下几种：交育种的方法包括如下几种：4、原生、原生质质体融合技体融合技术术原生原生质体融合技体融合技术提供了充分利用提供了充分利用遗传重重组杂交交的方法，可以打破种属之的方法，可以打破种属之间的界限，提高重的界限，提高重组频率、率、扩大重大重组幅度。幅度。原生原生质体融合的体融合的优越性越性原生原生质体融合的方法体融合的方法4、原生、原生质质体融合技体融合技术术原生原生质质体融合技体融合技术术提供了充分利用提供了充分利用遗传遗传重重组杂组杂原生原生质体融合的体融合的优越性越性受接合型或致育型的限制小，两受接合型或致育型的限制小，两亲株没有供体和株没有供体和受体之分，有利于不同种属微生物的受体之分，有利于不同种属微生物的杂交；交；重重组频率比其他的率比其他的杂交方法高；交方法高；遗传物物质传递更加充分、完善，既有更加充分、完善，既有质配也有核配也有核配；配；可以采用温度、可以采用温度、药物、紫外物、紫外线等等处理理纯化菌株的化菌株的一方或者双方，然后再融合，提高一方或者双方，然后再融合，提高筛选效率；效率；用微生物的原生用微生物的原生质体体进行行诱变，可明，可明显提高提高诱变频率。率。原生原生质质体融合的体融合的优优越性受接合型或致育型的限制小，两越性受接合型或致育型的限制小，两亲亲株没有供体株没有供体原生原生质体融合的方法体融合的方法原生原生质体制体制备：使用各种：使用各种酶降解两个出降解两个出发菌的菌的细胞壁，胞壁，释放出原生放出原生质体，同体，同时释放到高渗溶液中。放到高渗溶液中。原生原生质体的融合与再生：通体的融合与再生：通过化学因子或化学因子或电场诱导进行融合。如聚乙二醇行融合。如聚乙二醇4000和和6000并加入并加入2+和和2+，融合之后涂布在高渗培养基上，令其再，融合之后涂布在高渗培养基上，令其再生。生。融合子的融合子的检出：融合子在出：融合子在选择性培养基上性培养基上检出，出，即通即通过两个两个遗传标记互互补确定的确定的选择性因素性因素进行行培养。培养。原生原生质质体融合的方法原生体融合的方法原生质质体制体制备备：使用各种：使用各种酶酶降解两个出降解两个出发发菌的菌的细细发酵工酵工业微生物菌种的微生物菌种的选育育1工工业微生物的特点微生物的特点2发酵工酵工业常用微生物菌种及要求常用微生物菌种及要求3发酵工酵工业微生物菌种的分离和微生物菌种的分离和选育育4发酵工酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏微生物菌种的退化、复壮与保藏发发酵工酵工业业微生物菌种的微生物菌种的选选育工育工业业微生物的特点微生物的特点四、四、发酵工酵工业微生物菌种的退化、微生物菌种的退化、复壮与保藏复壮与保藏微生物世代微生物世代时间一般很短一般很短暂，在，在传代代过程中易程中易发生生变异甚至死亡，因此常常造成工异甚至死亡，因此常常造成工业生生产菌种的菌种的退化，甚至可能使退化，甚至可能使优良菌种良菌种丢失，所以如何保持失，所以如何保持菌种的菌种的优良性能和良性能和稳定成定成为关关键。（一）微生物菌种的退化及原因（一）微生物菌种的退化及原因（二）防止菌种退化及退化菌种的复壮（二）防止菌种退化及退化菌种的复壮（三）菌种的保藏（三）菌种的保藏四、四、发发酵工酵工业业微生物菌种的退化、复壮与保藏微生物世代微生物菌种的退化、复壮与保藏微生物世代时间时间一般很一般很（一）微生物菌种的退化及原因（一）微生物菌种的退化及原因1.菌种退化：指在菌种退化：指在经过较长时间传代保藏之后，菌代保藏之后，菌株的一个或多个生理性状和形株的一个或多个生理性状和形态特征逐特征逐渐减退或减退或消失的消失的现象。象。2.引起菌种退化的原因：引起菌种退化的原因：3.基因突基因突变4.变异菌株性状分离异菌株性状分离5.连续传代代6.其他因素其他因素（一）微生物菌种的退化及原因菌种退化：指在（一）微生物菌种的退化及原因菌种退化：指在经过较长时间传经过较长时间传代保代保（二）防止菌种退化及退化（二）防止菌种退化及退化菌种的复壮菌种的复壮1.防止菌种退化的方法：防止菌种退化的方法：2.控制控制传代次数：尽量避免不必要的接种和代次数：尽量避免不必要的接种和传代，代，在在传代的代的时候尽量同候尽量同时移植移植较多斜面菌种；多斜面菌种；3.选择合适的培养条件：合适的培养条件：选择一个适合原种生一个适合原种生长的的条件可防止菌种的衰退；条件可防止菌种的衰退；4.利用不同利用不同类型的型的细胞胞进行行传代：特定的菌株采用代：特定的菌株采用特定的特定的细胞形式胞形式进行行传代；代；5.选择合适的保藏方法。合适的保藏方法。（二）防止菌种退化及退化（二）防止菌种退化及退化菌种的复壮防止菌种退化的方法：菌种的复壮防止菌种退化的方法：（二）防止菌种退化及退化（二）防止菌种退化及退化菌种的复壮菌种的复壮2.退化菌种的复壮：使退化的菌种重新回复原来的退化菌种的复壮：使退化的菌种重新回复原来的优良特征，叫做复壮。常用的方法是良特征，叫做复壮。常用的方法是对已退化的已退化的菌株用一定的培养条件菌株用一定的培养条件进行行单细胞的分离胞的分离纯化，化，从而限制退化菌株在数量上的从而限制退化菌株在数量上的优势。（二）防止菌种退化及退化（二）防止菌种退化及退化菌种的复壮退化菌种的复壮：使退化的菌种的复壮退化菌种的复壮：使退化的（三）菌种的保藏（三）菌种的保藏1.菌种保藏的意菌种保藏的意义2.菌种保藏的原理菌种保藏的原理3.菌种保藏的方法：菌种保藏的方法：4.斜面低温保藏法斜面低温保藏法5.石蜡油封保藏法石蜡油封保藏法6.砂土管保藏法砂土管保藏法7.冷冷冻干燥法干燥法8.超低温保藏法超低温保藏法（三）菌种的保藏菌种保藏的意（三）菌种的保藏菌种保藏的意义义冷冷冻干燥干燥设备冷冷冻冻干燥干燥设备设备液氮液氮设备液氮液氮设备设备发酵工酵工业微生物菌种的微生物菌