植物细胞的脱分化脱分化课件

第第11章章植物组织培养植物组织培养第11章植物组织培养1 提纲提纲植物组培的研究进展植物组培的研究进展1.1.植物组织培养的理论基础植物组织培养的理论基础 1.1 1.1植物的无性繁殖植物的无性繁殖 1.2 1.2植物细胞全能性理论植物细胞全能性理论 1.3 1.3植物细胞的脱分化与再分化植物细胞的脱分化与再分化2.2.植物组织培养植物组织培养 2.1 2.1实验材料的清洗和消毒实验材料的清洗和消毒 2.2 2.2培养基培养基 2.3 2.3接种接种 2.4 2.4种质保存种质保存 2.5 2.5植物细胞的大规模培养技术植物细胞的大规模培养技术 思考题思考题 组培问题组培问题提纲植物组培的研究进展2植物组织培养发展简史植物组织培养发展简史1 1、萌芽阶段萌芽阶段：(从从2020世纪初到世纪初到3030年代中）年代中）1838-1839 1838-1839年，德国科学家年，德国科学家Schleide Schleide 和和SchwannSchwann发表了细胞学发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。说，奠定了组织培养的理论基础。19021902年，德国植物学家年，德国植物学家HaberlandtHaberlandt 根据细胞学说，提出植物根据细胞学说，提出植物细胞全能性（细胞全能性（totipotencytotipotency）理论。）理论。19041904年，年，HanningHanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。19221922年，年，Knudson Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。采用胚培养法获得大量兰花幼苗。克服其种克服其种子发芽困难的问题。子发芽困难的问题。玉米成熟胚的培养玉米成熟胚的培养植物组织培养发展简史1、萌芽阶段：(从20世纪初到30年代中3Haberlandt：观点：观点：贡献：贡献：提出细胞全能性提出细胞全能性首次进行离体细胞培养首次进行离体细胞培养高等植物的组织和器官可高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞以分割成单个细胞Haberlandt：观点：贡献：提出细胞全能性首次进行离体419341934年，美国植物生理学家年，美国植物生理学家White White 用番茄根尖建立起第一个活跃用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。2 2、奠基阶段奠基阶段（从（从2020世纪世纪3030年代末到年代末到5050年代中）年代中）1934年：年：Gautherete培养山毛杨、黑杨形成层组织产生了培养山毛杨、黑杨形成层组织产生了Callus1937年：年：White发现发现3种种B族维生素和族维生素和IAA对植物生长有用对植物生长有用1939年：年：Gautherete培养胡萝卜根小外植体成功培养胡萝卜根小外植体成功1939年：年：White培养烟草种间杂种幼茎切段原形成层成功培养烟草种间杂种幼茎切段原形成层成功1934年，美国植物生理学家White用番茄根尖建立起第一5组织培养的奠基人组织培养的奠基人-White组织培养的奠基人-White63、快速发展和应用阶段快速发展和应用阶段（从（从20世纪世纪50年代末至今）年代末至今）l 1958 1958年，英国科学家年，英国科学家Steward Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体胚状体并分化为完整的小植株。并分化为完整的小植株。这是这是第一次实现人工体细胞胚培养，是植物组织培养的第一第一次实现人工体细胞胚培养，是植物组织培养的第一个突破。个突破。l 1960 1960年英国学者年英国学者CockingCocking用用酶法分离原生质体成功酶法分离原生质体成功。这是。这是植植物组织培养的第二个突破。物组织培养的第二个突破。l 19621962年，年，Murashinge Murashinge 和和Skoog Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的被广泛使用的MSMS培养基培养基。l 1964-1966 1964-1966年，印度科学家年，印度科学家Guha Guha 和和Maheswari Maheswari 在曼陀罗花在曼陀罗花药培养中药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株首次由花粉诱导得到了单倍体植株。l19721972年，年，Carlson Carlson 通过两个种的烟草通过两个种的烟草原生质体融合原生质体融合培养，获培养，获得了得了第一个体细胞杂交的杂种植株第一个体细胞杂交的杂种植株。3、快速发展和应用阶段（从20世纪50年代末至今）19587野胡萝卜的胚状体野胡萝卜的胚状体原生质体原生质体野胡萝卜的胚状体原生质体8单倍体育种单倍体育种单倍体育种9原生质体融合原生质体融合原生质体融合10第第11章章植物组织培养植物组织培养11.1植物组织培养的理论基础植物组织培养的理论基础11.1.1植物的无性繁殖植物的无性繁殖11.1.2植物细胞全能性理论植物细胞全能性理论11.1.3植物细胞的脱分化与再分化植物细胞的脱分化与再分化11.2植物组织培养的过程植物组织培养的过程11.2.1植物材料的清洗与消毒植物材料的清洗与消毒11.2.2培养基培养基11.2.3接种接种11.2.4种质保存种质保存11.2.5植物组织和细胞的大规模培养植物组织和细胞的大规模培养第11章植物组织培养11.1植物组织培养的理论基础1111.1植物组织培养的理论基础植物组织培养的理论基础植物组织培养（植物组织培养（Tissueculture）是指用是指用无菌无菌方法使植物体的离体方法使植物体的离体（invitro)器官、组织和细胞在器官、组织和细胞在人为提供的条件人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（称之为离体培养（Invitroculture）或试管）或试管培养。培养。器官（器官（organ)：根、茎、叶、花、果实、种子：根、茎、叶、花、果实、种子组织（组织（tissue)：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等11.1植物组织培养的理论基础植物组织培养（Tissuec1211.1.1植物的无性繁殖植物的无性繁殖一、有性生殖一、有性生殖1、有性生殖是生物界中最普遍的一种生殖、有性生殖是生物界中最普遍的一种生殖方式。它是指两个方式。它是指两个性细胞性细胞两两结合形成合两两结合形成合子，进而形成新的个体。子，进而形成新的个体。性细胞是通过减数分性细胞是通过减数分裂产生的。裂产生的。2、优点：其后代具有了两个亲本的遗传物、优点：其后代具有了两个亲本的遗传物质，具有更大的生活力和变异性。质，具有更大的生活力和变异性。11.1.1植物的无性繁殖一、有性生殖13二、无性生殖二、无性生殖无性生殖是不经生殖细胞的两两结合，由母无性生殖是不经生殖细胞的两两结合，由母体直接产生新个体的方式。从本质上讲，是体直接产生新个体的方式。从本质上讲，是由由体细胞体细胞进行的繁殖就是无性生殖。进行的繁殖就是无性生殖。植物无性生殖的方式主要是植物无性生殖的方式主要是营养生殖营养生殖-由植物营养器官（根、茎、叶）的一部分，由植物营养器官（根、茎、叶）的一部分，在与母体脱落后，发育成一个新的个体。在与母体脱落后，发育成一个新的个体。如马铃薯的块茎、蓟的根、秋海棠的叶如马铃薯的块茎、蓟的根、秋海棠的叶二、无性生殖无性生殖是不经生殖细胞的两两结合，由母体直14营养生殖甘薯甘薯 马铃薯马铃薯营养生殖甘薯马铃薯15营养生殖用腋芽來繁殖的甘蔗用腋芽來繁殖的甘蔗营养生殖用腋芽來繁殖的甘蔗16营养生殖落地生根吊兰大蒜营养生殖落地生根吊大蒜17summarysummary植物中常常植物中常常有性繁殖有性繁殖和和无性繁殖无性繁殖共共存存,在有性繁殖受到破坏的时候在有性繁殖受到破坏的时候(花花被破坏被破坏)通常会选择无性繁殖通常会选择无性繁殖.有性繁殖使个体的基因发生变异有性繁殖使个体的基因发生变异,能更好的适应环境能更好的适应环境,无性繁殖往往花费较少的能量无性繁殖往往花费较少的能量,且且成功机会高。成功机会高。summary植物中常常有性繁殖和无性繁殖共存,在有性繁殖受1811.1.2植物细胞全能性理论植物细胞全能性理论定义：定义：1902年由年由Haberlandt提出，提出，即植物体细胞在即植物体细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的能力。株的能力。20世纪世纪80年代：年代：每一个植物细胞具有该植物的全部遗每一个植物细胞具有该植物的全部遗传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型细胞，形成不同息，分化出植物有机体所有不同类型细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。11.1.2植物细胞全能性理论定义：1902年由Haber19从一个细胞发育成一个植株从一个细胞发育成一个植株从一个细胞发育成一个植株20离体细胞离体细胞具有生命的特征属性，在全能性的基具有生命的特征属性，在全能性的基础上，提供合适的营养和环境条件，离体细胞础上，提供合适的营养和环境条件，离体细胞经历经历脱分化脱分化（dedifferentiation）和）和再分化再分化（redifferentiation）过程，可形成）过程，可形成再生植物再生植物。植物细胞全能性理论是植物植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论组织培养的核心理论离体细胞具有生命的特征属性，在全能性的基础上，提供合适的营养2111.1.3植物细胞的脱分化与再分化植物细胞的脱分化与再分化1、细胞分化、细胞分化（cellulardifferentiation）。含义：由一个或一种细胞增殖产生的后代，含义：由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态结构和生理功能上发生稳定性的差异在形态结构和生理功能上发生稳定性的差异的过程。的过程。随着分化发育的进程，细胞逐渐丧失其分化随着分化发育的进程，细胞逐渐丧失其分化潜能。从潜能。从全能全能性到性到多能多能性，再到性，再到单能单能性，最性，最后后失去分化潜能失去分化潜能成为成为成熟定型成熟定型的细胞。的细胞。11.1.3植物细胞的脱分化与再分化1、细胞分化（cell22植物细胞的分化植物细胞的分化23细胞分化细胞分化是是组织分化组织分化和和器官分化器官分化的基的基础础，是离体培养再分化和植株再生得以实现是离体培养再分化和植株再生得以实现的基础。的基础。细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是离体培养再分化和植株再242、植物细胞的脱分化、植物细胞的脱分化脱分化：脱分化：由由高度分化高度分化的植物器官、组织或细胞在的植物器官、组织或细胞在一定条件下，一定条件下，重新重新获得分裂能力，产生获得分裂能力，产生愈伤愈伤组织组织的过程，又称的过程，又称去分化去分化。或者说，离体培养条件下，一个或者说，离体培养条件下，一个已分化已分化的细胞的细胞回回复复到原始到原始无分化无分化状态或状态或分生分生组织细胞状态或组织细胞状态或胚性胚性细胞细胞的状态的过程。的状态的过程。2、植物细胞的脱分化脱分化：由高度分化的植物器官、组织25细胞全能性细胞全能性脱分化脱分化个体再生个体再生再分化再分化细胞分裂细胞分裂细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现再分化是细胞全能性表达的最终体现。细胞全能性脱分化个体再生再分化细胞分裂细胞全能性的表达是通过26愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导愈伤组织：愈伤组织：脱分化后脱分化后的细胞，经过细胞的细胞，经过细胞分裂分裂，产，产生生无组织结构无组织结构、无明显极性无明显极性的、的、松散的细胞团松散的细胞团。愈伤组织的诱导是组培的第一步和关键步骤。愈伤组织的诱导是组培的第一步和关键步骤。外植体外植体（静止细胞）（静止细胞）培养基培养基诱导诱导愈伤组织愈伤组织(分裂细胞分裂细胞)活化活化细胞细胞愈伤组织的诱导愈伤组织：脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无27愈伤组织的种类愈伤组织的种类:分为：分为：胚性胚性愈伤组织愈伤组织（Embryoneniccallus）和和非胚性非胚性愈伤组织。愈伤组织。胚性愈伤组织：能形成体细胞胚的愈伤组织胚性愈伤组织：能形成体细胞胚的愈伤组织。质地较坚实，颜色有乳白色或黄色，表面具球形颗粒，其生长缓慢；质地较坚实，颜色有乳白色或黄色，表面具球形颗粒，其生长缓慢；从细胞学来看，胚性愈伤组织由等直径细胞组成，细胞较小，原生质从细胞学来看，胚性愈伤组织由等直径细胞组成，细胞较小，原生质浓厚，无液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性强。浓厚，无液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性强。非胚性愈伤组织：不能分化形成体细胞胚。非胚性愈伤组织：不能分化形成体细胞胚。资料资料愈伤组织的种类:分为：胚性愈伤组织（Embryonenic28黄瓜子房组织经脱分化形成胚性愈伤组织黄瓜子房组织经脱分化形成胚性愈伤组织黄瓜子房组织经脱分化形成胚性愈伤组织29愈伤组织愈伤组织（callus）培养）培养（）、愈伤组织的形成（）、愈伤组织的形成在细胞脱分化过程中，大多数情况下在细胞脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。愈伤组织的细胞往往是形成愈伤组织。愈伤组织的细胞往往是异质异质性的，性的，无明显极性无明显极性，其形成过程可，其形成过程可分为分为诱导期、分裂期和分化期诱导期、分裂期和分化期。愈伤组织（callus）培养（）、愈伤组织的形成30形成过程（三个时期）形成过程（三个时期）u诱导期（起动期）：诱导期（起动期）：是细胞准备分裂的时期。细胞大小几是细胞准备分裂的时期。细胞大小几乎不变，内部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。乎不变，内部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。u分裂期：分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。在原培养细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。在原培养基上，细胞必分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分基上，细胞必分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分裂，维持不分化状态。裂，维持不分化状态。u分化期：分化期：细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。能各异的细胞。形成过程（三个时期）诱导期（起动期）：是细胞准备分裂的时期。31愈伤组织形态发生愈伤组织形态发生（1）过程：）过程：外层外层细胞分裂，逐渐减慢并停止；细胞分裂，逐渐减慢并停止；内部内部较深处的细胞开始分裂，而且分裂方向也较深处的细胞开始分裂，而且分裂方向也发生改变，形成发生改变，形成微管化组织和瘤状结构。微管化组织和瘤状结构。（2）形态发生方式：器官发生和体细胞胚胎）形态发生方式：器官发生和体细胞胚胎发生。发生。愈伤组织形态发生（1）过程：外层细胞分裂，逐渐减慢并停323、细胞的再分化与器官发生、细胞的再分化与器官发生细胞的再分化（细胞的再分化（redifferentiation)是脱分化后的分生细胞（是脱分化后的分生细胞（愈伤愈伤组织）在一定组织）在一定条件下，条件下，重新分化重新分化为各种类型的细胞，并进为各种类型的细胞，并进一步发育成一步发育成完整植株完整植株。3、细胞的再分化与器官发生细胞的再分化（redifferen33高等植物细胞脱分化和再分化示意图高等植物细胞脱分化和再分化示意图由愈伤组织再分化形成再生植株，可经过由愈伤组织再分化形成再生植株，可经过器官发生器官发生和和胚状体发生胚状体发生两条途径。两条途径。成熟细胞成熟细胞分生细胞分生细胞愈伤组织愈伤组织器器官官发发生生胚胚状状体体发发生生成熟细胞成熟细胞脱分化脱分化分裂分裂再分化再分化高等植物细胞脱分化和再分化示意图由愈伤组织再分化形成再生植株34植物细胞的脱分化脱分化课件35器官发生器官发生植物的器官发生是指培养条件下的植物的器官发生是指培养条件下的愈伤愈伤组组织（组织或细胞团）分化形成织（组织或细胞团）分化形成不定根不定根（adventitiousroots）或）或不定芽不定芽（adventitiousshoots）等）等器官器官，再进一，再进一步发育成完整植株的过程。步发育成完整植株的过程。器官发生植物的器官发生是指培养条件下的愈伤组织（组织或细胞团36通过通过器官发生形成再生植株器官发生形成再生植株有三种方式：有三种方式：第一种方式是第一种方式是先芽后根先芽后根(芽根在不同培养基芽根在不同培养基上诱导上诱导)；第二种方式为第二种方式为先根后芽先根后芽(芽根在不同培养基芽根在不同培养基上诱导上诱导)；第三种方式是在愈伤组织的第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成不同部位形成芽和根芽和根，再通过，再通过维管组织维管组织的联系形成完整的联系形成完整植株。植株。通过器官发生形成再生植株有三种方式：第一种方式是先37胚状体发生胚状体发生胚状体胚状体：在植物细胞、组织或器官体外培养在植物细胞、组织或器官体外培养过程中，由一个或一些过程中，由一个或一些体细胞体细胞经过胚胎发生经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。可进一步发育成植株。也叫可进一步发育成植株。也叫体细胞胚。体细胞胚。区别于自然发生的区别于自然发生的珠心胚珠心胚及其他通过无融合及其他通过无融合生殖和由生殖和由合子胚合子胚分裂产生的胚分裂产生的胚。合子胚：由植物的雌雄配子融合合子胚：由植物的雌雄配子融合形成的合子继而发育形成的胚形成的合子继而发育形成的胚胚状体发生胚状体：在植物细胞、组织或器官体外培养过程中，由一38合子心型胚合子心型胚 正在萌发的体胚正在萌发的体胚合子胚与体胚比较合子心型胚正在萌发的体胚合子胚与体胚比较39胚状体发生胚状体发生初期的细胞分裂与合子胚的不同，但分化后的发胚状体发生初期的细胞分裂与合子胚的不同，但分化后的发育过程与合子胚的类似育过程与合子胚的类似。双子叶植物胚胎发生：双子叶植物胚胎发生：合子原胚球形胚心型胚鱼雷胚子叶胚合子原胚球形胚心型胚鱼雷胚子叶胚单子叶植物胚胎发生：单子叶植物胚胎发生：合子原胚球形胚盾型胚子叶胚合子原胚球形胚盾型胚子叶胚胚状体产生的方式有：胚状体产生的方式有：直接由器官上发生直接由器官上发生。培养物先形成愈伤组织，由培养物先形成愈伤组织，由愈伤组织再分化形成胚状体愈伤组织再分化形成胚状体。在花药培养中，可由在花药培养中，可由小孢子发育成胚状体小孢子发育成胚状体。胚状体发生胚状体发生初期的细胞分裂与合子胚的不同，但分化后的40胚状体发生（续）胚状体发生（续）经过愈伤组织的胚胎发生需要三个培养阶段经过愈伤组织的胚胎发生需要三个培养阶段：第一阶段是诱导第一阶段是诱导外植体形成愈伤组织；外植体形成愈伤组织；第二阶段是诱导第二阶段是诱导愈伤组织胚性化愈伤组织胚性化；第三阶段是第三阶段是体细胞胚形成。体细胞胚形成。胚状体发生（续）41花椰菜体细胞胚发育的不同阶段花椰菜体细胞胚发育的不同阶段花椰菜体细胞胚发育的不同阶段42影响脱分化与再分化的因素影响脱分化与再分化的因素内因：外植体内因：外植体遗传遗传性状；外植体性状；外植体生理生理状况状况 不同生理年龄和不同季节都会有不同的培养反应。不同生理年龄和不同季节都会有不同的培养反应。外因：外因：（1）营养营养条件条件（无机物，有机物，激素等）（无机物，有机物，激素等）（2）环境条件）环境条件(光照，温度，湿度，培养基酸光照，温度，湿度，培养基酸碱度，培养基渗透压等碱度，培养基渗透压等)影响脱分化与再分化的因素内因：外植体遗传性状；外植体生理状况434.植物激素在植物细胞分化中的作用植物激素在植物细胞分化中的作用生长素生长素影响影响细胞壁的强度细胞壁的强度，促进细胞，促进细胞伸长伸长和分化和分化，细胞分裂素细胞分裂素则促进细胞则促进细胞分裂分裂并影并影响分化方向，二者的响分化方向，二者的配比配比是影响脱分化和是影响脱分化和再分化的关再分化的关键键。4.植物激素在植物细胞分化中的作用生长素影响细胞壁的强度，44激动素和生长素的比例激动素和生长素的比例决定根芽分化的理论决定根芽分化的理论当培养基中当培养基中细胞分裂素细胞分裂素生长素生长素比值比值(1)比值比值高高时促进时促进芽芽的分化；的分化；(2)比值比值低低时促进的时促进的根根分化；分化；(3)两种激素浓度两种激素浓度相当相当时，时，诱导诱导愈伤组织愈伤组织占优势或不分化。占优势或不分化。激动素和生长素的比例决定根芽分化的理论当培养基中细胞分裂素45激素调控细胞分化的机理实验实验已初步证明已初步证明生长素生长素处理植物细胞主要是作处理植物细胞主要是作用于用于转录转录系统；系统；一般认为一般认为细胞分裂素细胞分裂素主要是作用于主要是作用于翻译翻译系统。系统。激素调控细胞分化的机理实验已初步证明生长素处理植物细胞主要465、影响细胞分化的其他因素、影响细胞分化的其他因素切割等的机械伤害；切割等的机械伤害；切割切割损伤的刺激，损伤的刺激，促促使细胞使细胞增殖增殖。化学试剂；化学试剂；(三氯乙醛使分化细胞重新回到愈伤状态三氯乙醛使分化细胞重新回到愈伤状态)电离辐射电离辐射弱光或黑暗弱光或黑暗条件有条件有利于利于脱分化中的细胞脱分化中的细胞分裂分裂。5、影响细胞分化的其他因素切割等的机械伤害；切割损伤的刺激，4711.2植物组织培养的过程植物组织培养的过程11.2植物组织培养的过程48获取获取外植体外植体无菌接种无菌接种诱导愈伤组织诱导愈伤组织的形成的形成试管苗的形成试管苗的形成扩大培养扩大培养移栽移栽脱分化脱分化再分化再分化获取无菌接种诱导愈伤组织试管苗的形成扩大培养移栽脱分化再分化4911.2.1植物材料的清洗与消毒植物材料的清洗与消毒1、材料的选取与清洗、材料的选取与清洗流程流程自来水冲洗自来水冲洗5min中性洗涤剂（洗洁精）水溶液清洗材料，中性洗涤剂（洗洁精）水溶液清洗材料，并用自来水冲洗干净，并用自来水冲洗干净，分装如干净的三角烧瓶中，备用。分装如干净的三角烧瓶中，备用。11.2.1植物材料的清洗与消毒1、材料的选取与清洗流502、外植体消毒灭菌时，既要将材料上附着的微生物杀死，同时灭菌时，既要将材料上附着的微生物杀死，同时又不能伤及材料。又不能伤及材料。因此，灭菌采用何种药剂，什么浓度，处理多长因此，灭菌采用何种药剂，什么浓度，处理多长时间，均应根据材料对药剂的敏感情况仔细敲定。时间，均应根据材料对药剂的敏感情况仔细敲定。2、外植体消毒灭菌时，既要将材料上附着的微生物杀死，同时又不51常用表面灭菌剂使用浓度及效果比较常用表面灭菌剂使用浓度及效果比较灭菌剂灭菌剂使用浓度使用浓度(%)去除的难易去除的难易灭菌时间灭菌时间(min)升汞升汞0.11最难最难515次氯酸钠次氯酸钠2易易530次氯酸钙次氯酸钙910易易530漂白粉饱和溶液漂白粉饱和溶液易易530（双氧水）（双氧水）1012最易最易515溴水溴水12易易210酒精酒精7075易易0.22硝酸银硝酸银1较难较难530抗生素抗生素450（mg/l）中中3050常用表面灭菌剂使用浓度及效果比较灭菌剂使用浓度(%)去除的难52通常需要注意以下三个方面：通常需要注意以下三个方面：（1）选择合适的灭菌种类）选择合适的灭菌种类要考虑灭菌效果，也要摸索灭菌时要考虑灭菌效果，也要摸索灭菌时间，间，最好选择最好选择灭菌效果好灭菌效果好，又，又容易被去除容易被去除的灭菌剂。的灭菌剂。使用灭菌剂使用灭菌剂后，一定要用无菌水多次漂洗，否则留在组织上的灭菌剂会影响后，一定要用无菌水多次漂洗，否则留在组织上的灭菌剂会影响外植体的生长。外植体的生长。（2）考虑）考虑不同材料对灭菌剂的耐力不同材料对灭菌剂的耐力不同种类的外植体，或处不同种类的外植体，或处于不同生理状态的同一种的外植体，对灭菌剂产生的反应不同。于不同生理状态的同一种的外植体，对灭菌剂产生的反应不同。（3）任何一种灭菌剂对不同材料如叶片、茎段和根部，浸泡时）任何一种灭菌剂对不同材料如叶片、茎段和根部，浸泡时间和浓度是不同的，对间和浓度是不同的，对任何一种外植体使用灭菌剂灭菌时，需要任何一种外植体使用灭菌剂灭菌时，需要做筛选试验做筛选试验，以确定合适的灭菌剂和使用浓度及时间，才能达到，以确定合适的灭菌剂和使用浓度及时间，才能达到灭菌的效果。灭菌的效果。通常需要注意以下三个方面：（1）选择合适的灭菌种类53不同培养器官的灭菌顺序不同培养器官的灭菌顺序器官器官顺序顺序灭菌前灭菌前灭菌中灭菌中灭菌后灭菌后茎尖茎尖清洗清洗75%酒精酒精3-5秒，转入秒，转入0.1%升升汞加吐温汞加吐温8-10min转入无菌水洗转入无菌水洗4次，接次，接种培养基。种培养基。腋芽腋芽清洗清洗75%酒精酒精3-5秒，转入秒，转入0.1%升升汞加吐温汞加吐温20-30min，转入无菌水洗转入无菌水洗4次，接次，接种培养基。种培养基。花蕾花蕾75%酒精酒精6-7秒，转入秒，转入0.1%升升汞加吐温汞加吐温8-10min，转入无菌水洗转入无菌水洗4次，接次，接种培养基。种培养基。种子种子浸种、浸种、催芽催芽75%酒精酒精3-5秒，转入秒，转入0.1%升升汞加吐温汞加吐温20-30min，转入无菌水洗转入无菌水洗4次，接次，接种培养基。种培养基。不同培养器官的灭菌顺序器官顺序灭菌前灭菌中灭菌后茎尖清洗755411.2.2培养基培养基培养基培养基(culturemedium)是植物组织培是植物组织培养的重要营养条件。养的重要营养条件。在离体培养条件下，不同种植物组织对营在离体培养条件下，不同种植物组织对营养有不同要求养有不同要求;同种植物不同部位的组织对营养的要求也同种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同不相同；11.2.2培养基培养基(culturemedium)551、培养基、培养基的成分及作用大多数培养基的成分是由大多数培养基的成分是由无机营养物、碳无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。等五类物质组成的。1、培养基的成分及作用大多数培养基的成分是由无机营养物、碳56无机营养物无机营养物无机营养物主要由无机营养物主要由大量大量元素和元素和微量微量元素两部分组成。元素两部分组成。大量元素中，大量元素中，氮氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。磷磷和和硫硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。钾钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。有逐渐提高的趋势。而而钙、钠、镁钙、钠、镁的需要则较少。的需要则较少。培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。提供。微量元素包括微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。培养基中的。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与与Na2EDTA（螯合剂）的混合。（螯合剂）的混合。无机营养物无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成。57碳源碳源培养的植物组织或细胞，它们的光合培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。因此，需要在培养基中附加一作用较弱。因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。培养基中的碳水些碳水化合物以供需要。培养基中的碳水化合物通常是化合物通常是蔗糖蔗糖。蔗糖除作为培养基内。蔗糖除作为培养基内的碳源和能源外，对的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压维持培养基的渗透压也起重要作用。也起重要作用。碳源培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。因此，需要58维生素维生素在培养基中加入维生素，常有利于外在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。培养基中的维生素属于植体的发育。培养基中的维生素属于B族维族维生素，其中效果最佳的有维生素生素，其中效果最佳的有维生素B1、维生、维生素素B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。、生物素、泛酸钙和肌醇等。维生素在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。培养基59有机附加物有机附加物包括人工合成或天然的有机附加物。包括人工合成或天然的有机附加物。最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸等。另外，子汁及各种氨基酸等。另外，琼脂琼脂也是最也是最常用的有机附加物，它主要是作为培养基常用的有机附加物，它主要是作为培养基的的支持物支持物，使培养基呈固体状态，以利于，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培养。各种外植体的培养。有机附加物包括人工合成或天然的有机附加物。最常用的有酪朊60生长调节物质生长调节物质常用的生长调节物质大致包括以下三类：常用的生长调节物质大致包括以下三类：(1)植物生长素类。植物生长素类。如吲哚乙酸（如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸）、萘乙酸（NAA）、）、2，4-二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2，4-D）。）。(2)细胞分裂素。细胞分裂素。如玉米素（如玉米素（Zt）、）、6-苄基嘌呤苄基嘌呤（6-BA或或BAP）和激动素（）和激动素（Kt）。）。(3)赤霉素。赤霉素。组织培养中使用的赤霉素只有一种，组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸（即赤霉酸（GA3）。）。生长调节物质常用的生长调节物质大致包括以下三类：612、几种常用培养基的特点、几种常用培养基的特点(1)MS培养基。培养基。MS固体培养基可用来固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养花药培养，与其它培养基的基本成分相比，与其它培养基的基本成分相比，MS培养基培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的明显特点。明显特点。2、几种常用培养基的特点(1)MS培养基。MS固体培养62B5培养基培养基(2)B5培养基的主要特点是含有培养基的主要特点是含有较低的铵较低的铵，这是因为铵可能对不少培养物的生长有抑这是因为铵可能对不少培养物的生长有抑制作用制作用。B5培养基(2)B5培养基的主要特点是含有较低的铵，这是因63N6培养基。培养基。N6培养基特别适合于培养基特别适合于禾谷类植物的花药和禾谷类植物的花药和花粉培养花粉培养，在国内外得到广泛应用。，在国内外得到广泛应用。N6培养基。N6培养基特别适合于禾谷类植物的花药和花粉培养，64回顾内容回顾内容1.高等植物细胞脱分化和再分化的过程图高等植物细胞脱分化和再分化的过程图成熟细胞成熟细胞分生细胞分生细胞愈伤组织愈伤组织器器官官发发生生胚胚状状体体发发生生成熟细胞成熟细胞脱分化脱分化分裂分裂再分化再分化回顾内容1.高等植物细胞脱分化和再分化的过程图成熟细胞分生细65续回顾内容续回顾内容2、材料的选取与清洗、材料的选取与清洗流程流程自来水冲洗自来水冲洗5min中性洗涤剂（洗洁精）水溶液清洗材料，中性洗涤剂（洗洁精）水溶液清洗材料，并用自来水冲洗干净，并用自来水冲洗干净，分装如干净的三角烧瓶中，备用。分装如干净的三角烧瓶中，备用。续回顾内容2、材料的选取与清洗流程66新内容：新内容：3、培养液的配制、培养液的配制【1】制备母液】制备母液母液：将培养基中的各种成分，按原量母液：将培养基中的各种成分，按原量10倍、倍、100倍或倍或1000倍称量，配成浓缩液。倍称量，配成浓缩液。每次配制培养基时，取其总量的每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。，加以稀释，即成培养液。新内容：3、培养液的配制【1】制备母液67例，MS培养基母液配制(1)大量元素大量元素MSMS基本培养基大量元素母液配制（基本培养基大量元素母液配制（1010倍）倍）MS培养基母液配制母液代号试剂培养基含量（毫克/升）母液含量（克）蒸馏水定容（毫升）每升培养基用母液量(毫升)K KKNO3KNO319001900191910001000100100NH4NH4NH4NO3NH4NO31650 1650 16.516.5MgMgMgSO4MgSO4370 370 3.73.7P P KH2PO4 KH2PO4 1701701.71.7CaCaCaCl22HCaCl22H20 20 4404404.44.4例，MS培养基母液配制(1)大量元素MS培养基母液配制母液代68(2)MS微量元素母液（微量元素母液（100X）称称10升量溶解在升量溶解在100ml蒸馏水中。蒸馏水中。配配1升养基取母液升养基取母液10ml。化学化学药品品1升量升量10升量升量MnSO44H2O（MnSO4H2O）223mg/L（214mg/L）223mgZnSO47H2O86mg/L86mgCoCl26H2O0025mg/L025mgCuSO45H2O0025mg/L025mgNa2MoO42H2O025mg/L25mgKI083mg/L83mgH3BO362mg/L62mg(2)MS微量元素母液（100X）称10升量溶解在1069(3)铁盐铁盐铁盐要单独配制铁盐要单独配制。由硫酸亚铁。由硫酸亚铁(FeSO47H2O)5.57克和乙二胺四乙酸二钠克和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)7.45克溶于克溶于1升水中配成。每配升水中配成。每配1升培养基，加铁升培养基，加铁盐盐5毫升。毫升。(3)铁盐铁盐要单独配制。由硫酸亚铁(FeSO47H2O)70MSMS基本培养基铁盐母液配制基本培养基铁盐母液配制（200倍）倍）MS培养基母液配制母液 代号试剂培养基含量（毫克/升）母液称量（克）蒸馏水定容（毫升）每升培养基用母液量（毫升）FeFeNa2-EDTANa2-EDTA37.337.33.7303.7305005005 5FeSO47HFeSO47H20 20 27.827.82.7802.780MS基本培养基铁盐母液配制（200倍）MS培养基母液配制母71(4)有机物质有机物质主要指氨基酸和维生素类物质。它们都是主要指氨基酸和维生素类物质。它们都是分别称量，分别配成所需的浓度分别称量，分别配成所需的浓度(0.11.0毫克毫克/毫升毫升)，用时按培养基配方中要求的，用时按培养基配方中要求的量分别加入。量分别加入。(4)有机物质主要指氨基酸和维生素类物质。它们都是分别称72MSMS培养基有机物母液配制培养基有机物母液配制(100(100倍）倍）MS培养基母液配制母液 代号试剂培养基含量（毫克/升）母液称量（毫克）蒸馏水定容（毫升）每升培养基用母液量（毫升）C 甘氨酸2 20 0200200100010001010盐酸噻胺0 04 44040盐酸比哆素0 05 55050烟酸 0 05 55050肌醇1001001000010000MS培养基有机物母液配制(100倍）MS培养基母液配制母液73(5)植物激素植物激素最常用的有生长素和细胞分裂素最常用的有生长素和细胞分裂素。这类物质使。这类物质使用浓度很低，一般为用浓度很低，一般为0.0110毫克毫克/升。升。配制植物生长素：用配制植物生长素：用12毫升毫升0.1molL-1氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。配制细胞分裂素：应先用少量配制细胞分裂素：应先用少量0.5或或1molL-1的盐酸溶解，然后加蒸馏水至所需量。的盐酸溶解，然后加蒸馏水至所需量。(5)植物激素最常用的有生长素和细胞分裂素。这类物质使用74【2】配制培养基的具体操作】配制培养基的具体操作按照用量量取每种母液；按照用量量取每种母液；用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用；用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用；【2】配制培养基的具体操作按照用量量取每种母液；75将将中称好的琼脂加蒸馏水中称好的琼脂加蒸馏水300400毫毫升，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透升，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。明状，再停止加热。将中称好的琼脂加蒸馏水300400毫升，加热并不断搅拌76将将中所取的各种物质中所取的各种物质(包括蔗糖包括蔗糖)，加，加入煮好的琼脂中，再加水至入煮好的琼脂中，再加水至1000毫升，搅毫升，搅拌均匀，配成培养基。拌均匀，配成培养基。将中所取的各种物质(包括蔗糖)，加入煮好的琼脂中，再加水77用用1N的氢氧化钠或盐酸，滴入的氢氧化钠或盐酸，滴入中的培养基里，中的培养基里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用pH试纸测其试纸测其pH值，直到将培养基的值，直到将培养基的pH值调到值调到5.8。用1N的氢氧化钠或盐酸，滴入中的培养基里，每次只滴几滴，78将配好的培养基，用漏斗分装到三角将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶瓶(或试管或试管)中，并用棉塞塞紧瓶口，瓶壁中，并用棉塞塞紧瓶口，瓶壁写上号码。瓶中培养基的量约为容量的写上号码。瓶中培养基的量约为容量的1/4或或1/5。将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶(或试管)中，并用棉塞794、培养基的灭菌与保存（略）、培养基的灭菌与保存（略）高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌锅内，在锅内，在汽相汽相120条件下，灭条件下，灭菌菌20分钟。分钟。间歇灭菌法间歇灭菌法进行灭菌，进行灭菌，即将培养基煮沸即将培养基煮沸10分钟，分钟，24小时后再煮沸小时后再煮沸20分钟，分钟，如此连续灭菌三次，即如此连续灭菌三次，即可达到完全灭菌的目的。可达到完全灭菌的目的。4、培养基的灭菌与保存（略）高压蒸汽灭菌锅内，在汽相12080高压蒸汽灭菌注意事项：高压蒸汽灭菌注意事项：高压蒸汽灭菌锅装锅不可过满，便于热蒸汽的上下回流，高压蒸汽灭菌锅装锅不可过满，便于热蒸汽的上下回流，收到良好灭菌效果。收到良好灭菌效果。因灭菌作用取决于温度，而不是取决于压力。因灭菌作用取决于温度，而不是取决于压力。保持压力过程中严格遵守时间：时间过长破坏化学物质；保持压力过程中严格遵守时间：时间过长破坏化学物质；时间不足则达不到灭菌效果。时间不足则达不到灭菌效果。101.3kPa(121.3)101.3kPa(121.3)消毒消毒151540min40min。所需时间随要进行消毒的液体容积而变化所需时间随要进行消毒的液体容积而变化(表表11.5)11.5)。冷却被消毒溶液时，防止压力急速下降。冷却被消毒溶液时，防止压力急速下降。如果压力下降速度，超过了温度下降速率，会使如果压力下降速度，超过了温度下降速率，会使液体滚液体滚沸沸，从培养容器中溢出。，从培养容器中溢出。仅当高压灭菌锅压力表指针回到零仅当高压灭菌锅压力表指针回到零(温度不高于温度不高于50)50)时，时，才能打开灭菌锅。才能打开灭菌锅。高压蒸汽灭菌注意事项：81某些生长调节物质某些生长调节物质(如如GA3GA3、玉米素、玉米素、IAAIAA、ABA)ABA)、尿素及某些维生素等，、尿素及某些维生素等，遇热易分解遇热易分解，则通过滤膜过滤除菌。则通过滤膜过滤除菌。滤膜用前须安装于支座，或铝箔包裹，滤膜用前须安装于支座，或铝箔包裹，进行高压灭菌。进行高压灭菌。过滤器的灭菌温度不应超过过滤器的灭菌温度不应超过121121。经灭菌的培养基，应置于经灭菌的培养基，应置于4 455低温下低温下保存。含保存。含IAAIAA或或GA3GA3培养基，要在配制后培养基，要在配制后1 1周周内使用完；其它培养基最多应不超过内使用完；其它培养基最多应不超过1 1月。月。某些生长调节物质(如GA3、玉米素、IAA、ABA)、尿素8211.2.3接种11.2.3接种831、无菌接种步骤、无菌接种步骤（1）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，入超净台上入超净台上用消毒剂灭菌用消毒剂灭菌再用无菌水再用无菌水冲洗冲洗取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。上。1、无菌接种步骤（1）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，入超净84（2）材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪）材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如如叶片叶片切成切成0.5cm平方的小块；平方的小块；茎茎切成含有一个节的小段。切成含有一个节的小段。微茎尖微茎尖要剥成只含要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。片幼叶的茎尖大小等。（2）材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行85植物细胞的脱分化脱分化课件86（3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。体插植或放置到培养基上。接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种。接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。里面也要过火。（3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上87植物细胞的脱分化脱分化课件8811.2.4种质保存种质种质:指亲代通过生殖细胞或体细胞传指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质递给子代的遗传物质种质保存种质保存:利用天然或人工创造的适宜环境，利用天然或人工创造的适宜环境，使个体中所含有的遗传物质保持其遗传完整使个体中所含有的遗传物质保持其遗传完整性，高活力，能通过繁殖将遗传物质传递下性，高活力，能通过繁殖将遗传物质传递下去。去。11.2.4种质保存种质:指亲代通过生殖细胞或体细胞传递89种质保存方法种质保存方法按照保存时的所设定的温度分为：按照保存时的所设定的温度分为：(1)常温保存常温保存(2)常低温保存常低温保存(3)低温保存低温保存(4)超低温保存超低温保存种质保存方法按照保存时的所设定的温度分为：90（1）常温保存温度温度:2025改变培养基中营养物质的浓度改变培养基中营养物质的浓度改变培养的环境条件：降低氧的含量改变培养的环境条件：降低氧的含量降低无机盐浓度降低无机盐浓度提高渗透压：甘露醇、蔗糖提高渗透压：甘露醇、蔗糖增加生长调节物质增加生长调节物质覆盖矿物油覆盖矿物油降低氧压降低氧压l特点特点:保存时间短保存时间短,1年转年转35次次（1）常温保存温度:2025改变培养基中营养物质的浓度91(2)常低温和常低温和(3)低温保低温保存存方法方法:常低温常低温:015低温低温:-800特点特点:简便易行简便易行,投资小投资小.1年转年转13次次低温保存低温保存改变培养基成分改变培养基成分改变培养条件改变培养条件(2)常低温和(3)低温保存方法:常低温:015低温:92(4)超低温保存超低温保存超低温保存超低温保存：也叫冷冻保也叫冷冻保存，指在存，指在-196-196的液氮超的液氮超低温下使细胞代谢和生长低温下使细胞代谢和生长处于基本停止的状态，在处于基本停止的状态，在适宜条件下可繁殖，再生适宜条件下可繁殖，再生出新的植株，并保持原来出新的植株，并保持原来的遗传特性。的遗传特性。(4)超低温保存超低温保存：也叫冷冻保存，指在-1993保存原理保存原理低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，细胞结构就遭到不可逆的破坏，导致细胞和细胞结构就遭到不可逆的破坏，导致细胞和组织死亡。组织死亡。植物材料在超低温条件下，冰冻过程中避免植物材料在超低温条件下，冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分次生结冰而达到植物材料保存目细胞内水分次生结冰而达到植物材料保存目的。的。保存原理低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，细胞结构就遭94冷冻的方法冷冻的冷冻的4种方法种方法快速冷冻法快速冷冻法慢速冷冻法慢速冷冻法分步冷冻法分步冷冻法干燥冷冻法干燥冷冻法冷冻的方法冷冻的4种方法快速冷冻法慢速冷冻法分步冷冻法干燥冷95快速冷冻法快速冷冻法将要保存的样品直接置于将要保存的样品直接置于-196液氮中使液氮中使之迅速冷却之迅速冷却。降温速度为。降温速度为1000min。采用该法要求细胞体积小、采用该法要求细胞体积小、含水量低、液含水量低、液泡化程度低的材料。泡化程度低的材料。快速冷冻法将要保存的样品直接置于-196液氮中使之迅速冷却96慢速冷冻法慢速冷冻法将处于将处于0或其他预处理温度的材料，以或其他预处理温度的材料，以0.55/min的降温速度从起始温度降到的降温速度从起始温度降到液氮的保存方法。液氮的保存方法。适宜保存的材料有：适宜保存的材料有：成熟的、含有大液泡成熟的、含有大液泡和含水量高的细胞，对于保存在悬浮培养和含水量高的细胞，对于保存在悬浮培养中的细胞特别有效。中的细胞特别有效。慢速冷冻法将处于0或其他预处理温度的材料，以0.5597预冷冻法预冷冻法预冷冻法指将植物保存材料放入液氮前，需预冷冻法指将植物保存材料放入液氮前，需经过短暂经过短暂时间的低温锻炼的方法。时间的低温锻炼的方法。可分为可分为两步冷冻法和逐级冷冻法两步冷冻法和逐级冷冻法。两步冷冻法：先慢速降温到预冷温度两步冷冻法：先慢速降温到预冷温度(-30-50)，停留，停留13h后投入液氮。后投入液氮。逐级冷冻法：逐级降温（每级降温后停留逐级冷冻法：逐级降温（每级降温后停留5分钟）直到投入到液氮中。分钟）直到投入到液氮中。预冷冻法预冷冻法指将植物保存材料放入液氮前，需经过短暂时间98干燥冷冻法干燥冷冻法将材料置于将材料置于2729烘箱内降低植物含水烘箱内降低植物含水量，再投入液氮中保存的方法。量，再投入液氮中保存的方法。可防止材料因细胞内过度结冰而冻死。可防止材料因细胞内过度结冰而冻死。干燥冷冻法将材料置于2729烘箱内降低植物含水量，再投99解冻解冻方法有：方法有：快速解冻快速解冻和和慢速解冻慢速解冻快速解冻法快速解冻法：是指将液氮中保存的材料直：是指将液氮中保存的材料直接投入到接投入到37-40温水浴中进行解冻。解冻温水浴中进行解冻。解冻的升温速度为的升温速度为500-750/min。对象：大多数植物材料对象：大多数植物材料慢速解冻法慢速解冻法：将液氮中保存的材料先置于：将液氮中保存的材料先置于0低温下解冻，再逐渐升至室温下进行解低温下解冻，再逐渐升至室温下进行解冻的方法。冻的方法。适宜材料：细胞含水量较低的材料适宜材料：细胞含水量较低的材料。解冻方法有：快速解冻和慢速解冻100超低温保存的程序超低温保存的程序组织材料组织材料预处理预处理加冷冻防护剂加冷冻防护剂0慢冻法慢冻法-40或或-100预冻法预冻法-70-20快冻法快冻法种质库（种质库（-196）迅速解冻（迅速解冻（3440）再培养再培养细胞生长、植株再生细胞生长、植株再生超低温保存的程序组织材料预处理加冷冻防护剂0慢冻法-40101冷冻保存的应用前景（意义）1、长期保存种质的遗传稳定性。、长期保存种质的遗传稳定性。2、长期保存去病毒的种质。、长期保存去病毒的种质。3、保存稀有珍贵及濒危植物的种质资源。、保存稀有珍贵及濒危植物的种质资源。4、保存不稳定性的培养物，如单倍体。、保存不稳定性的培养物，如单倍体。5、保持培养细胞形态发生的能力。、保持培养细胞形态发生的能力。6、防止种质衰老。、防止种质衰老。7、延长花粉寿命，解决不同开花期和异地植物、延长花粉寿命，解决不同开花期和异地植物杂交上的困难。杂交上的困难。8、冷冻解冻过程可筛选抗逆新品种。、冷冻解冻过程可筛选抗逆新品种。9、便于国际间的种质交换。、便于国际间的种质交换。冷冻保存的应用前景（意义）1、长期保存种质的遗传稳定性。102总结植物组织培养的过程植物组织培养的过程一、培养基配制一、培养基配制1、配制几种母液、配制几种母液2、配制培养基、配制培养基二、培养基灭菌二、培养基灭菌三、接种三、接种四、培养四、培养总结植物组织培养的过程一、培养基配制1、配制几种母液2、配103四、培养四、培养（1）初代培养）初代培养初代