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大家好大家好1掀起转染风暴掀起转染风暴产品专员培训产品专员培训2转染方法介绍：转染方法介绍：显微注射法显微注射法电穿孔法电穿孔法()颗粒传递法颗粒传递法（基因枪粒子轰击法）（基因枪粒子轰击法）磷酸钙法磷酸钙法阳离子脂质体法（，阳离子脂质体法（，）阳离子聚合物阳离子聚合物(梭华，凯基，梭华，凯基，)物理物理方法方法化学化学方法方法病毒介导法病毒介导法3 转染的应用：基因组功能研究：基因表达调控，蛋白功能，信号转导和药物筛选研究 建立细胞系：转基因细胞模型、永生性细胞株建立转基因动物模型基因治疗研究和应用蛋白功能和定位研究重组蛋白生产及蛋白药物研究4?DNA:highly anionic and hydrophilic macromoleculeNo ionic interaction+Cationic macromolecule+Cationic ReagentMembrane:anionic and hydrophobic-HeparanSulfateProteoglycanes5细胞转染难易比较 :.:,:.:,:.:体外转染体外转染6v 是法国一家专门致力于是法国一家专门致力于研发和销售转染试剂的生物研发和销售转染试剂的生物技术公司技术公司公司简介v 提供体内和体外转染产品，包括基因、寡核苷酸、及蛋白转染产品，可进行瞬时和稳定的转染及重组蛋白质制备。7第一部分第一部分 产品介绍产品介绍8 产品介绍产品介绍 9产品系列产品系列 转染转染体外转染体外转染体内转染体内转染体外转染体外转染10产品系列一产品系列一 转染:蛋白转染蛋白转染11转染应用：应用：细胞内定位研究细胞内定位研究蛋白水平的干扰研究蛋白水平的干扰研究抗体功能封闭的研究抗体功能封闭的研究疾病治疗的研究疾病治疗的研究替代免疫细胞化学在活细胞内检测替代免疫细胞化学在活细胞内检测蛋白转染蛋白转染12 转染难题 ,蛋白转染蛋白转染13技术原理技术原理PULSin:cationic amphiphilic-based formulation蛋白转染蛋白转染14操作步骤操作步骤21For24-wellplate:细胞融合度：70-80%稀释蛋白：1g of protein/100l Hepes1 1加4lPULSin2 2孵育15min3 3洗细胞，加900 l无血清培养基4 4 加protein/PULSin复合物345孵育4h5 5更换新鲜完全培养基6 6 分析蛋白活性或检测6蛋白转染蛋白转染15:.转染蛋白质转染蛋白质 蛋白转染蛋白转染16 转染单抗转染单抗():.抗体转染抗体转染17 转染多抗转染多抗():.抗体转染抗体转染 18 转染多肽转染多肽多肽转染多肽转染 Conditions:Delivery of Pep-A(Streptococcus TPE B epitope,),into HeLa cells.Complexes were formed with Pep-A(1 g,lissamine-rhodamine derivative,Sigma)and PULSin(4 l).Observation was carried out 16 h post-delivery.()，19 已转染的不同细胞类型已转染的不同细胞类型:蛋白转染蛋白转染20 已转染的细胞及转染效率已转染的细胞及转染效率蛋白转染蛋白转染21:蛋白抗体多肽列表蛋白抗体多肽列表蛋白转染蛋白转染22优势：优势：新新技术新新技术活细胞中进行转染活细胞中进行转染 高转染效率高转染效率 无细胞毒性无细胞毒性 即用型溶液即用型溶液 操作简单操作简单 优势优势蛋白转染蛋白转染23 的竞争对手的竞争对手蛋白转染蛋白转染 ()()()24产品系列二产品系列二体外转染:转染转染转染转染25选择、设计、合成双链化学合成质粒表达转染到靶细胞瞬时表达 化学合成，质粒表达稳定表达 质粒表达分析检测干扰作用蛋白水平:水平:实时定量，基因沉默实验设计基因沉默实验设计26介导基因沉默机制介导基因沉默机制 RISC Nuclear membrane 转染转染27实验操作实验操作 ().转染转染28反向操作反向操作操作操作 转染转染29反向转染基因沉默效率反向转染基因沉默效率反向转染仍能得到极高的基因沉默效率转染转染30 ()转染转染基因沉默效率基因沉默效率31基因沉默效率基因沉默效率 ()转染转染32细胞毒性细胞毒性()转染转染33成功转染的细胞系成功转染的细胞系 转染转染34原代细胞的高效沉默原代细胞的高效沉默(甘油醛磷酸脱氢酶)人原代肝实质细胞人原代纤维原细胞转染转染35优势优势低浓度低浓度（甚至级别）就能达到高效的基因沉默（甚至级别）就能达到高效的基因沉默在很多细胞系中，基因沉默效率可达到以上在很多细胞系中，基因沉默效率可达到以上在原代细胞中也能达到有效的基因沉默效率在原代细胞中也能达到有效的基因沉默效率无细胞毒性无细胞毒性不受血清和抗生素的影响不受血清和抗生素的影响操作简单操作简单价格便宜价格便宜在反向操作转染中的效率高在反向操作转染中的效率高转染转染36 转染竞争对手转染竞争对手 （）（）（）（）转染转染37 38 39 40与 基因沉默效率()41与 细胞毒性()42体内转染:产品系列三体内体内 转染转染43 :体内体内 转染转染44Efficiency/specificity+Virusin vivo-jetPEIgene size(kbp)3-30 400YesnoneImmune responseYes(L2 L3)noneLab requirement体内体内 转染转染 45 静脉 瘤内 脑室 腹膜 气管灌注 吸入 体内转染的路径和动物 体内体内 转染转染46体内转染的基因表达分布情况.活小鼠体内荧光素酶表活小鼠体内荧光素酶表达的荧光检测图象达的荧光检测图象（用（用 含含和和复合物的复合物的葡萄糖溶液尾部注射葡萄糖溶液尾部注射）.体内转染体内体内 转染转染47（白喉毒素基因）质粒与 复合物转入大鼠膀胱。,.,.(),转染对膀胱癌的治疗体内体内 转染转染48 复合物转染对人膀胱癌的治疗,.,.(),(),().(),().转染对膀胱癌的治疗体内体内 转染转染49活体小鼠尾静脉注射（小时后的荧光检测图）活体小鼠尾静脉注射（小时后的荧光检测图）,.,.()(),(),:共转染 与 复合物转染对荧光素酶肺部表达起明显的抑制作用。体内体内 转染转染50 .,()：体内基因沉默 .()()体内体内 转染转染51产品系列四产品系列四 :体外体外体外体外转染转染转染转染52转染过程体外体外体外体外转染转染转染转染1.提取质粒或寡核苷酸2.选择和培养细胞系3.转染4.瞬时转染5.稳定转染：抗性筛选6.检测外源基因细胞内表达的实验流程：外源基因细胞内表达的实验流程：53转染试剂+H3NO+ONH3CCH3H3CDOTMA(Lipofectin)DOTMA(Lipofectin)MonocationiclipidsPolycationiclipids+NONOHNHNH3H2NTransfectam Transfectam CationicpolymersPAMAM Dendrimer PAMAM Dendrimer OHONHONHOH2NNHRNHRNHRnPolylysine and derivativesPolylysine and derivativesNNNNNNNNNNH2NNH2N H2NH2NH2N H2NH2H2NH2NH2NH2NN H2012GenerationsNHNNHNHNNHNNHNHNHNNH3+NHNHNNHNHNNNHNH2NH+3HN+3HNNH3+NH3+NH3+Polyethylenimine(PEI)Polyethylenimine(PEI)体外体外体外体外转染转染转染转染54polyethylenimine(PEI)NH=-CH2-CH2-NH-=43 Daammonium groupsfor DNA condensationbufferingamine groupsbranched PEIlinear PEI1H+/amine3579pH0.5nnjetPEI体外体外体外体外转染转染转染转染55 体外体外体外体外转染转染转染转染NHHNOHnmHCl-H3C56jetPEI 1 l=7.5 nmoles of amine functionDNA1 g=3 nmoles of phosphate group =NP 57:实验操作 体外体外体外体外转染转染转染转染58,Same efficiency体外体外体外体外转染转染转染转染59 ()().6080%6080%4060%:转染效率体外体外体外体外转染转染转染转染60细胞特异性转染产品（巨噬细胞）（肝实质细胞）（人脐静脉内皮细胞）体外体外体外体外转染转染转染转染61价格优势（低）价格优势（低）实验操作简易实验操作简易与血清和抗生素兼容性好与血清和抗生素兼容性好稳定性好稳定性好(质子海绵假说）质子海绵假说）、毒性低、毒性低规格齐全，能满足不同客户需求规格齐全，能满足不同客户需求保质期长达一年保质期长达一年体外体外体外体外转染转染转染转染优势62 转染竞争对手转染竞争对手 ()()(),体外体外体外体外转染转染转染转染63 体外体外体外体外转染转染转染转染64 ()体外体外体外体外转染转染转染转染65 ()体外体外体外体外转染转染转染转染66 体外体外体外体外转染转染转染转染67第二部分第二部分产品推广产品推广68推广策略v 试用装策略v 全国技术讲座策略 v 转染小册子策略 v 重点客户策略v 新产品为切入点策略v 其他资料：成功转染细胞系、发表文献v 全程技术服务69一、寻找客户实验室：实验室：分子生物学实验室分子生物学实验室 细胞生物学实验室细胞生物学实验室 基因研究实验室基因研究实验室 动物研究实验室动物研究实验室 蛋白组学研究实验室蛋白组学研究实验室70二、了解客户了解客户实验情况：了解客户实验情况：正在使用的转染试剂：脂质类，正在使用的转染试剂：脂质类，,电转染电转染,转染、蛋白、寡核苷酸？体内、体外？转染、蛋白、寡核苷酸？体内、体外？转染的细胞系？转染的细胞系？瞬时转染或稳定转染？瞬时转染或稳定转染？转染的效率或基因沉默的效率？满意吗？转染的效率或基因沉默的效率？满意吗？检测方法？检测方法？71二、了解客户 估计客户或实验室用量：估计客户或实验室用量：询问实验室其他人的实验情况：询问实验室其他人的实验情况：72三、总结总结客户的资料，推荐相应的产品，突出我们产品的优势。计划下一客户的拜访 总结和计划总结和计划73谢谢谢谢！74
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