紫外可见分光光度法课件

紫外可见分光光度紫外可见分光光度法法概概 述述 基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称称吸光光度法吸光光度法，它包括比色法和分光光度法。，它包括比色法和分光光度法。紫外紫外-可见分光光度法是研究物质在紫外、可见光区可见分光光度法是研究物质在紫外、可见光区的的分子吸收光谱分子吸收光谱的分析方法。它属于分子光谱法的一种，的分析方法。它属于分子光谱法的一种，是利用某些物质的分子吸收是利用某些物质的分子吸收200800nm光谱区的辐射光谱区的辐射来进行分析测定的方法。来进行分析测定的方法。这种分子吸收光谱产生于这种分子吸收光谱产生于价电子价电子和分子轨道上的电和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于无机和有机物质的定子在电子能级间的跃迁，广泛用于无机和有机物质的定性、定量测定。性、定量测定。2024/7/162 当当一一束束太太阳阳光光照照射射某某一一溶溶液液时时，太太阳阳光光中中某某一一颜颜色色的的光光被被吸吸收收，其其互互补补色色光光透透过过溶溶液液，刺刺激激人人的的眼眼睛睛，使使人人感感觉觉到到它的颜色。它的颜色。溶液颜色与光吸收的关系溶液颜色与光吸收的关系可见光波长及其互补光可见光波长及其互补光实例：实例：1)高锰酸钾吸收高锰酸钾吸收绿光绿光显紫显紫 红色；红色；2)重铬酸钾吸收重铬酸钾吸收蓝光蓝光显黄显黄色；色；3)邻菲罗啉铁溶液吸收邻菲罗啉铁溶液吸收蓝蓝绿光绿光显红色。显红色。2024/7/163完全吸收完全吸收完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光光谱示意光谱示意表观现象示意表观现象示意复合光复合光2024/7/164 根根据据溶溶液液的的颜颜色色，可可以以估估计计该该溶溶液液吸吸收收的的光光的的波长。波长。/nm颜色颜色互补色互补色400-450紫黄绿450-480蓝蓝黄黄480-490绿蓝绿蓝橙橙490-500蓝绿蓝绿红红500-560绿绿红紫红紫560-580黄绿黄绿紫紫580-610黄黄蓝蓝610-650橙橙绿蓝绿蓝650-760红红蓝绿蓝绿2024/7/165分光光度法的发展过程分光光度法的发展过程 分光光度法在发展过程中先后经过了分光光度法在发展过程中先后经过了目视比色法，光电比色法目视比色法，光电比色法和分光光度法和分光光度法三个阶段。三个阶段。（1）目视比色法目视比色法是一种用眼睛辨别颜色深浅，以确定待测组分含是一种用眼睛辨别颜色深浅，以确定待测组分含量的方法。量的方法。（2）光电比色法光电比色法是使用光电比色计测量溶液吸光度并计算待测组是使用光电比色计测量溶液吸光度并计算待测组分含量。分含量。（3）分光光度法分光光度法是应用分光光度计，通过测定被测物质在特定波是应用分光光度计，通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度，对该物质进行定性、定量长处或一定波长范围内光的吸光度，对该物质进行定性、定量分析的方法。它包括紫外分光光度法、可见光分光光度法、红分析的方法。它包括紫外分光光度法、可见光分光光度法、红外分光光度法等。外分光光度法等。2024/7/166 测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度(即吸光即吸光度度A)，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条曲线，称为到一条曲线，称为吸收光谱曲线吸收光谱曲线(简称吸收曲线简称吸收曲线)。吸收光谱示意图吸收光谱示意图吸收曲线及常用术语吸收曲线及常用术语 2024/7/167 透过光的强度透过光的强度 It与入射光的强度与入射光的强度I0之比称为透光度，之比称为透光度，用用 T表示。表示。常用常用百分数百分数表示：表示：T=It/I0 为为了了表表示示物物质质对对光光的的吸吸收收程程度度，常常采采用用吸吸光光度度A这这一概念，即一概念，即透光度倒数的对数值。透光度倒数的对数值。A=lg（I0/It）=lg（1/T）=lg T 1.透光度透光度T 和吸光度和吸光度A 朗伯朗伯比耳定律比耳定律2024/7/1682.2.朗伯朗伯 比耳定律比耳定律 布格布格(BouguerBouguer)和朗伯和朗伯(Lambert)Lambert)先后于先后于17291729年和年和17601760年年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。A b 1852年比耳年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。之间也具有类似的关系。A c 二者的结合称为朗伯二者的结合称为朗伯比耳定律，其数学表达式为：比耳定律，其数学表达式为：A=b c 朗伯朗伯比耳定律比耳定律是吸光光度法的理论基础和定是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。量测定的依据。2024/7/169 A=b c 式中式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；吸光度；描述溶液对光的吸收程度；b：液层厚度液层厚度(光程长度光程长度)，通常以，通常以cm为单位；为单位；c：溶液的摩尔浓度，单位溶液的摩尔浓度，单位molL-1；：摩尔吸收系数，单位摩尔吸收系数，单位Lmol-1cm-1。（讲解（讲解78页例题）页例题）摩尔吸收系数越大表明该物质的摩尔吸收系数越大表明该物质的吸光能力越强吸光能力越强，用光度法测，用光度法测定该物质的定该物质的灵敏度越高灵敏度越高。105：超高灵敏；：超高灵敏；=(610）104：高灵敏；：高灵敏；10104 4。*选择性好选择性好：显色剂仅与被测离子发生显色反应。：显色剂仅与被测离子发生显色反应。*对照性好对照性好：显色剂在测定波长处无明显吸收显色剂在测定波长处无明显吸收,maxmax60 nm60 nm。*反应生成的有色化合物反应生成的有色化合物组成恒定，稳定组成恒定，稳定。*显色条件易于控制，显色条件易于控制，重现性好重现性好。反应条件的选择反应条件的选择2024/7/1631显色反应条件的选择显色反应条件的选择1.1.显色剂用量显色剂用量 吸吸光光度度A A与与显显色色剂剂用用量量C CR R的的关关系系会会出出现现如如图图所所示示的的几几种种情情况况。选选择择曲线变化平坦处。曲线变化平坦处。2.2.反应体系的酸度反应体系的酸度 在在相相同同实实验验条条件件下下，分分别别测测定定不不同同pHpH值值条条件件下下显显色色溶溶液液的的吸吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pHpH范围。范围。3.3.显色时间与温度显色时间与温度 实验确定。实验确定。4.4.溶剂溶剂 一般尽量采用水相测定一般尽量采用水相测定。吸光度与吸光度与pHpH的关系曲线的关系曲线2024/7/1632参比溶液的选择一般有一下几种情况：参比溶液的选择一般有一下几种情况：1.溶剂参比溶剂参比 若仅待测组分与显色剂的反应产物在测定波长处有若仅待测组分与显色剂的反应产物在测定波长处有吸收，而被测试液、显色剂及其他试剂均无吸收，则可用纯溶吸收，而被测试液、显色剂及其他试剂均无吸收，则可用纯溶剂作参比溶液。剂作参比溶液。2.试试剂剂参参比比 若若显显色色剂剂或或其其他他试试剂剂在在测测定定波波长长处处略略有有吸吸收收，而而试试液液本本身身无无吸吸收收，则则可可用用“试试剂剂空空白白”（不不加加被被测测试试样样的的试试剂剂溶溶液液）作参比溶液。作参比溶液。3.试试液液参参比比 若若待待测测试试液液本本身身在在测测定定波波长长处处有有吸吸收收，而而显显色色剂剂等等无无吸吸收收，可可用用“试试样样空空白白”（不不加加显显色色剂剂的的被被测测试试液液）作作参参比比溶溶液。液。4.其其它它参参比比 若若显显色色剂剂、试试液液中中其其他他组组分分在在测测定定波波长长处处有有吸吸收收，则则可可在在试试液液中中加加入入适适当当掩掩蔽蔽剂剂将将待待测测组组分分掩掩蔽蔽后后再再加加显显色色剂剂作作为为参比溶液。参比溶液。5.5.选择适当的参比溶液选择适当的参比溶液2024/7/16331.干扰干扰(1)与试剂生成有色配合物。如用钼蓝法测定硅时，与试剂生成有色配合物。如用钼蓝法测定硅时，磷也能生成磷钼蓝，使测定结果偏高。磷也能生成磷钼蓝，使测定结果偏高。(2)干扰离子本身有颜色。干扰离子本身有颜色。(3)与试剂反应，生成的配合物虽然无色，但要消耗与试剂反应，生成的配合物虽然无色，但要消耗大量显色剂，使被测离子的显色反应不完全。大量显色剂，使被测离子的显色反应不完全。(4)与被测离子结合成离解度小的另一种化合物。使与被测离子结合成离解度小的另一种化合物。使被测离子与显色剂不反应。被测离子与显色剂不反应。共存离子的干扰及消除方法共存离子的干扰及消除方法2024/7/1634（1 1）控制酸度提高反应的选择性，保证主反应进行完全，以避免）控制酸度提高反应的选择性，保证主反应进行完全，以避免干扰。干扰。（2 2）加入掩蔽剂）加入掩蔽剂 选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。（3 3）选择适当的参比溶液）选择适当的参比溶液（4 4）选择适当的波长）选择适当的波长（5 5）利用氧化还原反应改变干扰离子的价态，使干扰离子不与显利用氧化还原反应改变干扰离子的价态，使干扰离子不与显色剂反应色剂反应。例如用铬天菁例如用铬天菁S S光度法测定光度法测定AlAl3+3+时，加入抗坏血酸作时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将掩蔽剂将FeFe3+3+还原为还原为FeFe2+2+，消除消除FeFe3+3+的干扰。的干扰。（6 6）分离干扰离子）分离干扰离子（7 7）利用导数光谱、双波长等新技术）利用导数光谱、双波长等新技术干扰的消除方法干扰的消除方法2024/7/1635定量分析定量分析（1）标准曲线法（单组分分析）标准曲线法（单组分分析）配配制制一一系系列列的的标标准准溶溶液液，其其浓浓度度包包括括待待测测样样品品的的浓浓度度范范围围，在在干干扰扰少少的的吸吸收收峰峰波波长长处处，测测定定其其吸吸光光度度 A与与浓浓度度c的的标标准准曲曲线线，待待测测样样品品溶溶液液在在相相同同条条件件下下进进行行测测量量，根根据据测测得得的的吸吸光光度度 Ai值值，从标准曲线上即可查出相应的浓度从标准曲线上即可查出相应的浓度 Ci。CACiAi0 紫外可见光谱法的应用紫外可见光谱法的应用2024/7/1636（2）标准对照法（单组分分析）标准对照法（单组分分析）当当样样品品溶溶液液遵遵守守比比耳耳定定律律时时，可可在在同同样样测测量量条条件件下下测测量量标标准准溶溶液液及及待待测测样样品品溶溶液液，测测量量到到的的吸吸光光度度分分别别为为 A标标和和 A样样，根根据据比耳定律可得到：比耳定律可得到：式式中中：C标标是是已已知知的的，因因此此待待测测样样品品溶溶液液的的浓浓度度C样样可可计计算算出出来。来。这这种种方方法法的的误误差差比比标标准准曲曲线线法法要要大大些些，但但不不需需做做标标准准曲曲线线因因而要简便些。而要简便些。2024/7/1637（3）解联立方程法（多组分分析）解联立方程法（多组分分析）以以溶溶液液中中存存在在两两个个组组分分为为例例来来说说明明，可可在在两两个个波波长长 1及及 2处测量待测溶液的吸光度，设它们分别为处测量待测溶液的吸光度，设它们分别为 A1及及 A2，则：则：A1=x 1bcx+y 1bcy(在1处测得A1)A2=x 2bcx+y 2bcy(在2处测得A2)x 1,y 1,x 2,y 2由由x,y标标液液在在 1,2处分别测得处分别测得2024/7/1638（4）双波长分光光度法（多组分分析）双波长分光光度法（多组分分析）不不需需空空白白溶溶液液作作参参比比；但但需需要要两两个个单单色色器器获获得得两两束束单单色色光光(1 1和和2 2)；以以参参比比波波长长1 1处处的的吸吸光光度度A A11作作为为参参比比，来来消消除除干干扰扰。在在分分析析浑浑浊浊或或背背景景吸吸收收较较大大的的复复杂杂试试样样时时显显示示出出很很大大的的优优越越性性。灵灵敏敏度度、选选择择性性、测测量量精精密密度度等等方方面面都都比比单单波波长法有所提高。长法有所提高。AA A A22 A A11 (22 11)b cb c 两两波波长长处处测测得得的的吸吸光光度度差差值值AA与与待待测测组组分分浓浓度度成成正正比比。11和和22分别表示待测组分在分别表示待测组分在1 1和和2 2处的摩尔吸光系数。处的摩尔吸光系数。2024/7/1639选择波长组合选择波长组合1 1、2 2的基本要求是：的基本要求是：选定的波长选定的波长1 1和和2 2处干扰组分应具有相同吸光度，处干扰组分应具有相同吸光度，即：即：Ay y=A y y22 A y y11=0=0 故：故：Ax+yx+y=A x=(x=(x x22x x11)bcbcx x 此时：测得的吸光度差此时：测得的吸光度差A只与待测组分只与待测组分x x的浓度呈线性关系，而的浓度呈线性关系，而 与与干扰组分干扰组分y y无关。若无关。若x x为干扰组分，则也可用同样的方法测定为干扰组分，则也可用同样的方法测定y y组分。组分。可采用作图法选择符合上述两可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合个条件的波长组合。在选定的两个波长在选定的两个波长1 1和和2 2处待处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。测组分的吸光度应具有足够大的差值。2024/7/1640 原理原理 普普通通分分光光光光度度法法一一般般只只适适于于测测定定微微量量组组分分，当当待待测测组组分分含含量量较较高高时，将产生较大的误差。需采用示差分光光度法，简称为示差法。时，将产生较大的误差。需采用示差分光光度法，简称为示差法。采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。设：待测溶液浓度为设：待测溶液浓度为c cx x，标准溶液浓度，标准溶液浓度c cs s(c cs s c cx x)。则：。则：A Ax x=bcbcx x A As s=bcbcs s x x s s=bb(c cx xc cs s）=bbc c 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差差。示差法测得的吸光度与示差法测得的吸光度与cc呈直线关系。由标准曲线上查得相应呈直线关系。由标准曲线上查得相应的的c c值，则待测溶液浓度值，则待测溶液浓度c cx x：c cx x=c cs s+c c （5）示差法）示差法2024/7/1641示差法标尺扩展原理示差法标尺扩展原理：普通法：普通法：cs的的T=10%；cx的的T=5%示差法：示差法：cs做参比做参比,调调T=100%,则则 cxT=50%；标尺扩展标尺扩展10倍倍 如待测试样的透光度原是如待测试样的透光度原是7，用示差分光光度法测量，用示差分光光度法测量时将是时将是70。T/%Tr/%2024/7/1642（6 6）导数分光光度法）导数分光光度法 导数分光光度法在导数分光光度法在多组分同时测定多组分同时测定、浑浊样品分析浑浊样品分析、消除背景消除背景干扰干扰、加强光谱的精细结构加强光谱的精细结构以及以及复杂光谱的辨析复杂光谱的辨析等方面，显示了很等方面，显示了很大的优越性。大的优越性。利用吸光度利用吸光度(或透光度或透光度)对波长的导数曲线来进行分析：对波长的导数曲线来进行分析：0 0 e e-bcbc假定入射光强度假定入射光强度0 0 在整个波长范围内保持恒定：在整个波长范围内保持恒定：d dI I 0 0/d/d0 0则则：d dI I/d/d0 0 bcbc e e-bcbc d d/d/d 0 0 bcbc d d/d/d dI/d 0 bc d/d 一阶导数信号与试样浓度呈线性关系；一阶导数信号与试样浓度呈线性关系；2024/7/1643 测定灵敏度依赖于摩测定灵敏度依赖于摩尔吸光系数对波长的变化尔吸光系数对波长的变化率率d d/d/d。吸收曲线的。吸收曲线的拐点处拐点处d d/d/d最大，故最大，故其灵敏度最高其灵敏度最高(见图）。见图）。同理可以导出其二阶同理可以导出其二阶和三阶导数光谱（略）和三阶导数光谱（略）2024/7/1644 2.2.定性分析定性分析 原理：紫外原理：紫外-可见光谱鉴定有机化合物，通常是在相同的测定条件可见光谱鉴定有机化合物，通常是在相同的测定条件下，下，比较未知物与已知化合物的紫外比较未知物与已知化合物的紫外-可见吸收光谱图可见吸收光谱图，若两者的谱，若两者的谱图相同，则可知待测化合物与已知化合物具有相同的生色团物质。图相同，则可知待测化合物与已知化合物具有相同的生色团物质。利用紫外利用紫外-可见吸收光谱图可以：可见吸收光谱图可以：对未知样品进行鉴定对未知样品进行鉴定 对有机化合物的分子结构进行推断。对有机化合物的分子结构进行推断。对有机化合物的同分异构体进行推断。对有机化合物的同分异构体进行推断。用于纯度的检查。用于纯度的检查。2024/7/1645