第三章工具酶之二(教学)教学课件

基因工程需要的基本条件用于核酸操作的工具酶（第三章）用于基因克隆的载体（第四章）用于基因转移的受体菌或细胞（第五章）第三章 用于核酸操作的工具酶 (内容：可扩展至回文结构)用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶回文结构及限制性核酸内切酶部分（PPT）关于反应体系及注意问题某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变（酶的识别序列特异性发生改变（P46）Star活性活性：又称又称星活性，星活性，在在甘油浓度甘油浓度、离子强度离子强度、pH值值、有机溶剂有机溶剂、二价阳离子二价阳离子、酶与酶与DNA的比的比例例等参数单独或同时发生改变时，会导致限制等参数单独或同时发生改变时，会导致限制酶的识别序列特异性发生改变，在酶的识别序列特异性发生改变，在DNA内产生内产生附加切割，称为附加切割，称为Star活性活性（限制酶的第二活性）（限制酶的第二活性）。能产生第二活性的酶常在酶名称的右上角加一能产生第二活性的酶常在酶名称的右上角加一星号星号“”，如，如EcoR。几乎所有的限制酶都具有几乎所有的限制酶都具有Star活性。活性。Star活性的影响：活性的影响：导致切割中出现非特异性导致切割中出现非特异性DNA片段，甚至不能获得预计的片段，甚至不能获得预计的DNA片段，片段，影响进一步的影响进一步的DNA连接重组。连接重组。排除方法排除方法：排除产生：排除产生Star活性的条件。如降低活性的条件。如降低反应系统中甘油含量，控制反应系统中甘油含量，控制pH中性和高盐中性和高盐浓度下进行反应。浓度下进行反应。反应系统包括：反应系统包括：酶酶、底物底物、反应缓冲液反应缓冲液、合合适的反应适的反应温度温度等。等。1、底物、底物DNA 限制酶的催化效率与限制酶的催化效率与DNA样品纯度、样品纯度、DNA分子构分子构型、识别序列两侧序列长短以及序列碱基甲基化等型、识别序列两侧序列长短以及序列碱基甲基化等密切相关。密切相关。DNA纯度；纯度；DNA分子构型；分子构型；（线形（线形DNA超螺旋和环形超螺旋和环形DNA）识别序列的侧面序列；识别序列的侧面序列；位点偏爱；位点偏爱；DNA甲基化。甲基化。1、限制性核酸内切酶反应系统、限制性核酸内切酶反应系统2、限制性核酸内切酶用量、限制性核酸内切酶用量主要取决于主要取决于酶本身的催化活性酶本身的催化活性和和底物底物DNA样品样品 1酶活性单位酶活性单位（unit或或U）：某种限制性核酸内）：某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下，切酶在最适反应条件下，60 min内完全切割内完全切割 1g DNA所需的酶活性。所需的酶活性。酶活性高的用量少，反之则多。酶活性高的用量少，反之则多。能被高效切割的能被高效切割的DNA样品用酶量少，反之则多。样品用酶量少，反之则多。等量的两种等量的两种DNA样品，限制酶识别序列密度大样品，限制酶识别序列密度大的用酶量多，反之则少。的用酶量多，反之则少。3、限制性核酸内切酶反应缓冲液、限制性核酸内切酶反应缓冲液包含：包含：氯化镁氯化镁或或醋酸镁醋酸镁、氯化钠氯化钠或或醋酸钾醋酸钾、二硫二硫苏糖醇苏糖醇(DTT)或或-巯基乙醇巯基乙醇(2-Me)、Tris-HCI或或Tris-Ac。4、限制性核酸内切酶反应温度、限制性核酸内切酶反应温度大多数的最适反应温度是大多数的最适反应温度是37，而少数酶，而少数酶的最适反应温度高于或低于的最适反应温度高于或低于37。附：附：5、DNA分子的限制性图谱限制酶图谱限制酶图谱（restriction map）:描述染色体上限制性描述染色体上限制性内切酶切割位点之间内切酶切割位点之间距离距离和和顺序顺序的图谱。的图谱。II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II 型核酸内切酶的多酶切法注意（教材P48）：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：1、使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解。2、低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的5 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇 冰浴5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥影响限制性核酸内切酶活性的因素1.DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等 措施：加大酶的用量，1g DNA 用10U 酶 加大反应总体积 延长反应时间2.DNA样品的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5 GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamHI、Bgl II、Sau3A I不受影响大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基3.核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5 PuPuATPyPy3或者5 AATT3DNA连接酶：大肠杆菌DNA连接酶 T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）（Klenow）酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5 粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列附：限制性核酸内切酶类型附：限制性核酸内切酶类型(参考参考资料资料)（P34表表2-5）型限制酶型限制酶型限制酶型限制酶型限制酶型限制酶（1）型限制酶（无用）型限制酶（无用）分子量：分子量：30万万dal左右左右组成：组成：3种亚基种亚基a.特异性亚基：具特异性识别特异性亚基：具特异性识别DNA序列的特性。序列的特性。b.修饰亚基：具甲基化酶活性。修饰亚基：具甲基化酶活性。c.限制亚基：具核酸内切酶活性。限制亚基：具核酸内切酶活性。辅助因子：需辅助因子：需Mg2+、ATP和和S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸（SAM）。）。识别和切割位点：不一致（距识别位点识别和切割位点：不一致（距识别位点5一侧一侧数千碱基处随机切割数千碱基处随机切割DNA分子）。分子）。（2）型限制酶（十分有用）型限制酶（十分有用）分子量：分子量：2万万10万万dal（较小）（较小）组成：组成：一种多肽，常以同源二聚体形式一种多肽，常以同源二聚体形式存在。存在。辅助因子：辅助因子：无需辅助因子，或只需无需辅助因子，或只需Mg2+。识别和切割位点：识别和切割位点：相一致。相一致。（3）型限制酶（无用）型限制酶（无用）组成：组成：两个亚基两个亚基a.M亚基：负责位点的识别与修饰。亚基：负责位点的识别与修饰。b.R亚基：具核酸酶的活性。亚基：具核酸酶的活性。辅助因子：辅助因子：需需Mg2+、ATP和和SAM 识别和切割位点识别和切割位点：不一致（距识别位：不一致（距识别位点点3一侧约一侧约25bp处切割处切割DNA分子）。分子）。二、二、型限制酶的特性型限制酶的特性 1、不同限制酶能专一地识别不同的特异、不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列核苷酸序列6个（大多数）：个（大多数）：如如EcoR 5-GAATTC-3 Hind 5-AAGCTT-3 BamH 5-GGATCC-3识别序列识别序列（P36）6个：个：如如Not 5-GCGGCCGC-3（8个）个）有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。如：如：Sau3A识别识别：GATC BamH识别识别：GGATCC有的限制酶识别多种核苷酸序列。有的限制酶识别多种核苷酸序列。如：如：Hind识别识别 4种核苷酸序列：种核苷酸序列：5-CTPyPuAC-3 （Py嘧啶碱基嘧啶碱基C或或T；Pu 嘌呤碱基嘌呤碱基A或或G）类限制酶识别序列特点类限制酶识别序列特点回文序列回文序列 （旋转对称或二重互补对称）旋转对称或二重互补对称）GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG5353限制酶：限制酶：BamH 该段的碱基序列的互补链之间正读反读都相同该段的碱基序列的互补链之间正读反读都相同单链以识别序列中线为对称轴，左右两侧的碱基互补单链以识别序列中线为对称轴，左右两侧的碱基互补双链旋转双链旋转180度后，都能与自身重合。度后，都能与自身重合。识别序列可以以识别序列可以以5 3走向的单链走向的单链DNA表示。表示。2.各种限制酶的识别序列具有共同的规律性各种限制酶的识别序列具有共同的规律性3、识别序列出现的概率、识别序列出现的概率1/4n（n为识别序列所含核苷酸的数目）为识别序列所含核苷酸的数目）规律：规律：（1）识别序列）识别序列短短，出现概率，出现概率大大；识别序列；识别序列长长，出，出现概率现概率小小（2）富）富AT的识别序列在富的识别序列在富AT的的DNA分子中出现分子中出现的概率的概率高高，在富，在富GC的的DNA分子中出现的概率分子中出现的概率低低;富富GC的识别序列在富的识别序列在富GC的的DNA分子中出现分子中出现的概率的概率高高，在富，在富AT的的DNA分子中出现的概率分子中出现的概率低低;稀切酶稀切酶 有有较长的识别序列较长的识别序列和和富含富含GC或或AT的的识别序列识别序列的限制性核酸内切酶的限制性核酸内切酶.在基因操作中使用稀切酶可获得大的在基因操作中使用稀切酶可获得大的片段。片段。限制酶切割位点DNA在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点，用或/表示。如：G GATCC、AT CGAT等；少数位点在识别序列两侧，如：GATC、CATG 4、各种限制酶的切割类型是各式各、各种限制酶的切割类型是各式各样的，切割后形成各种粘性末端或样的，切割后形成各种粘性末端或平（齐）末端平（齐）末端(b)5（P单链延伸的）粘性末端单链延伸的）粘性末端粘性末端（粘端）粘性末端（粘端）G 3 5 AATTCCTTAA GGAATTCCTTAAG如：如：Eco R53535353(a)3（OH单链延伸的）粘性末端单链延伸的）粘性末端CTGCA 3 5 GG ACGTCCTGCAGGACGTC如：如：Pst 53535353（1）粘性末端和平（齐）末端）粘性末端和平（齐）末端平头末端（平端）平头末端（平端）CCC GGGGGG CCCCCCGGGGGGCCC如：如：Smal 53535353同尾酶（同尾酶（isocaudamerisocaudamer）有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然来来源源各各异异，识识别别序序列列也也各各不不相相同同，但但切切割割DNADNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，这这一一类类限限制制酶酶特特称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称为称为配伍未端配伍未端。Bam Bam HHBglBgl GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A（2）两种特殊的限制酶：）两种特殊的限制酶：同尾酶同尾酶和和同裂酶同裂酶同裂酶（同裂酶（isoschizomer）来来源源不不同同，但但识识别别序序列列相相同同，这这类类酶酶特特称称为为同裂酶同裂酶。同裂酶的切点位置可相同或不同。同裂酶的切点位置可相同或不同。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst（a）切点位置相同）切点位置相同CCCGGGGGGCCCCGGGCCCCGGG C+XmaCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+Sma（b）切点位置不相同）切点位置不相同