第三章毛细管电泳法-课件

第三章第三章 毛细管电泳法毛细管电泳法Capillary Electrophoresis2020/10/281n第一节第一节 毛细管电泳概述毛细管电泳概述n第二节第二节 毛细管电泳基础理论毛细管电泳基础理论n第三节第三节 毛细管电泳仪毛细管电泳仪n第四节第四节 毛细管电泳类型毛细管电泳类型n第五节第五节 毛细管电泳的应用和进展毛细管电泳的应用和进展2020/10/282精品资料2020/10/283第一节第一节 毛细管电泳概述毛细管电泳概述n毛细管电泳（毛细管电泳（CECE），），又称高效毛细管电泳又称高效毛细管电泳，是近，是近年来发展最快的高效分离分析技术之一。年来发展最快的高效分离分析技术之一。该技术该技术是现代微柱分离技术和经典电泳技术结合的产物，是现代微柱分离技术和经典电泳技术结合的产物，是气相色谱是气相色谱(GC)(GC)、高效液相色谱、高效液相色谱(HPLC)(HPLC)等常用分等常用分离技术的重要补充，离技术的重要补充，在诸多研究领域得到了人们在诸多研究领域得到了人们广泛的接受和认可。广泛的接受和认可。2020/10/284一、毛细管电泳发展历程n18081808年，俄国物理学家年，俄国物理学家 Pence Pence 发现电泳现象。发现电泳现象。n19371937年，瑞典年，瑞典TiseliusTiselius将蛋白质混合液放在两段缓冲溶将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，发现样品的液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定迁移速度和方向由其电荷和淌度决定,第一次从人血清第一次从人血清提取的蛋白质混合液中分离出白蛋白和提取的蛋白质混合液中分离出白蛋白和、球蛋球蛋白，但分离效率低；白，但分离效率低；n19811981年，年，JorgensonJorgenson在在75m75m毛细管内施加毛细管内施加300 V/cm300 V/cm的高的高强度电场，获得了理论塔板数超过强度电场，获得了理论塔板数超过400,000 plates/m400,000 plates/m的的高分离效率，轰动了整个分离界，成为高分离效率，轰动了整个分离界，成为CECE划时代里程碑划时代里程碑n19891989年，毛细管电泳仪问世。年，毛细管电泳仪问世。n19891989年，第一届年，第一届CECE国际会议的召开，标志着一门新的分国际会议的召开，标志着一门新的分析技术的产生。析技术的产生。2020/10/285二、毛细管电泳的特点二、毛细管电泳的特点n(1)(1)高效：每米理论塔扳数低则十几万，高则几百万甚高效：每米理论塔扳数低则十几万，高则几百万甚至上千万；至上千万；n(2)(2)快速：可在十几分钟甚至几十秒内完成分离；快速：可在十几分钟甚至几十秒内完成分离；n(3)(3)低样品消耗：只需纳升甚至皮升级样品量；低样品消耗：只需纳升甚至皮升级样品量；n(4)(4)低成本分析：只需低廉的分离毛细管和少量的运行低成本分析：只需低廉的分离毛细管和少量的运行缓冲液；缓冲液；CE是现代微柱分离和经典电泳技术有机结合的产物，具有较HPLC和平板凝胶电泳更多的优点：2020/10/286n(5)(5)高度自动化：高度自动化：CECE是目前自动化程度最高的分离分析是目前自动化程度最高的分离分析方法之一；方法之一；n(6)(6)洁净：通常用水溶性缓冲液，对人体和环境无害；洁净：通常用水溶性缓冲液，对人体和环境无害；n(7)(7)多分离模式：可根据需要在同一仪器上选用不同的多分离模式：可根据需要在同一仪器上选用不同的样品分离模式；样品分离模式；n(8)(8)应用范围广：具有应用范围广：具有“万能万能”分析的功能和潜力，既分析的功能和潜力，既可以分析无机离子、氨基酸、药物等小分子，又可以可以分析无机离子、氨基酸、药物等小分子，又可以分析蛋白质等生物大分子分析蛋白质等生物大分子,甚至整个细胞和各种微粒。甚至整个细胞和各种微粒。2020/10/287第二节 毛细管电泳基础理论+2020/10/288一、电泳流一、电泳流n电泳电泳：在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象。相反的电极方向迁移的现象。n电泳时，不同离子在电场中具有不同的定向迁移电泳时，不同离子在电场中具有不同的定向迁移速度，速度，迁移速度与哪些因素有关？迁移速度与哪些因素有关？淌度淌度(）：单位电场下的电泳速度。：单位电场下的电泳速度。绝对淌度绝对淌度：在无限稀释溶液中测得的淌度。：在无限稀释溶液中测得的淌度。有效电泳淌度有效电泳淌度：在实际溶液中测得的淌度。：在实际溶液中测得的淌度。+2020/10/289n电场强度电场强度：与所施加的电压成正比，与两电极间的距离（与所施加的电压成正比，与两电极间的距离（L）成反比）成反比 E=V/Ln电场力电场力：在溶液中，电场对带电离子作用力（在溶液中，电场对带电离子作用力（F F）的大小等于带电离子所带）的大小等于带电离子所带的净电荷（的净电荷（q q）与电场强度的乘积：）与电场强度的乘积：F=qEn在电泳迁移过程中，介质粘滞力在电泳迁移过程中，介质粘滞力（F F）必然会阻碍离子的迁移。必然会阻碍离子的迁移。n粘滞力的大小与离子大小、形状、缓冲液粘度、甚至电泳介质孔径均有关系，粘滞力的大小与离子大小、形状、缓冲液粘度、甚至电泳介质孔径均有关系，与带电离子的移动速度更是直接相关。与带电离子的移动速度更是直接相关。对于对于球形分子球形分子F的大小服从的大小服从Stokes定定律：律：F=6ref ：缓冲液粘度；：缓冲液粘度；r：球形分子的半径；：球形分子的半径；ef：离子在电场中的迁移速度。：离子在电场中的迁移速度。2020/10/2810当带电离子以速度当带电离子以速度 在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场驱在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场驱动力和平动摩擦阻力的作用，此时动力和平动摩擦阻力的作用，此时F=F故：qE=6ref则离子在电场中的迁移速度：则离子在电场中的迁移速度：即带电离子的电泳迁移速率（或称电泳淌度）即带电离子的电泳迁移速率（或称电泳淌度）:由此可知，球形带电离子的迁移率，主要取决于自身状态，即与其所带电由此可知，球形带电离子的迁移率，主要取决于自身状态，即与其所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。量成正比，与其半径及介质粘度成反比。电泳过程中正是利用带电离子电电泳过程中正是利用带电离子电泳迁移速度或迁移速率的差异来实现分离的。泳迁移速度或迁移速率的差异来实现分离的。2020/10/2811二、电渗流二、电渗流n在高电场的作用下，带在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于散层向阴极移动，由于这些这些阳离子实际上是溶阳离子实际上是溶剂化的剂化的，故将引起柱中，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，的溶液整体向负极移动，形成电渗流。形成电渗流。n n石英毛细管柱，内壁大约有石英毛细管柱，内壁大约有石英毛细管柱，内壁大约有石英毛细管柱，内壁大约有8.31 8.31 mol/mmol/m2 2的硅醇基的硅醇基的硅醇基的硅醇基（Si-OHSi-OH），其），其），其），其等电点约为等电点约为等电点约为等电点约为1.51.5，内充液，内充液，内充液，内充液pH3pH3时，表时，表时，表时，表面电离成面电离成面电离成面电离成SiOSiO-，管内壁带负电荷，形成双电层。管内壁带负电荷，形成双电层。管内壁带负电荷，形成双电层。管内壁带负电荷，形成双电层。2020/10/28121.CE1.CE中电渗流的大小与方向中电渗流的大小与方向 电渗流的大小可用电渗速度和电渗淌度表示。电渗流的大小可用电渗速度和电渗淌度表示。（1 1）电渗流的大小）电渗流的大小n电渗流的大小与电场强度、电渗流的大小与电场强度、ZataZata电势及缓冲液介电常电势及缓冲液介电常数有关，某一电泳体系内电渗流的具体数值可以用数有关，某一电泳体系内电渗流的具体数值可以用Helmholtz-Smoluchowski 公式计算：公式计算：式中，为电渗速度；为电渗淌度（EOF mobility）；为双电层的Zeta电位；为缓冲液介电常数；为电解液粘度；V为所施加的电压；为毛细管总长度。2020/10/2813n在具体实验中在具体实验中，可根据需要选用不同的中性组分作为标，可根据需要选用不同的中性组分作为标记物（记物（N,N-N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酰胺、苯酚、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酰胺、苯酚、丙酮等丙酮等），测定不同缓冲条件下中性标记物的迁移时间，），测定不同缓冲条件下中性标记物的迁移时间，按下述公式计算出电渗率：按下述公式计算出电渗率：其中，t：中性标记物的迁移时间，ldet为毛细管电泳有效长度，ltot为毛细管电泳有效长度。2020/10/2814（2 2）CECE中电渗流的方向中电渗流的方向n石英毛细管带负电荷，溶液带正电荷，电渗流石英毛细管带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；流向阴极；n改变电渗流方向的方法：改变电渗流方向的方法：毛细管改性：毛细管改性：表面键合阳离子基团；表面键合阳离子基团；加电渗流反转剂加电渗流反转剂:内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。2020/10/28152 2.CECE中电渗流的流形中电渗流的流形n n液相色谱中的溶液流动为层流，液相色谱中的溶液流动为层流，液相色谱中的溶液流动为层流，液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型抛物线流型抛物线流型抛物线流型，管壁管壁管壁管壁处流速最慢，管中心处的速度为平均速度的处流速最慢，管中心处的速度为平均速度的处流速最慢，管中心处的速度为平均速度的处流速最慢，管中心处的速度为平均速度的2 2 2 2倍（引倍（引倍（引倍（引起谱带展宽较大）。起谱带展宽较大）。起谱带展宽较大）。起谱带展宽较大）。n n在毛细管电泳中，电荷均匀分布，整体移动，在毛细管电泳中，电荷均匀分布，整体移动，在毛细管电泳中，电荷均匀分布，整体移动，在毛细管电泳中，电荷均匀分布，整体移动，电渗电渗电渗电渗流的流动为平流流的流动为平流流的流动为平流流的流动为平流，塞式流动塞式流动塞式流动塞式流动（谱带展宽很小），故（谱带展宽很小），故（谱带展宽很小），故（谱带展宽很小），故柱效较高。柱效较高。柱效较高。柱效较高。2020/10/28163 3.CECE中电渗流的作用中电渗流的作用n电渗流的速度一般约等于离子电泳速度的电渗流的速度一般约等于离子电泳速度的5 57 7倍；倍；n各种电性粒子在毛细管柱中的迁移速度为：各种电性粒子在毛细管柱中的迁移速度为：阳离子迁移速度阳离子迁移速度 =电渗流电渗流+电泳流，阳离子运动速度快于电渗流；电泳流，阳离子运动速度快于电渗流；阴离子迁移速度阴离子迁移速度 =电渗流电渗流电泳流，阴离子运动速度慢于电渗流；电泳流，阴离子运动速度慢于电渗流；中性粒子迁移速度中性粒子迁移速度 =电渗流，中性粒子运动速度与电渗流一致。电渗流，中性粒子运动速度与电渗流一致。nCECE中电渗流的作用：中电渗流的作用：可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性电渗流的微小变化影响结果的重现性；电渗流的微小变化影响结果的重现性；在在CECE中，控制电渗流非常重要中，控制电渗流非常重要。+2020/10/28174.CE4.CE中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素（1 1）电场强度的影响）电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。（2 2）毛细管材料的影响）毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同。2020/10/2818（3 3）电解质溶液性质的影响）电解质溶液性质的影响 溶液溶液pHpH的影响的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大。pHpH在在4-74-7之间，之间，电渗流增大显著电渗流增大显著；pH8pH8时电渗流增大速时电渗流增大速度渐缓。度渐缓。当pH电泳电泳时时,阴离子在负极阴离子在负极最后流出最后流出,在这种情况下在这种情况下,不但可以按不但可以按类分离类分离,同种类离子由于同种类离子由于差速迁移差速迁移被被相互分离。相互分离。CZECZE是最基本、应用广的分离模式；是最基本、应用广的分离模式；2020/10/2837二、毛细管凝胶电泳二、毛细管凝胶电泳 Capillary gel electrophoresis，CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、蛋白质、DNADNA等的电荷等的电荷/质量比与分子大小无关，质量比与分子大小无关，CZECZE模式模式很难分离，采用很难分离，采用CGECGE能获得良好分离，能获得良好分离，DNADNA排序的重要手段。排序的重要手段。特点特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。2020/10/28381.1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。形成一疏水内核、外部带负电的胶束。三、三、胶束电动毛细管色谱（胶束电动毛细管色谱（MECCMECC，MEKCMEKC）Micellar electrokinetic capillary chromatography,MEKC 在电场力的作用在电场力的作用下，胶束在柱中移动。下，胶束在柱中移动。2020/10/28392.2.电泳流和电渗流的方向相反，且电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流电渗流 电泳电泳 ，负电，负电胶束以较慢的速度向负极移动；胶束以较慢的速度向负极移动；5.5.色谱与电泳分离模式的结合。色谱与电泳分离模式的结合。3.3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；胶束结合的较牢，流出时间长；4.4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；2020/10/28401.1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6 68 8.0.0 kVkV）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pHpH梯度；梯度；3.3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pHpH有关，在酸性有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；淌度为零；四、毛细管等电聚焦四、毛细管等电聚焦Capillary isoelectric focusing,CIEFCapillary isoelectric focusing,CIEF2020/10/28414.4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点分别到达满足其等电点pHpH的位置时，呈电中性，停止移动，的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；形成窄溶质带而相互分离；5.5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOHNaOH溶液；溶液；6.6.加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7.7.电渗流在电渗流在CIEFCIEF中不利，应消除或减小。中不利，应消除或减小。2020/10/28421.1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细充满毛细管管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。速度移动。2.2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。五、毛细管等速电泳五、毛细管等速电泳 Capillary isotachophoresis Capillary isotachophoresis，CITPCITP2020/10/28433.3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=E=E)，淌度大的离子区带电场强度小。淌度大的离子区带电场强度小。沿出口到进口，将不同区带依次排序沿出口到进口，将不同区带依次排序1 1、2 2、3 3、4 4 电场强电场强度依次增大。假设度依次增大。假设“2”2”号中离子扩散到号中离子扩散到“3”3”号，该区电场强度号，该区电场强度大，离子被加速，返回到大，离子被加速，返回到“2”2”区；当区；当“2”2”号中离子跑到号中离子跑到“1”1”号号区，离子被减速使之归队；区，离子被减速使之归队；4.4.特点：界面明显，富集、浓缩作用。特点：界面明显，富集、浓缩作用。2020/10/2844 在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以含有机物的缓冲液为流动相，以电渗流为驱液，以含有机物的缓冲液为流动相，以电渗流为驱动力，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动动力，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程；色谱过程；六、毛细管电色谱六、毛细管电色谱 Capillary electroosmostic chromatography Capillary electroosmostic chromatography，CECCEC2020/10/2845一、离子分析一、离子分析阳离子分析阳离子分析 迁移方向和电渗流方向迁移方向和电渗流方向一致；一致；4.5 min4.5 min内分离了内分离了2424种种金属离子；金属离子；阳极进样，阴极检测；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度。具有很高的灵敏度。第五节第五节 毛细管电泳的应用与进展毛细管电泳的应用与进展2020/10/2846阴离子分析阴离子分析 阴离子电泳方向和电渗流方阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间向相反、速度接近，分析时间长、效率低；长、效率低；质量小、电荷密度大的离子质量小、电荷密度大的离子如：如：SOSO4 42-2-、ClCl-、F F-等，电泳速等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；在阴极端无法检测；加入电渗流改性剂，十六烷加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在向和电渗流方向一致，可在3.1 3.1 minmin内分离内分离3636种阴离子；阴极进种阴离子；阴极进样，阳极检测；样，阳极检测；离子价态及存在形态分析；离子价态及存在形态分析；2020/10/2847二、药物分析二、药物分析 检测体液或细胞中某检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅作为临床诊断糖尿病的辅助手段；助手段；采用毛细管区带电泳采用毛细管区带电泳方式，在方式，在11 min11 min内分离内分离1717种药物；种药物；2020/10/2848采用采用MEKCMEKC模式，模式，鉴定违禁药物；鉴定违禁药物；效果优于效果优于HPLCHPLC法法2020/10/2849三、手性化合物分析三、手性化合物分析 合成获得单一手性化合物相当困难；合成获得单一手性化合物相当困难；528528种手性合成药物，种手性合成药物，6161中以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也中以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；相当困难；研究热点；R-R-反应停是安眠药，反应停是安眠药，S-S-式致胎儿畸形；式致胎儿畸形；HPCEHPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCEHPCE的高效率；的高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）2020/10/2850四、氨基酸与蛋白质分析四、氨基酸与蛋白质分析采用采用MEKCMEKC模式，在模式，在25 min25 min内分离了内分离了2323种丹酰化氨基酸；种丹酰化氨基酸；HPCEHPCE可取代传统的氨基酸分析仪；可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；问题：吸附和检测；2020/10/2851蛋白质分析蛋白质分析2020/10/2852五、核酸分析及五、核酸分析及DNADNA排序排序酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；2020/10/2853