代谢工程与调控-第三章课件

代谢工程与调控代谢工程与调控孙新晓孙新晓代谢工程与调控孙新晓1一、中心法则一、中心法则由佛朗西斯克里克于1958年提出，是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。代谢调控可以发生在转录、翻译以及翻译后修饰水平，涉及代谢调控可以发生在转录、翻译以及翻译后修饰水平，涉及DNA、RNA、蛋白质和代谢物之间的相互作用、蛋白质和代谢物之间的相互作用微生物代进行谢调控的原因：减少不必要的资源浪费，保证代微生物代进行谢调控的原因：减少不必要的资源浪费，保证代谢活动的经济高效，适应环境的变化，等。谢活动的经济高效，适应环境的变化，等。一、中心法则由佛朗西斯克里克于1958年提出，是指遗传信息2二、酶的分类及表达纯化二、酶的分类及表达纯化氧化还原酶类氧化还原酶类(oxidoreductases)指催化底物进行氧化还原反应的酶类。例如，乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等。转移酶类转移酶类(transferases)指催化底物之间进行某些基团的转移或交换的酶类。如转甲基酶、转氨酸、己糖激酶、磷酸化酶等。水解酶类水解酶类(hydrolases)指催化底物发生水解反应的酶类。例如、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶等。裂解酶类裂解酶类(lyases)指催化一个底物分解为两个化合物或两个化合物合成为一个化合物的酶类。例如柠檬酸合成酶、醛缩酶等。异构酶类异构酶类(isomerases)指催化各种同分异构体之间相互转化的酶类。例如，磷酸丙糖异构酶、消旋酶等。合成酶类合成酶类(连接酶类，ligases)指催化两分子底物合成为一分子化合物，同时还必须偶联有ATP的磷酸键断裂的酶类。例如，谷氨酰胺合成酶、氨基酸：tRNA连接酶等。2.1 酶的分类酶的分类二、酶的分类及表达纯化氧化还原酶类(oxidoreducta32.2 酶的表达纯化酶的表达纯化直接分离纯化宿主的选择：大肠杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、哺乳动物表达载体的选择纯化标签：组氨酸标签（His）、谷胱甘肽转移酶（GST）标签、麦芽糖结合蛋白（MBP）标签2.2酶的表达纯化直接分离纯化42.2 酶的表达纯化酶的表达纯化2.2酶的表达纯化52.2 酶的表达纯化酶的表达纯化2.2酶的表达纯化6蛋白纯化及浓度测定蛋白纯化及浓度测定BCA试剂盒试剂盒聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）2.2 酶的表达纯化酶的表达纯化蛋白纯化及浓度测定BCA试剂盒2.2酶的表达纯化72.3 酶动力学酶动力学酶的最适温度、酶的最适温度、pH耐高温酶耐高温酶动力学常数动力学常数Km越小，对底物的亲和力越高越小，对底物的亲和力越高Kcat越大，催化效率越高越大，催化效率越高Vmax=kcat E Kcat/Km是较好的催化效率指标是较好的催化效率指标2.3酶动力学酶的最适温度、pH82.4代谢调控方式酶活性的调节酶活性的调节酶原的激活、变构调节、共价修饰酶原的激活、变构调节、共价修饰酶表达水平的调节酶表达水平的调节 底物诱导、终产物阻遏、基因表达的弱化、核糖核酸开关、翻译的控底物诱导、终产物阻遏、基因表达的弱化、核糖核酸开关、翻译的控制、酶分子降解的调节制、酶分子降解的调节 2.4代谢调控方式酶活性的调节92.4.1 酶活性的调节方式酶活性的调节方式酶原的激活酶原的激活部分非必需的酶原肽链被降解后改变了蛋白质一级结构和空间构象，从而形成酶的活性中心。胰蛋白酶原进入小肠后，在Ca2+存在下受肠激酶的激活，第6位赖氨酸与第7位9异亮氨酸残基之间的肽键被切断，分子构象发生改变，形成酶活性部位。为什么不直接表达有活性的蛋白酶？2.4.1酶活性的调节方式酶原的激活102.4.1 酶活性的调节方式酶活性的调节方式变构调节变构调节有很多酶能够和某些代谢物特异性结合而使酶分子构象发生改变，从而改变没得催化活性以及代谢反应的速度，这种调节被称为变构调节。具有变构调节作用的酶被称为变构酶。生理意义：1代谢终产物反馈调节反应途中的酶，使代谢物不致生成过多；2使能量得以有效利用，不致浪费；3不同代谢途径相互调节。2.4.1酶活性的调节方式变构调节112.4.1 酶活性的调节方式酶活性的调节方式共价修饰共价修饰某些酶分子上的基团可以在另一种酶催化下发生共价修饰作用，从而引起酶活性的激活或抑制。包括磷酸化、甲基化、乙酰化、腺苷化。被修饰的酶可以有两种互变形式，一种有催化活性，一种无催化活性共价修饰调节可以产生酶的连续激活现象，具有信号放大效应。例如肾上腺素引起糖原分解过程中的一系列磷酸化激活步骤，结果共将激素的信号被连续放大了约300万倍。共价修饰一般是耗能过程。2.4.1酶活性的调节方式共价修饰122.4.2酶表达水平的调节底物诱导（转录水平）底物诱导（转录水平）乳糖操纵子终产物阻遏（转录水平）终产物阻遏（转录水平）色氨酸操纵子基因表达的弱化（转录水平）基因表达的弱化（转录水平）色氨酸操纵子核糖核酸开关（转录水平、翻译水平）核糖核酸开关（转录水平、翻译水平）翻译的控制翻译的控制 （翻译水平）（翻译水平）酶分子降解的调节（翻译后水平）酶分子降解的调节（翻译后水平）2.4.2酶表达水平的调节底物诱导（转录水平）13乳糖操纵子乳糖操纵子2.4.2 酶表达水平的调节酶表达水平的调节-底物诱导底物诱导乳糖操纵子2.4.2酶表达水平的调节-底物诱导142024/7/1315基因表达是指基因转录成基因表达是指基因转录成mRNA,然后进一步翻然后进一步翻译成蛋白质的过程。在研究蛋白质的生物合成时译成蛋白质的过程。在研究蛋白质的生物合成时发现基因的表达是受到调节的。最早是法国的发现基因的表达是受到调节的。最早是法国的Jacob和和Monod于于1960年在研究大肠杆菌乳糖代谢年在研究大肠杆菌乳糖代谢时发现参与分解乳糖的酶的基因表达被另一些因时发现参与分解乳糖的酶的基因表达被另一些因子所调节，于是提出了操纵子学说，从而子所调节，于是提出了操纵子学说，从而使人们使人们能够从分子水平认识基因表达的调节。能够从分子水平认识基因表达的调节。每一种生物都含有大量的基因，这些基每一种生物都含有大量的基因，这些基因在生命活动过程中并非同时表达，而是有些基因在生命活动过程中并非同时表达，而是有些基因进行表达，另一些基因则被关闭。在生长发育因进行表达，另一些基因则被关闭。在生长发育过程中，许多基因只在特定的时间或空间进行表过程中，许多基因只在特定的时间或空间进行表达，其余时间或空间则被关闭。达，其余时间或空间则被关闭。2023/8/1415基因表达是指基因转录成2024/7/1316机体能在基因表达过程的任何阶段进行机体能在基因表达过程的任何阶段进行调节，即可在转录、转录后加工及翻译阶段调节，即可在转录、转录后加工及翻译阶段进行调节。原核生物的基因组和染色体结构进行调节。原核生物的基因组和染色体结构比较简单，转录和翻译可在同一时间和位置比较简单，转录和翻译可在同一时间和位置上发生，基因表达的调节主要在上发生，基因表达的调节主要在转录水平转录水平上上进行。真核生物由于存在细胞核结构的分化，进行。真核生物由于存在细胞核结构的分化，转录和翻译过程在时间和空间上被彼此隔开，转录和翻译过程在时间和空间上被彼此隔开，且在转录和翻译后还有复杂的加工过程，因且在转录和翻译后还有复杂的加工过程，因此基因表达在不同水平上都要进行调节。此基因表达在不同水平上都要进行调节。2023/8/1416机体能在基因表达2024/7/1317 原核基因表达的调控 一、操纵子 二、乳糖操纵子的表达调控 2023/8/1417原核基因表达的调控一、操纵子2024/7/1318一、操纵子(operon)细菌能随环境的变化，迅速改变某些基因表达的状态，这就是很好的基因表达调控的实验模型。人们就是从研究这种现象开始，打开认识基因表达调控分子机理的窗口的。2023/8/1418一、操纵子(operon)2024/7/13191.操纵子的提出 大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖，当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先利用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间的适应，就能利用乳糖，细菌继续呈指数式繁殖增长。2023/8/14191.操纵子的提出大肠2024/7/13202023/8/14202024/7/1321 大肠杆菌利用乳糖至少需要两个酶：促使乳 糖 进 入 细 菌 的 半 乳 糖 透 过 酶(lactose permease)和催化乳糖分解第一步的 半乳糖苷酶(-galactosidase)。2023/8/14212024/7/1322 在环境中没有乳糖或其他-半乳糖苷时，大肠杆菌合成-半乳糖苷酶量极少，加入乳糖2-3分钟后，细菌大量合成-半乳糖苷酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作为唯一碳源时，菌体内的-半乳糖苷酶量可占到细菌总蛋白量的3%。在上述二阶段生长细菌利用乳糖再次繁殖前，也能测出细菌中-半乳糖苷酶活性显著增高的过程。2023/8/1422在环境中没有乳糖或其他2024/7/13232023/8/14232024/7/1324 这种典型的诱导现象，是研究基因表达调控极好的模型。针对大肠杆菌利用乳糖的适应现象，法国的Jocob和Monod等人做了一系列遗传学和生化学研究实验，于1961年提出乳糖操纵子（lac operon）学说。2023/8/1424这种典型的诱导现象，是研究基因2024/7/1325据外媒报道，1965年诺贝尔医学或生理学奖得主之一、法国分子遗传学家弗朗索瓦雅各布（FrancoisJacob）于2013年4月19日在法国巴黎逝世，享年92岁。雅各布1920年6月17日生于法国东北部城市南锡，1947年获得巴黎大学医学博士学位。在他的研究生涯中，雅各布与JacquesLucienMonod、AndreLwoff在微生物遗传调控方面微生物遗传调控方面做出了杰出的贡献。最显著的贡献是确立了最显著的贡献是确立了Jacob-Monod操纵操纵子模型，解释了原核基因调控的原理。子模型，解释了原核基因调控的原理。他还研究了作为DNA和核糖体之间媒介，mRNA参与蛋白质合成的作用机制。这些工作，让FrancoisJacob与JacquesLucienMonod、AndreLwoff分享了1965年诺贝尔医学或生理学奖。2023/8/1425据外媒报道，192024/7/1326CollaborationbetweenmentorandstudentwonaNobelPrize.Ithasnotbeencommoninthehistory.Onlytheluckyones,whowerewillingtosharethecreditandlivedlong,pannedoutintheend.ThatwaswhyIrememberthisstory:Theteacher-studentteam:FranoisJacob(1920-2013),student.JacquesMonod(1910-1976),Lwoffscolleauge.AndrLwoff(1902-1994),Jacobsmentor.Notableawards:1965NobelPrizeinMedicine.Hesharedthe1965NobelPrizeinMedicinewithJacquesMonodandAndrLwoff(1902-1994).2023/8/1426Collaborationbetwe2024/7/1327业内人士评论认为，沃森和克里克发现了DNA结构，雅各布等人的工作则揭示了遗传信息如何传递。AnythingfoundtobetrueofE.colimustalsobetrueofelephants,claimedbyJacquesMonod.“大肠杆菌的基因调控的任何发现,也适用于大象基因调控。”2023/8/1427业内人士评论认2024/7/13282.操纵子的基本组成 乳糖操纵子模型已被许多研究实验所证实，对其有了更深入的认识，并且发现其他原核生物基因调控也有类似的操纵子组织，操纵子是原核基因表达调控的一种重要的组织形式，大肠杆菌的基因多数以操纵子的形式组成基因表达调控的单元。下面就以乳糖操纵子为例子说明操纵子的最基本的组成元件（elements）。2023/8/14282.操纵子的基本组成2024/7/1329它由依次排列的调节基因、cAMP受体蛋白CRP位点、启动子、操纵基因和3个相连的编码利用乳糖的酶的结构基因组成。2023/8/1429它由依次排列的调节基因2024/7/1330(1)结构基因群 操纵子中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因(structural gene,SG)。一个操纵子中含有2个以上的结构基因，多的可达十几个。每个结构基因是一个连续的开放阅读框(open reading frame),5端有起始密码ATG，3端有终止密码TAA、TGA或TAG。各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群。2023/8/1430(1)结构基因群操纵2024/7/1331 至少在第一个结构基因5侧具有核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)，因而当这段含多个结构基因的DNA被转录成多顺反子mRNA，就能被核糖体所识别结合、并起始翻译。核糖体沿mRNA移动，在合成完第一个编码的多肽后，核糖体可以不脱离mRNA而继续翻译合成下一个基因编码的多肽，直至合成完这条多顺反子mRNA所编码的全部多肽。2023/8/1431至少在第一个结构基因52024/7/1332 乳糖操纵子含有、和3个结构基因。基因长3510bp，编码含1170个氨基酸、分子量为135,000的多肽，以四聚体形式组成有活性的-半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖(allolactose)，再分解为半乳糖和葡萄糖；2023/8/1432乳糖操纵子含有、和3个2024/7/1333基因长780bp，编码有260个氨基酸、分子量为30,000的半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌；基因长825bp，编码275氨基酸、分子量为32,000的转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。2023/8/1433基因长780bp，编码有260个氨2024/7/1334 基因5侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位点（RBS）特征的Shine-Dalgarno(SD)序列，因而当乳糖操纵子开放时，核糖体能结合在转录产生的mRNA上。由于、三个基因头尾相接，上一个基因的翻译终止密码靠近下一个基因的2023/8/1434基因5侧具有大肠杆菌2024/7/1335翻译起始密码，因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子（polycistron）mRNA移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白质后，不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的蛋白质，一气依次合成这基因群所编码所有的蛋白质。2023/8/1435翻译起始密码，因而同一个核糖体能沿此2024/7/13362023/8/14362024/7/1337(2)(2)启动子启动子 启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。操纵子至少有一个启动子，一般在第一个结构基因5侧上游，控制整个结构基因群的转录。用RNA聚合酶与分离的一段DNA双链混合，再加入外切核酸酶去水解DNA，结果只有被RNA聚合酶识别结合而被保护的那段DNA不被水解，由此可以测出启动子的范围及其序列。2023/8/1437(2)启动子启动子(2024/7/1338(3)(3)操纵区操纵区 操纵区（operator）是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，常与启动子邻近或与启动子序列重叠，当调控蛋白结合在操纵子序列上，会影响其下游基因转录的强弱。2023/8/1438(3)操纵区操纵区（2024/7/1339以乳糖操纵子中的操纵区为例，其操纵区（o）序列位于启动子（p）与被调控的基因之间，部分序列与启动子序列重叠。仔细分析操纵区序列，可见这段双链DNA具有回文（palindrome）样的对称性一级结构，能形成十字形的茎环（stem loop）构造。不少操纵区都具有类似的对称性序列，可能与特定蛋白质的结合相关。2023/8/1439以乳糖操纵子中的操纵区为例，其操纵2024/7/1340阻遏蛋白与操纵区结合，就妨碍了RNA聚合酶与启动子的结合及其后-半乳糖苷酶等基因的转录起始，从而阻遏了这群基因的表达。最早只把与阻遏蛋白结合、起阻遏作用的序列称为操纵区，但其后发现有的操纵子中2023/8/1440阻遏蛋白与操纵区结合，就妨碍了RNA2024/7/1341同一操纵序列与不同构像的蛋白质结合，可以分别起阻遏或激活基因表达的作用，阿拉伯糖操纵子中的操纵序列就是典型的例子。因而凡能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的序列，不论其对基因转录的作用是减弱、阻止或增强、开放，都可称为操纵区。2023/8/1441同一操纵序列与不同构像的蛋白质结合，2024/7/1342（4）调节基因 调节基因(regulatory gene)是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。调控蛋白有：阻遏蛋白(repressive protein)：与操纵区结合后能减弱或阻止其调控的基因转录，其介 导 的 调 控 方 式 为 负 调 控(negative regulation)；2023/8/1442（4）调节基因调节基2024/7/1343激活蛋白(activating protein)：与操纵区结合后能增强或起动其调控的基因转录，所介导的调控方式为正调控(positive regulation)。2023/8/1443激活蛋白(activatingpr2024/7/1344某些特定的物质能与调控蛋白结合，使调控蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响，这些特定物质可称为效应物（effector）。有两种：诱导剂(inducer)：能引起诱导发生的分子；阻遏剂或辅助阻遏剂(corepressor)：能导致阻遏发生的分子。2023/8/1444某些特定的物质能与调控蛋白结合，使2024/7/1345例如在乳糖操纵子中，调节基因lac I位于Plac邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R。在环境没有乳糖存在的情况下，R形成分子量为152,000的活性四聚体，能特异性与操纵区紧密结合，从而阻止利用乳糖的酶类基因的转录，所以R是乳糖操纵子的阻遏蛋白；2023/8/1445例如在乳糖操纵子中，调节基因lac2024/7/1346 当环境中有足够的乳糖时，乳糖与R结合，使R的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵区特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。在这过程中乳糖就是诱导剂，与R结合起到去阻遏作用(derepression)，诱导了利用乳糖的酶类基因转录开放。2023/8/1446当环境中有足够的乳糖时，2024/7/1347 许多调控蛋白都是变构蛋白（allosteric protein），通过与上述类似的方式与效应物结合改变空间构像，从而改变活性，起到调节基因转录表达的作用。2023/8/1447许多调控蛋白都是变构蛋2024/7/1348（5）终止子 终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵子中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。2023/8/1448（5）终止子终止子2024/7/1349 它们都在结构基因的附近，只能对同一条DNA链上的基因表达起调控作用，这种作用在遗传学实验上称为顺式作用（cis-action），启动子、操纵子和终止子就属于顺式作用元件（cis-acting element）。调控基因可以在结构基因群附近、也可以远离结构基因，它是通过其基因产物调控蛋白来发挥作用的，因而调控基因不仅能对同一条DNA链上的结构基因起表达调控作用，而且2023/8/1449它们都在结构基因的附近，只能对2024/7/1350能对不在一条DNA链上的结构基因起作用，在遗传学实验上称为反式作用（trans-action），调控基因就属于反式作用元件（trans-acting element），其编码产生的调控蛋白称为反式调控因子（trans-acting factor）。由此也可窥测到基因表达调控机理的关键在蛋白质与核酸的相互作用上。2023/8/1450能对不在一条DNA链上的结构基因起作用2024/7/1351二、乳糖操纵子的表达调控 2023/8/1451二、乳糖操纵子的表达调控2024/7/13522023/8/14522024/7/13532023/8/14532024/7/13541.阻遏蛋白的负调控 当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac操纵子处于阻遏状态。此基因在其自身的启动子Pi控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。R以四聚体形式与操纵子结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止了基因的转录起动。R的阻遏作用不是绝对的，R与2023/8/14541.阻遏蛋白的负调控2024/7/1355偶尔解离，使细胞中还有极低水平的半乳糖苷酶及透过酶的生成。当有乳糖存在时，乳糖受 半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖，与R结合，使R构象变化，R四聚体解聚成单体，失去与的亲和力，与解离，基因转录开放，使 半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵子的诱导作用。2023/8/1455偶尔解离，使细胞中还有极低水平的半2024/7/13562023/8/14562024/7/1357 一些化学合成的乳糖类似物，不受 半乳糖苷酶的催化分解，却也能与R特异性结合使R构象变化，诱导lac操纵子的开放。例如异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiog-alactoside，IPTG)就是很强的诱导剂；不被细菌代谢而十分稳定。X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷）也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被 半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作 半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。2023/8/1457一些化学合成的乳糖类似物，2024/7/13582023/8/14582024/7/13592.CAP的正调控 细菌中的cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解产生能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。细菌中有一种能与cAMP特异结合的cAMP受体蛋白CRP(cAMP receptor protein)，当CRP未与cAMP结合时它是没有活性的，当cAMP浓度升高时，CRP与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，称为CAP(CRP-cAMP activated protein)，能以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。2023/8/14592.CAP的正调控细2024/7/1360在lac操纵子的启动子Plac上游端有一段序列与Plac部分重叠的序列，能与CAP特异结合，称为CAP结合位点（CAP binding site）。CAP与这段序列结合时，可增强RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50倍。相反，当有葡萄糖可供分解利用时，cAMP浓度降低，CRP不能被活化，lac操纵子的结构基因表达下降。2023/8/1460在lac操纵子的启动子Plac上游2024/7/13612023/8/14612024/7/1362 glucose effect又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用。又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用。葡萄葡萄糖或某些容易利用的碳源，其分解代谢产物阻遏糖或某些容易利用的碳源，其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。如大肠埃希氏菌培养在含葡萄糖和乳糖的培养基如大肠埃希氏菌培养在含葡萄糖和乳糖的培养基上，在葡萄糖没有被利用完之前，乳糖操纵子就上，在葡萄糖没有被利用完之前，乳糖操纵子就一直被阻遏，乳糖不能被利用一直被阻遏，乳糖不能被利用这是因为葡萄糖的分解物引起细胞内这是因为葡萄糖的分解物引起细胞内cAMPcAMP含量降含量降低，启动子释放低，启动子释放cAMP-CAPcAMP-CAP蛋白，蛋白，RNARNA聚合酶不能与聚合酶不能与乳糖的启动基因结合，以至转录不能发生，直到乳糖的启动基因结合，以至转录不能发生，直到葡萄糖被利用完后，乳糖操纵子才进行转录，形葡萄糖被利用完后，乳糖操纵子才进行转录，形成利用乳糖的酶，这种现象称葡萄糖效应成利用乳糖的酶，这种现象称葡萄糖效应 2023/8/1462glucos2024/7/1363由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵子转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。lac操纵子的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。通过这机制，细菌是优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。2023/8/1463由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖2024/7/1364细菌对葡萄糖以外的其他糖（如阿拉伯糖、半乳糖、麦芽糖等）的利用上也有类似对乳糖利用的情况，在含有编码利用阿拉伯糖的酶类基因群的阿拉伯糖操纵子（ara operon）、半乳糖操纵子（gal operon）中也有CAP结合位点，CAP也起类似的正性调控作用。所以CAP的通用名称是分解代谢基因激活蛋白（catabolic gene activator protein）。2023/8/1464细菌对葡萄糖以外的其他糖（如阿拉伯2024/7/1365不难看出：CAP结合位点就是一种起正性调控作用的操纵子，CAP则是对转录起正性作用的调控蛋白激活蛋白，编码CRP的基因也是一个调控基因，不过它并不在lac操纵子的附近，CAP可以对几个操纵子都起作用。从上所述，乳糖操纵子属于可诱导操纵子（inducible operon），这类操纵子通常使是关闭的，当受效应物作用后诱导开放转录。这类操纵子使细菌能适应环境的变化，最有效地利用环境能提供的能源底物。2023/8/1465不难看出：CAP结合位点就是一种起2024/7/1366乳糖操纵子的诱导乳糖操纵子的诱导 2023/8/1466乳糖操纵子的诱导2024/7/1367图例说明：一些基因调控蛋白可以控制基因转录的开启和关闭，大肠杆菌的乳糖操纵子就是这样一个双重控制的例子。葡萄糖和半乳糖的水平控制着乳糖操纵子转录的起始，决定操纵子是“开”还是“关”。1.培养大肠杆菌时，如果不加入半乳糖，一个抑制蛋白就会结合到操纵子上，阻止RNA聚合酶转录操纵子基因。此时操纵子就处于关闭状态;2.当加入诱导物半乳糖后，半乳糖就会和抑制蛋白结合，并改变抑制蛋白的构象使得它不能结合到操纵子上。只要没有抑制蛋白的结合，RNA聚合酶就可以识别启动子并转录操纵子的结构基因，得到mRNA。此时操纵子是开启的。2023/8/1467图例说明：2.4.2 酶表达水平的调节酶表达水平的调节-终产物阻遏终产物阻遏2.4.2酶表达水平的调节-终产物阻遏68代谢工程与调控-第三章课件69代谢工程与调控-第三章课件70代谢工程与调控-第三章课件71代谢工程与调控-第三章课件72代谢工程与调控-第三章课件73代谢工程与调控-第三章课件74代谢工程与调控-第三章课件75代谢工程与调控-第三章课件76代谢工程与调控-第三章课件77代谢工程与调控-第三章课件78代谢工程与调控-第三章课件79代谢工程与调控-第三章课件80代谢工程与调控-第三章课件81代谢工程与调控-第三章课件82代谢工程与调控-第三章课件83代谢工程与调控-第三章课件84代谢工程与调控-第三章课件85代谢工程与调控-第三章课件86代谢工程与调控-第三章课件87代谢工程与调控-第三章课件88代谢工程与调控-第三章课件89代谢工程与调控-第三章课件90核糖核酸开关2.4.2 酶表达水平的调节酶表达水平的调节核糖核酸开关2.4.2酶表达水平的调节91Riboswitch Regulation ofGene ExpressionRiboswitch Regulation of92Riboswitches are present in untranslated regions of mRNAs.Their purpose is to regulate gene expression in response to binding small molecule metabolites.Riboswitches are defined by two main criteria:Direct(protein-free)binding of metabolite to RNAMetabolite-dependent regulation of genesThis movie demonstrates the molecular events common to most bacterial riboswitches.Resources are listed at the end of the movie.Riboswitches are present in un93Part I:Gene Regulation by aTypical RiboswitchPart I:94Bacterial riboswitches are present in the 5 untranslated region of mRNAs.Transcription is regulated by the gene promoter and transcription initiation factors Bacterial riboswitches are pre95RNA polymerase initiates transcription.The RNA folds intramolecularly in local regions of complementarity,presumably,while transcription is proceeding.A long untranslated leader is produced first.Nascent RNARNApolymeraseDNA templateRNA polymerase initiates trans96RNApolymeraseCase 1:Cellular concentration of metabolite is too low to occupy the riboswitch binding site.Transcription and 3421RNApolymeraseRNACase 1:Cellular concentrati97UUUUUAUGRNApolymeraseCase 1:Cellular concentration of metabolite is too low to occupy the riboswitch binding site.Transcription and intramolecular RNA folding continue.34213421UUUUUAUGRNACase 1:Cellular con98UUUUUAUGCase 1:Cellular concentration of metabolite is too low to occupy the riboswitch binding site.Translation is initiated.RibosomeTypically the new mRNA codes for a biosynthetic or transport protein that raises the intracellular level of the metabolite.Gene regulation(next case)is accomplished by variations in the interactions of the regions highlighted in orange.Transcription and intramolecular RNA folding continue.3421UUUUUAUGCase 1:Cellular concen99Case 2:Cellular concentration of metabolite(X)is high.Intramolecular folding can lead to an alternate conformation.RNA polymerase produces the long untranslated leader region.The alternate riboswitch conformation is stable when metabolite is bound.XXXXXRNApolymeraseXNascent RNADNA templateCase 2:Cellular concentration 100Case 2:Cellular concentration of metabolite(X)is high.Intramolecular folding can lead to an alternate conformation.RNA polymerase produces the long untranslated leader region.The alternate riboswitch conformation is stable when metabolite is bound.XXXXXXTranscription continues.UUUUURNApolymerase3421Case 2:Cellular concentration 101Case 2:Cellular concentration of metabolite(X)is high.XXXXXTranscription continues.RNApolymeraseNow,RNA folding leads to formation of an intrinsic terminator.UUUUUXX34213421Case 2:Cellular concentration 102Case 2:Cellular concentration of metabolite(X)is high.XXXXXTranscription continues.RNApolymeraseNow,RNA folding leads to formation of an intrinsic terminator.UUUUUXThe transcript is never completed and the metabolite biosynthetic or transport protein is not produced.3421Case 2:Cellular concentration 103ReviewCase 1:Metabolite is limited.Case 2:Metabolite is abundant.UUUUUXUUUUUAUGORFTranscription is completed.Biosynthetic and/or transport proteins are expressed.Transcription is terminated.Proteins are downregulated.XXXX34213421ReviewCase 1:Metabolite is lim104Part II:The Expanding Universeof RiboswitchesPart II:105 an expression platform for gene regulation.A metabolite-bindingaptamer domain and Riboswitch FunctionsUUUUUX3421Riboswitches were defined earlier by two main criteria:Direct(protein-free)binding of metabolite to RNAMetabolite-dependent regulation of genesThese two activities are accomplished by two functionally separate domains on the RNA:an expression platform for106 an expression platform for gene regulation.A metabolite-bindingaptamer domain and Riboswitch FunctionsUUUUUX3421Direct(protein-free)binding of metabolite to RNAMetabolite-dependent regulation of genesThese two activities are accomplished by two functionally separate domains on the RNA:Because of the modular nature of RNA structures,different types of expression platform can be linked to the conserved aptamer domain.This leads to variations in riboswitch mechanism an expression platform for107Riboswitch MechanismsThis movie showed the most common case for bacterial riboswitches:Ligand binding leads totranscription termination and reduced gene expression.UUUUUX5ORFXRiboswitch MechanismsThis movi108Riboswitch MechanismsRiboswitches also regulate translation and anti-termination Ligand binding leads totranscription termination and reduced gene expression.UUUUUX5ORFLigand binding sequestersthe Shine-Dalgarno sequence and reduces gene expression.Ligand binding leads toantiterminator formation and increased gene expression.UUUUUX5AUGORFXXX5AUGORFAGGAGGXRiboswitch MechanismsRiboswitc109Riboswitch MechanismsThey also affect RNA integrity,and perhaps splicing and stability.Ligand binding leads tomRNA cleavage by a new natural ribozyme.X5Ligand binding could controlsplicing in eukayotes.Possibly,ligand binding to the 3 untranslated region could affect mRNA stability.AUGORFX5AUGORFAGGUACGGAAAAAX5AUGORFXRiboswitch MechanismsThey also110Riboswitch LigandsFigure shows the chemical structures of riboswitch ligands and schematics of conserved secondary structure in riboswitches.There are 8 confirmed riboswitches with unique metabolite ligands.Many more conserved RNA motifs are currently under investigation.Riboswitch LigandsFigure shows111Riboswitch Gene RegulationRiboswitches are an important mechanism of gene regulation.For example,nearly 2%of the genes of the model organism Bacillus subtilis appear to be controlled by riboswitches.Riboswitch Gene RegulationRibo112Metabolite RecognitiontRNARiboswitch11-mer TRAP complexCoenzymeB12Average metaboliteRelative sizes of some molecules recognized for gene regulation(metabolites and tRNAs)and some agents that recognize them(riboswitches and TRAP complex).Riboswitches are an economical way to see small moleculesMetabolite RecognitiontRNARibo113代谢工程与调控-第三章课件114核糖开关 是一类位于mRNA 3或5-UTR上的能够结合小分子代谢物以调控基因的转录和翻译的mRNA元件 它与小分子代谢物的结合不依赖于任何蛋白质，从而使构象发生改变，在转录或翻译水平调控基因的表达。核糖开关 是一类位于mRNA 3或5-UTR115到目前为至已经发现了不少于12种核糖开关：维生素B12核糖开关 硫胺素焦磷酸（TPP）核糖开关 FMN（黄素单核苷酸）核糖开关 SAM（S-甲腺甲硫氨酸）核糖开关 赖氨酸核糖开关 鸟嘌呤核糖开关 腺嘌呤核糖开关 GlmS核糖开关（调控葡糖胺-6-磷酸合成）甘氨酸核糖开关 mgtA核糖开关（mgtA为沙门氏菌Mg2+转运载体）SAH核糖开关(调控S-腺苷同型半胱氨酸)preQ1核糖开关(调控Q核苷前体7-甲氨基-7去氮鸟嘌呤（7-aminomethyl-7-deazaguanine）合成)到目前为至已经发现了不少于12种核糖开关：116核糖开关如果按作用类型可分为 抑制型（即底物存在时抑制基因表达）激活型（当底物存在时基因开始表达）其中已知的绝大部分核糖开关都是抑制型，只有腺嘌呤核糖开关是激活型。核糖开关如果按作用类型可分为117如按存在位置核糖开关可分为:3UTR核糖开关 5UTR核糖开关 到目前为止只有TPP核糖开关在不同物种中存在的位置不一样，TPP核糖开关在高等植物中位于3UTR，而在细菌、真菌和绿藻中则位于5UTR。其它的核糖开关均位于5UTR。如按存在位置核糖开关可分为:118核糖开关的结构特点：核糖开关主要由适体结构域（aptamer domain,AD）和表达结构域(expression domain,EPD)组成；AD序列保守，不需要蛋白质的参与，直接与小分子（即适体，aptamer）代谢物结合，AD在核糖开关中主要起RNA传感器的作用。EPD序列不保守，是核糖开关的表达模块，它的主要功能是在AD与适体结合后，引起AD构象变化后迅速作出反应，导致EPD构象变化，通过变构效应调控基因表达。核糖开关的结构特点：119核糖开关的一般作用机制核糖开关的一般作用机制 不同的核糖开关有不同的作用机制。目前普遍认为核糖开关主要在转录和翻译两个水平上对基因表达进行调控，分为抑制和激活两类。适体与AD特异性结合，使EPD构象发生变化，形成有选择性的茎环结构，导致mRNA转录提前结束或者抑制翻译的起始。核糖开关的一般作用机制 不同的核糖开关有不同的作用机120转录水平的调控：在mRNA末端存在“抗抗终止子”、“抗终止子”、“终止子”。当AD未与适体结合时，抗终止子与终止子结合，使转录顺利进行；当AD与适体结合后，导致mRNA构象发生变化，抗抗终止子与抗终止子结合，从而终止子形成发夹结构，转录终止。转录水平的调控：121翻译水平的调控：在起始密码上游，存在“抗抗SD”，“抗SD”，“SD”序列。当AD未与适体结合时，抗抗SD与抗SD结合，使翻译顺利进行；当AD与适体结合后，使抗SD与SD结合，导致翻译不能进行。翻译水平的调控：122腺嘌呤核糖开关的作用机制 腺嘌呤核糖开关的AD主要由三个螺旋（P1，P2，P3）组成，他们的形状好像一个倒置的“h”，P1与P3同轴，P1在下，P3在上，P2在P3的左侧，腺嘌呤结合位点在三个螺旋的结合处，其中P2和P3存在着两个的G-C 碱基对（G37与C61，G38与C60），它们在AD空间构象发生改变时，起着十分重要的作用。腺嘌呤核糖开关的作用机制 腺嘌呤核糖开关的AD123 Lemay等认为AD存在两种构象，即“U”和“F”；当腺嘌呤不存在时，P3上的两个的G-C 碱基对与P2之间的氢键发生断裂，导致P2与P3一端分开，P1、P2、P3之间较为分散，此时的构象称之为“U”；当腺嘌呤存在时，P2与P3之间又形成了氢键并结合在一起，从而P1、P2和P3折叠在一起，准备与腺嘌呤结合，即为“F”。Lemay等认为AD存在两种构象，即“U”和“F”124代谢工程与调控-第三章课件125代谢工程与调控-第三章课件126TPP核糖开关的作用机制 TPP核糖开关主要由五个螺旋（P1，P2，P3，P4，P5）组成一个倒置的“h”型;其中P1，P2，P3同轴，P3在上，P2居中，P1在下。P4，P5同轴，P5在上，P4在下。P1，P2，P3与TPP的嘧啶部分连接，P4，P5与TPP的焦磷酸盐部分连接。TPP核糖开关的作用机制 TPP核糖开关主要由五127 TPP的嘧啶环的连接部位在P3与P2结合部J3/2；在J3/2存在一段十分保守的序列UGAGA；其中U39与A43能够形成U-A碱基对，这就使得G40，A41和G42能够形成一段弧，有利于与TPP的嘧啶环结合，TPP的嘧啶通过氢键与G42连接在一起。TPP的焦磷酸盐部分通过二价的金属离子与P4，P5的结合部位J4/5中的G78连接在一起。TPP的嘧啶环的连接部位在P3与P2结合部J3/128 当外界环境中的TPP浓度低于TPP核糖开关的亲和力时，TPP核糖开关不能与TPP结合，从而使TPP的合成顺利进行。当TPP浓度达到TPP核糖开关的亲和力时，TPP核糖开关便与TPP结合，这时TPP核糖开关的AD空间构象发生改变，形成有选择性的茎环状结构导致