细胞迁移和侵袭实验技术课件

肿瘤细胞生物学实验室肿瘤细胞生物学实验室肿瘤细胞生物学实验室肿瘤细胞生物学实验室 张宁张宁张宁张宁PIPI组组组组体内实验：体内实验：皮下移植瘤模型皮下移植瘤模型原位移植瘤模型原位移植瘤模型肿瘤细胞运动肿瘤细胞运动体外实验体外实验肿瘤细胞运动肿瘤细胞运动常用研究方法常用研究方法TextTextinhereinhere侵袭实验侵袭实验侵袭实验侵袭实验趋化运动趋化运动趋化运动趋化运动划痕实验划痕实验划痕实验划痕实验实验原理实验原理细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。移的影响。划痕实验（伤口愈合实验，划痕实验（伤口愈合实验，ScratchAssay）1先用先用marker笔在笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔横线，大约每隔0.51cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过一道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线。条线。2.在孔中加入约在孔中加入约5105个细胞，具体数量因细胞种类不个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%；3.用用10m mltip枪头用力均匀地在培养皿中划痕，枪头用力均匀地在培养皿中划痕，PBS洗洗涤涤2次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。4放入放入375%CO2培养箱培养。每培养箱培养。每3h测量一次细胞测量一次细胞运动的距离，拍照运动的距离，拍照(具体时间依实验需要而定具体时间依实验需要而定)。5.数据处理：每个时间点的距离长度数据处理：每个时间点的距离长度-0时距离时距离=每个时间长每个时间长度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差，时间为横轴，度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差，时间为横轴，迁移距离为纵轴（单位迁移距离为纵轴（单位mm）作图，并比较初始）作图，并比较初始0时与实验结时与实验结束时实验组与对照组的照片。束时实验组与对照组的照片。1.在用在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。细胞，影响实验拍照结果。2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（2%）否则细胞增殖）否则细胞增殖就不能忽略。就不能忽略。3.按照按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。4.实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同的细胞要观察细胞的贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培的细胞要观察细胞的贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。养时间，保证培养终止时密度适当。实验原理实验原理 趋化运动是指细胞能够感受到外界化学物质的趋化运动是指细胞能够感受到外界化学物质的浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。趋化运动是一个非常保守的过程，对于生物体的生趋化运动是一个非常保守的过程，对于生物体的生存、生命的繁衍等具有重要的意义。存、生命的繁衍等具有重要的意义。趋化运动实验（趋化运动实验（ChemotaxisAssay）微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿细胞，中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计的。过一定孔径的滤膜而设计的。滤膜（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞滤膜（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。BoydenChamber装置装置1.在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的趋化因子置于趋化小室的下室，趋化因子置于趋化小室的下室，30m ml/孔，每个浓度加孔，每个浓度加3个个孔，其中只加孔，其中只加BM的孔为阴性对照；的孔为阴性对照；2.取对数生长期细胞，取对数生长期细胞，0.1%BM重悬细胞，调整细胞浓度为重悬细胞，调整细胞浓度为5105/ml；3.加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平，加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平，光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上拧紧拧紧;在上室中加入细胞，在上室中加入细胞，50m ml/孔，每个浓度加孔，每个浓度加3个孔；个孔；4.将趋化小室在将趋化小室在 37，5%CO2 的孵化箱中孵育的孵化箱中孵育3h；5.在膜的两端加上夹子，毛面在在膜的两端加上夹子，毛面在PBS 液面上蘸取，光面禁止液面上蘸取，光面禁止碰到液体。毛面在架子上摩擦，再蘸取碰到液体。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反复，反复3 次后次后再蘸取一次，晾干；再蘸取一次，晾干；6.固定固定,染色染色7.取载玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蜡，盖玻片封片；取载玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蜡，盖玻片封片；8.显微镜观察计数，每孔至少显微镜观察计数，每孔至少 3个随机视野，个随机视野，3个孔的数值个孔的数值取平均值取平均值;作柱状图，纵轴趋化指数或细胞数，横轴组别；作柱状图，纵轴趋化指数或细胞数，横轴组别；9.趋化指数趋化指数(ChemotaxisIndex)=随着趋化诱导因子的浓度梯随着趋化诱导因子的浓度梯度而迁移的细胞数目度而迁移的细胞数目/用培养基做对照的迁移细胞数目用培养基做对照的迁移细胞数目1.膜，胶垫，上下小室之间防止有气泡产生；膜，胶垫，上下小室之间防止有气泡产生；2.放膜时要对准位置，过多调整位置，易发生交叉污染。放膜时要对准位置，过多调整位置，易发生交叉污染。3.枪垂直，枪尖伸入孔中下大概枪垂直，枪尖伸入孔中下大概4/5处，迅速加样，不要迟疑，处，迅速加样，不要迟疑，打出液体的过程枪逐渐抬起，液体全部打出时枪尖离开液打出液体的过程枪逐渐抬起，液体全部打出时枪尖离开液面。面。4.洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。MatrigelInvassionAssayTranswell系统系统Transwell Transwell 小室小室0.4um孔径聚碳孔径聚碳酯膜的扫描电镜酯膜的扫描电镜 人工重构基底膜材料人工重构基底膜材料Matrigel，是一种细胞外基质，是一种细胞外基质，4时是液体，在时是液体，在37 会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连蛋白和蛋白和型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。构与天然基质膜结构极为相似。滤膜孔径一般为滤膜孔径一般为8 8m mm m，而且膜孔都被，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。的滤膜，这与体内情况较为相似。Transwell 电镜图片电镜图片1.1.无菌条件下无菌条件下 Matrigel 于冰浴融化，用于冰浴融化，用PBS（或（或DMEM only 培养基）培养基）稀释成稀释成1mg/ml 浓度，浓度，-20C 冻存备用；冻存备用；2.取出已稀释好的取出已稀释好的 Matrigel，冰浴融化，以，冰浴融化，以50ml 的体积铺于的体积铺于Tramwell 小室（小室（24孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），酸酯膜浸湿为最好），37C 放置放置lh，使，使Matrigel 聚合成凝胶（注意：聚合成凝胶（注意：加基质胶时最好将加基质胶时最好将24 孔板放置在冰盒上，确保胶完全覆盖孔底，不孔板放置在冰盒上，确保胶完全覆盖孔底，不要有气泡）；要有气泡）；3.每孔加入每孔加入 200m ml1640（或（或DMEM）培养基使胶重构；）培养基使胶重构；4.在在 Transwell下室中加入趋化因子或下室中加入趋化因子或10%FBS培养基培养基600m ml/孔；孔；5.在上室孔中准确加入细胞在上室孔中准确加入细胞 l105个个/孔，细胞悬液体积孔，细胞悬液体积200m ml，置于置于5%CO2培养箱于培养箱于37C培养培养24h（注意：细胞量和时间根注意：细胞量和时间根据实验条件摸索据实验条件摸索）；）；6.待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上未穿过膜的细胞；擦去膜上未穿过膜的细胞；Transwell小室小室上层培养液上层培养液细胞细胞基质胶基质胶下层培养液下层培养液细胞培养板细胞培养板Transwell侵袭实验侵袭实验示意图示意图7.4%中性甲醛固定中性甲醛固定10分钟，分钟，Giemsa染色染色10分钟，分钟，PBS洗洗涤涤3次，干燥，取下微孔滤膜，倒置显微镜下直接观察穿次，干燥，取下微孔滤膜，倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞过膜的细胞(200)；8.每张膜中央部分和周围部分各随机取每张膜中央部分和周围部分各随机取 3个视野，计数每个个视野，计数每个视野内的穿过视野内的穿过8m mm微孔的细胞数。微孔的细胞数。结束语当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的，所以不要放弃，坚持就是正确的。When You Do Your Best,Failure Is Great,So DonT Give Up,Stick To The End谢谢大家荣幸这一路，与你同行ItS An Honor To Walk With You All The Way演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日