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第五节第五节 蛋白质性质蛋白质性质1、蛋白质分子大小、蛋白质分子大小2、两性解离与蛋白质的等电点、两性解离与蛋白质的等电点3、蛋白质的胶体性质、蛋白质的胶体性质4、蛋白质的沉淀、蛋白质的沉淀5、蛋白质的变性、蛋白质的变性6、蛋白质的颜色反应、蛋白质的颜色反应1第三章蛋白质化学1、蛋白质分子大小、蛋白质分子大小v 60001 000 000v根据化学组成测定最低相对分子量根据化学组成测定最低相对分子量v渗透压法测定相对分子量渗透压法测定相对分子量v蛋白质的扩散和扩散系数蛋白质的扩散和扩散系数v沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量v凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量vSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量2第三章蛋白质化学渗透压法测定相对分子量渗透压法测定相对分子量渗透压法测定相对分子量渗透压法测定相对分子量3第三章蛋白质化学沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量制备型超速离心机制备型超速离心机制备型超速离心机制备型超速离心机4第三章蛋白质化学根据物质的沉降系数、质量、浮力不同，应用强大的根据物质的沉降系数、质量、浮力不同，应用强大的离心力使蛋白质沉降下来进而分离提纯、鉴定的方法。离心力使蛋白质沉降下来进而分离提纯、鉴定的方法。超离心法使用的仪器是高速离心机超离心法使用的仪器是高速离心机沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。s=v2x v=沉降速度（dx/dt）=离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）沉降系数的单位常用S超速离心法超速离心法F（离心力）4vr2/G(1/60)2G重力加速度 v=转速r=旋转半径5第三章蛋白质化学分分分分析型超速离心机析型超速离心机析型超速离心机析型超速离心机6第三章蛋白质化学凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量7第三章蛋白质化学2、两性解离与蛋白质的等电点、两性解离与蛋白质的等电点（常见解离基团常见解离基团）8第三章蛋白质化学v氨基酸侧链上的氨基酸侧链上的可解离基团可解离基团v（1）解离后带有正电荷的基团）解离后带有正电荷的基团赖氨酸残基的赖氨酸残基的氨基氨基;精氨酸残基上的精氨酸残基上的胍基胍基;组氨酸残基组氨酸残基上的上的咪唑基咪唑基v（2）解离后带有负电荷的基团）解离后带有负电荷的基团谷氨酸残基上的谷氨酸残基上的羧基羧基;天冬氨酸残基的天冬氨酸残基的羧基羧基另外还有其它的可解离基团另外还有其它的可解离基团:丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的羟基羟基,半光氨酸的半光氨酸的巯基巯基9第三章蛋白质化学 +H3NP COOH +H3NP COO-H2NP COO-阳离子阳离子pHpIP代表蛋白质代表蛋白质蛋白质在溶液中的解离蛋白质在溶液中的解离10第三章蛋白质化学蛋白质的等电点蛋白质的等电点v当蛋白质处于某一当蛋白质处于某一pHpH值溶液中时，蛋白质所值溶液中时，蛋白质所带的正负电荷相等，净电荷为带的正负电荷相等，净电荷为0 0，此时溶液的，此时溶液的pHpH值为值为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。v等电点是蛋白质的特征常数；各种蛋白质有等电点是蛋白质的特征常数；各种蛋白质有各自的等电点各自的等电点11第三章蛋白质化学3 3、蛋白质的胶体性质、蛋白质的胶体性质、蛋白质的胶体性质、蛋白质的胶体性质P299P299v蛋白质胶体溶液稳定的因素蛋白质胶体溶液稳定的因素1100nm，同种电荷同种电荷;水化层水化层(溶剂化层溶剂化层)v不能通过半透膜不能通过半透膜透析透析超过滤超过滤12第三章蛋白质化学13第三章蛋白质化学4 4、蛋白质的沉淀反应、蛋白质的沉淀反应、蛋白质的沉淀反应、蛋白质的沉淀反应P300P300v（1）盐析法：中性盐（硫酸铵，氯化钠等），）盐析法：中性盐（硫酸铵，氯化钠等），脱水化层。脱水化层。v（2）有机溶剂沉淀法：甲醇、已醇、丙酮等，）有机溶剂沉淀法：甲醇、已醇、丙酮等，脱水化层。脱水化层。14第三章蛋白质化学v（3）重金属盐沉淀法）重金属盐沉淀法：Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+不不溶性盐沉淀溶性盐沉淀v(4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸三氯乙酸能沉淀能沉淀生物碱，称生物碱试剂生物碱，称生物碱试剂v(5)加热变性沉淀法加热变性沉淀法15第三章蛋白质化学5、蛋白质的变性（、蛋白质的变性（denaturation）(P233)(P233)v(1)概念概念天然蛋白质分子受到某些物理因素如热、紫外线天然蛋白质分子受到某些物理因素如热、紫外线等或化学因素如有机溶剂、脲、胍、酸、碱等的等或化学因素如有机溶剂、脲、胍、酸、碱等的影响时，生物活性丧失，溶解度降低，不对性增影响时，生物活性丧失，溶解度降低，不对性增高以及其他的理化常数发生改变，这种过程称为高以及其他的理化常数发生改变，这种过程称为蛋白质的变性蛋白质的变性实质：次级键被破坏，一级结构保持完好。实质：次级键被破坏，一级结构保持完好。16第三章蛋白质化学（2）变性的表现）变性的表现v生物活性丧失：酶、激素、毒素等生物活性丧失：酶、激素、毒素等v一些侧链基团暴露一些侧链基团暴露v一些物理化学性质的改变：溶解度降低，分子形一些物理化学性质的改变：溶解度降低，分子形状改变，不对称程度增高，粘度增加、扩散系数降状改变，不对称程度增高，粘度增加、扩散系数降低。低。v生物化学性质的改变生物化学性质的改变v我国化学家吴宪我国化学家吴宪20世纪世纪30年代提出变性学说年代提出变性学说17第三章蛋白质化学（3）蛋白质变性的理化因素：）蛋白质变性的理化因素：物理因素物理因素：加热、激烈振荡、超声波、加热、激烈振荡、超声波、-射线、紫外线等；射线、紫外线等；化学因素：化学因素：酸、碱、酸、碱、乙醇、丙酮等有机溶剂、尿素、盐乙醇、丙酮等有机溶剂、尿素、盐酸胍、某些去垢剂酸胍、某些去垢剂(SDS)等等18第三章蛋白质化学（4）蛋白质的复性）蛋白质的复性v当变性因素除去后，变性蛋白质又可重新回当变性因素除去后，变性蛋白质又可重新回复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性。复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性。19第三章蛋白质化学反应名称反应名称试试 剂剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团有有此此反反应应的的蛋蛋白白质质或或氨氨基酸基酸双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键所有蛋白质米伦反应HgNO3、Hg(NO3)2及 HNO3混合物红色Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色Trp坂口反应(Sakaguchi反应)-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基-氨基酸20第三章蛋白质化学第第6节节 蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化v1、一般原则、一般原则v前处理（前处理（pretreatment）把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，保持天然状态。保持天然状态。v粗分级分离（粗分级分离（rough fractionation）将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。v细分级分离（细分级分离（fine fractionation）：）：样品的纯化样品的纯化。21第三章蛋白质化学2、蛋白质的分离纯化方法、蛋白质的分离纯化方法v分子大小分子大小v溶解度溶解度;v电荷电荷;v吸附性质吸附性质;v对配体分子的生物学亲和力对配体分子的生物学亲和力22第三章蛋白质化学2.1根据分子大小不同的纯化方法根据分子大小不同的纯化方法v（1)透析和超过滤透析和超过滤v（2)密度梯度离心密度梯度离心v（3)凝胶过滤法凝胶过滤法 23第三章蛋白质化学透析透析24第三章蛋白质化学超过滤超过滤25第三章蛋白质化学2）密度梯度离心）密度梯度离心26第三章蛋白质化学根据物质的沉降系数、质量、浮力不同，应用强大的离心力使蛋白质沉降下来进而分离提纯、鉴定的方法。超离心法使用的仪器是高速离心机沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。s=v2x v=沉降速度（dx/dt）=离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）沉降系数的单位常用S（6）超速离心法超速离心法F（离心力）4vr2/G(1/60)2G重力加速度 v=转速r=旋转半径27第三章蛋白质化学（3）凝胶过滤凝胶过滤v凝胶过滤又称为凝胶过滤层析或分子排阻层凝胶过滤又称为凝胶过滤层析或分子排阻层析，是根据分子大小分离蛋白质混合物的最析，是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。有效方法之一。v凝胶过滤所用的介质是凝胶过滤所用的介质是凝胶珠或称凝胶颗粒凝胶珠或称凝胶颗粒，其内部是其内部是多孔的网状结构多孔的网状结构。28第三章蛋白质化学v当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移阻在凝胶珠之外随溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。自由出入凝胶珠的内外。v这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。脱出来。29第三章蛋白质化学30第三章蛋白质化学凝胶过滤法凝胶过滤法图示图示31第三章蛋白质化学2.2利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法v（1)等电点沉淀和等电点沉淀和PH控制控制v（2)蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析v（3)有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法v（4)温度对蛋白质溶解度的影响温度对蛋白质溶解度的影响32第三章蛋白质化学33第三章蛋白质化学2.3根据电荷不同的纯化方法根据电荷不同的纯化方法v2.3.1 电泳电泳:v2.3.2 离子交换层析离子交换层析34第三章蛋白质化学v(1)(1)概念概念v所所谓谓电电泳泳是是指指带带粒粒子子在在电电场场中中向向与与其其电电性性相相反的的电极移动的现象。反的的电极移动的现象。v电电泳泳技技术术可可用用于于氨氨基基酸酸、肽肽、蛋蛋白白质质、核核苷苷酸和核酸酸和核酸等生物分子的分离分析和制备。等生物分子的分离分析和制备。v带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中的的泳泳动动速速度度主主要要决决定定于于它它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。35第三章蛋白质化学v(2)(2)原理原理v颗颗粒粒在在电电场场中中发发生生泳泳动动时时，受受到到两两种种方方向向相相反反的的力力的作用：的作用：vF F（电场力）电场力）=qEqE(qUqU/S)/S)；F Ff f(摩擦力摩擦力)=)=fvfv其中其中q=q=颗粒所带的电量；颗粒所带的电量；E=E=电场强度或电势梯度电场强度或电势梯度=U/SU/S；U=U=两电极间的电势差（以伏特表示）；两电极间的电势差（以伏特表示）；S=S=两电极之间的距离（以厘米表示）；两电极之间的距离（以厘米表示）；f=f=摩擦系数（与颗粒的形状，大小和介质的粘度有关）摩擦系数（与颗粒的形状，大小和介质的粘度有关）v=v=颗粒泳动速度（以厘米颗粒泳动速度（以厘米/秒表示）。秒表示）。36第三章蛋白质化学+-+37第三章蛋白质化学v当颗粒以恒稳速度移动时，当颗粒以恒稳速度移动时，v则则F FF Ff f=0=0，v因此因此qEqE=fv=fv，v即即v/E=q/fv/E=q/fv=v/E=v/Ev在在一一定定的的介介质质中中对对某某一一种种蛋蛋白白质质来来说说，q/fq/f是是一一个个定定值值，因因而而v/Ev/E也也是是定定值值，它它被被称称为为迁迁移移率率或或泳泳动动度度：=v/E=v/E，其单位是厘米其单位是厘米2 2伏特伏特1 1秒秒1 1。38第三章蛋白质化学v(3)(3)电泳的类型电泳的类型v自由电泳或称移动界面电泳，自由电泳或称移动界面电泳，v区区带带电电泳泳,区区带带电电泳泳按按其其支支持持介介质质的的物物理理性性状不同可以分为：状不同可以分为：v滤滤纸纸电电泳泳和和薄薄膜膜电电泳泳（醋醋酸酸纤纤维维薄薄膜膜电电泳泳和和聚酰胺薄膜电泳等）；聚酰胺薄膜电泳等）；39第三章蛋白质化学v粉粉末末电电泳泳，支支持持介介质质是是淀淀粉粉、纤纤维维素素粉粉或或硅硅胶胶粉粉等等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板；粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板；v细细丝丝电电泳泳，如如尼尼龙龙丝丝和和其其他他人人造造丝丝电电泳泳，这这是是一一类类微量电泳；微量电泳；v凝凝胶胶电电泳泳，最最常常用用的的支支持持介介质质有有聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺和和琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶，凝凝胶胶可可以以制制作作成成平平板板或或柱柱子子，前前者者适适于于分分离蛋白质和寡核苷酸，后者适于分离核酸。离蛋白质和寡核苷酸，后者适于分离核酸。40第三章蛋白质化学v双向电泳双向电泳：v氨氨基基酸酸混混合合物物特特别别是是寡寡核核苷苷酸酸混混合合物物一一次次电电泳泳往往往往不不能能完完全全分分开开，在在这这种种情情况况下下可可以以将将第第一一次次电电泳泳分分开开的的斑斑点点通通过过支支持持介介质质间间的的接接触触吸吸印印转转移移到到第第二二个个支支持持介介质质上上，旋旋转转90900 0，进行第二次电泳，这种方法称为双向电泳。进行第二次电泳，这种方法称为双向电泳。41第三章蛋白质化学v盘状电泳盘状电泳v以以聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶为为支支持持物物，一一般般制制成成凝凝胶胶柱柱，凝凝胶胶术术由由相相连连的的两两节节凝凝胶胶（小小节节浓浓缩缩胶胶和和大大节节分分离离胶胶）组组成成，这这两两节节凝凝胶胶的的孔孔径径大大小小、缓缓冲冲液液离离子子成成分分和和离子强度、离子强度、pHpH以及电场强度都是不同的以及电场强度都是不同的.v在盘状电泳过程中有三种物理效应：在盘状电泳过程中有三种物理效应：样品的样品的浓缩效应浓缩效应；凝凝胶胶对对分分子子的的筛筛选选效效应应（颗颗粒粒小小的的移移动动快快，颗颗粒粒大大的的移移动慢）；动慢）；一一般般电电泳泳分分离离的的电电荷荷效效应应。由由于于这这三三种种物物理理效效应应，使使样样品分离效果好，分辨率高。品分离效果好，分辨率高。42第三章蛋白质化学v等电聚焦或电聚焦等电聚焦或电聚焦，v等电聚焦时，蛋白质混合物的分离是在具有等电聚焦时，蛋白质混合物的分离是在具有pH梯度梯度的蔗糖介质中进行的。在电场内，每种蛋白质成分的蔗糖介质中进行的。在电场内，每种蛋白质成分将移向并将移向并“聚焦聚焦”（停留）在等于其等电点的（停留）在等于其等电点的pH梯梯度度处，形成一个很窄的区带。处，形成一个很窄的区带。v凝胶等电聚焦是用聚丙烯酰胺凝胶代替原来的蔗糖凝胶等电聚焦是用聚丙烯酰胺凝胶代替原来的蔗糖溶液，由于介质固体化，操作方便，分离时间缩短，溶液，由于介质固体化，操作方便，分离时间缩短，此法适用于蛋白质的微量分析。此法适用于蛋白质的微量分析。43第三章蛋白质化学2.3.2 离子交换层析离子交换层析44第三章蛋白质化学45第三章蛋白质化学2.4利用选择性吸附的纯化方法利用选择性吸附的纯化方法v吸附剂吸附剂活性炭活性炭;氧化铝氧化铝;硅胶硅胶v羟磷灰石层析羟磷灰石层析:分离蛋白质和核酸分离蛋白质和核酸v疏水作用层析疏水作用层析:疏水疏水AA数量不同数量不同46第三章蛋白质化学2.5 亲和层析亲和层析v亲和层析可用于下列生物体系：亲和层析可用于下列生物体系：v酶：底物、抑制剂、辅酶酶：底物、抑制剂、辅酶抗体：抗原、病毒、细胞抗体：抗原、病毒、细胞外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体、外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体、细胞核酸：互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶细胞核酸：互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合蛋白、结合蛋白激素及维生素：受体、载体蛋白激素及维生素：受体、载体蛋白细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素47第三章蛋白质化学48第三章蛋白质化学49第三章蛋白质化学3、蛋白质的含量测定与纯度鉴定、蛋白质的含量测定与纯度鉴定v3.1、蛋白质含量的测定、蛋白质含量的测定凯氏定氮法凯氏定氮法;双缩脲法双缩脲法;Lowry法法(BCA法法);染料结合法（考马斯亮兰法，染料结合法（考马斯亮兰法，Bradfordi法）法）紫外吸收法紫外吸收法;胶体金测定法胶体金测定法50第三章蛋白质化学3.2蛋白质纯度鉴定蛋白质纯度鉴定v电泳电泳;v沉降分析沉降分析;v溶解度分析溶解度分析;vN-末端分析末端分析51第三章蛋白质化学52第三章蛋白质化学
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