免疫学技术课件

免疫学技术免疫学技术1经典的免疫学方法：经典的免疫学方法：一、凝集反应（一、凝集反应（agglutination）细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块的反应。合后形成凝集团块的反应。1、直接凝集反应直接凝集反应2、间接凝集反应、间接凝集反应3、间接凝集抑制反应、间接凝集抑制反应2经典的免疫学方法：233二、沉淀反应（二、沉淀反应（precipitation）血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物的反应。性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物的反应。1、单向免疫扩散（、单向免疫扩散（singleimmunodiffusion）2、双向免疫扩散（、双向免疫扩散（doubleimmunodiffusion）3、免疫电泳（、免疫电泳（immunoelectrophoresis）4、火箭免疫电泳（火箭免疫电泳（rocketimmunoelectrophoresis）5、免疫浊度测定（、免疫浊度测定（immunonephelometry）4二、沉淀反应（precipitation）455667788大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静继续保持安静9大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静91010免疫浊度测定：免疫浊度测定：可溶性可溶性Ag+Ab，二者比例合适时，在特殊的缓冲二者比例合适时，在特殊的缓冲液中快速形成一定的液中快速形成一定的AgAb复合物，使反应液出复合物，使反应液出现浊度。现浊度。透射比浊法透射比浊法散射比浊法散射比浊法速率散射比浊法速率散射比浊法终点散射比浊法终点散射比浊法11免疫浊度测定：111212一定要保持抗体过量，以维持抗原抗体复合物的相一定要保持抗体过量，以维持抗原抗体复合物的相对不溶解性。对不溶解性。13一定要保持抗体过量，以维持抗原抗体复合物的相13该方法的分析范围主要检测的是血浆、体液该方法的分析范围主要检测的是血浆、体液中特定蛋白系列。如中特定蛋白系列。如Ig、补体、血浆蛋白、补体、血浆蛋白、炎性反应蛋白、一些小分子量的治疗性药物炎性反应蛋白、一些小分子量的治疗性药物浓度等。浓度等。14该方法的分析范围主要检测的是血浆、体液14第一节第一节 免疫学检测常用标记技术免疫学检测常用标记技术15第一节 免疫学检测常用标记技术15免疫标记技术（免疫标记技术（immunolabellingtechnique）指用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电指用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电子致密物质（胶体金、铁蛋白）作为示踪剂标子致密物质（胶体金、铁蛋白）作为示踪剂标记抗体或抗原进行的抗原记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。抗体反应。优优点点：高高灵灵敏敏度度、特特异异性性、快快速速，能能定定性性、定定量量、定位测定，易于观察结果并适合自动化检测。定位测定，易于观察结果并适合自动化检测。总体分为：免疫组化：定位检测组织或细胞中的总体分为：免疫组化：定位检测组织或细胞中的Ag/Ab免疫测定：定量检测液体标本中的免疫测定：定量检测液体标本中的Ag/Ab也也可可分分为为：荧荧光光免免疫疫技技术术，放放射射免免疫疫技技术术，酶酶免免疫技术，化学发光免疫技术及免疫金标记技术等疫技术，化学发光免疫技术及免疫金标记技术等。16免疫标记技术（immunolabelling techniq一、酶免疫技术一、酶免疫技术基本原理：以酶标记抗体（或抗原）用于免疫检基本原理：以酶标记抗体（或抗原）用于免疫检测，通过相应底物被酶解后的显色反应，对标本测，通过相应底物被酶解后的显色反应，对标本中的抗原中的抗原/抗体进行定量、定位分析。抗体进行定量、定位分析。标记物：酶（催化底物：生物放大作用）标记物：酶（催化底物：生物放大作用）特点：灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标记特点：灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标记试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全易行，容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广易行，容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。的新方法。17 一、酶免疫技术17（一）常用的酶和酶作用底物（一）常用的酶和酶作用底物1、辣根过氧化物酶（、辣根过氧化物酶（HRP）HRP来源于植物辣根中，分子量来源于植物辣根中，分子量40KD，由主酶，由主酶（糖蛋白）和辅基（亚铁血红素）组成的复合物。（糖蛋白）和辅基（亚铁血红素）组成的复合物。HRP常用的底物有：常用的底物有：（1）邻苯二胺（）邻苯二胺（OPD）OPD显色后为橙黄色，加入终止液为棕黄色，可溶性产显色后为橙黄色，加入终止液为棕黄色，可溶性产物，应用最早，但配成溶液后稳定性差，且有潜在的致物，应用最早，但配成溶液后稳定性差，且有潜在的致癌性，显色反应需避光。癌性，显色反应需避光。（2）四甲基联苯胺（）四甲基联苯胺（TMB）TMB经酶作用呈兰色，可溶性产物，加酸终止后黄色，经酶作用呈兰色，可溶性产物，加酸终止后黄色，稳定性好，显色反应无需避光，无致突变作用。应用最稳定性好，显色反应无需避光，无致突变作用。应用最广泛。但水溶性差。广泛。但水溶性差。18（一）常用的酶和酶作用底物182、碱性磷酸酶（、碱性磷酸酶（AP）AP从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，菌源性从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，菌源性活力小于小肠粘膜活力。活力小于小肠粘膜活力。AP价格较价格较HRP高，高，稳定性差，但敏感度高，空白值低。稳定性差，但敏感度高，空白值低。可催化对硝基苯磷酸酯（可催化对硝基苯磷酸酯（p-NPP），生成黄色），生成黄色的对硝基酚，的对硝基酚，NaOH终止后黄色可稳定存在一终止后黄色可稳定存在一段时间（段时间（405nm）。）。19 2、碱性磷酸酶（AP）19（二）酶免疫技术的分类（二）酶免疫技术的分类酶免疫组化酶免疫组化（EIH）均相酶免疫测定（均相酶免疫测定（HEI）酶免疫测定酶免疫测定非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定固相酶免疫测定（EIA）液相酶免疫测定液相酶免疫测定（同（同RIA）20（二）酶免疫技术的分类20（三）酶免疫测定（三）酶免疫测定（EIA）1、均相酶免疫测定（、均相酶免疫测定（HEI）特特点点：仅仅需需将将待待测测样样品品、酶酶标标试试剂剂和和底底物物溶溶液液混混合合，待待抗抗原原抗抗体体反反应应完完成成即即可可直直接接测测定定结结果果，整个检测过程都在均匀的液相中进行。整个检测过程都在均匀的液相中进行。以酶放大免疫测定技术（以酶放大免疫测定技术（EMIT）为例：为例：21（三）酶免疫测定（EIA）1、均相酶免疫测定（HEI）特2、非均相酶免疫测定、非均相酶免疫测定（1）液相酶免疫测定（液相）液相酶免疫测定（液相EIA）：）：同同RIA：抗原、酶标抗原、抗体相继加入后，使：抗原、酶标抗原、抗体相继加入后，使反应达到平衡，再加分离剂。反应达到平衡，再加分离剂。（2）固相酶免疫测定（固相）固相酶免疫测定（固相EIA）：）：AgAb反应在固相载体的表面进行，应用最广泛反应在固相载体的表面进行，应用最广泛的是酶联免疫吸附试验（的是酶联免疫吸附试验（EnzymelinkedimmunosorbentassayELISA）222、非均相酶免疫测定（1）液相酶免疫测定（液相EIA）：1）ELISA基本原理基本原理将抗原或抗体结合到固相载体的表面，并保持将抗原或抗体结合到固相载体的表面，并保持其免疫活性。其免疫活性。抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体，仍分抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体，仍分别保持其免疫活性和酶活性。别保持其免疫活性和酶活性。在固相载体上按照一定的步骤加入待测抗原或在固相载体上按照一定的步骤加入待测抗原或抗体及酶标抗体或酶标抗原，洗去未结合的游抗体及酶标抗体或酶标抗原，洗去未结合的游离物质，加入酶的底物显色，颜色的深浅与待离物质，加入酶的底物显色，颜色的深浅与待测物质含量呈相关性。测物质含量呈相关性。231）ELISA 基本原理232）固相载体的种类）固相载体的种类A、塑料制品、塑料制品聚苯乙烯：聚苯乙烯：蛋白质非共价键或物理吸附结合到载体表蛋白质非共价键或物理吸附结合到载体表面，可制成小试管、小珠、微量反应板的形式面，可制成小试管、小珠、微量反应板的形式专用于专用于ELISA的微量反应板的微量反应板ELISA板（板（8 12=96孔）孔）B、微颗粒、微颗粒高分子单体聚合成的微球或颗粒，带有能与蛋白质结合高分子单体聚合成的微球或颗粒，带有能与蛋白质结合的功能基团，易于化学偶联，结合容量大。反应时可均的功能基团，易于化学偶联，结合容量大。反应时可均匀的分散到整个反应溶液中，反应速度快。其中可包裹匀的分散到整个反应溶液中，反应速度快。其中可包裹磁性物质，制成磁化微颗粒，使分离可在磁板中完成，磁性物质，制成磁化微颗粒，使分离可在磁板中完成，自动化分析。自动化分析。C、膜载体、膜载体NC膜（硝酸纤维素膜）膜（硝酸纤维素膜）、玻璃纤维素膜、尼龙膜等微、玻璃纤维素膜、尼龙膜等微孔滤膜。非共价键吸附孔滤膜。非共价键吸附Ab/Ag，吸附能力强。广泛应用，吸附能力强。广泛应用于斑点于斑点-ELISA等。等。242）固相载体的种类243）ELISA方法类型及反应原理方法类型及反应原理A、双抗体夹心法、双抗体夹心法此法是检测大分子抗原的常用方法。此法是检测大分子抗原的常用方法。上述方法亦可改为双位点一步法，使用针对抗上述方法亦可改为双位点一步法，使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。注意钩状效应。为固相抗体和酶标抗体。注意钩状效应。25 3）ELISA方法类型及反应原理上述方法亦可改为双位点一B、间接法、间接法此法是测定抗体的常用方法此法是测定抗体的常用方法。可以用一种酶标抗可以用一种酶标抗抗体检测多种抗体。抗体检测多种抗体。26 B、间接法 262727C、竞争结合法、竞争结合法可用于测定小分子抗原或半抗原及抗体。以检可用于测定小分子抗原或半抗原及抗体。以检测抗原为例，待测抗原和酶标抗原竞争与固相测抗原为例，待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，结合于固相的酶标抗原量与标本中抗体结合，结合于固相的酶标抗原量与标本中待测抗原含量呈反比。待测抗原含量呈反比。28 C、竞争结合法 28D、捕获法、捕获法最常用于检测最常用于检测IgM抗体抗体包被抗人包被抗人IgM 链链+待测标本待测标本-IgM类抗体全被类抗体全被固相抗体捕获固相抗体捕获-洗涤洗涤+特异性抗原（针对待特异性抗原（针对待测测IgM的相应抗原）与固相上特异性的相应抗原）与固相上特异性IgM结合结合+酶标抗体（针对特异性酶标抗体（针对特异性Ag的）的）+底物底物-显色显色-显色表示有特异性显色表示有特异性IgM。29 D、捕获法最常用于检测IgM抗体包被抗人IgM E、BAS-ELISA生物素（生物素（B）-亲和素（亲和素（A）系统（系统（biotinavidinsystem，BAS）是以生物素和亲和是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，它们的结合素具有的独特结合特性为基础，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。应用生物素亲和素放大系统的应用生物素亲和素放大系统的ELISA，使反，使反应信号放大，应信号放大，检测灵敏度提高。检测灵敏度提高。30 E、BAS-ELISA 301个亲和素（链霉亲和素）可结合四个生物素衍个亲和素（链霉亲和素）可结合四个生物素衍化物化物1个抗体可结合多个个抗体可结合多个B，与蛋白质与蛋白质-NH2结合形结合形成成肽键，肽键，-NH2越多，标记越多，标记B越多。越多。EBAg?EBABEBAbBBBEEBABE311个亲和素（链霉亲和素）可结合四个生物素衍化物31BAS-ELISA包括：包括：ABC-ELISA（间接法、双抗体夹心法）（间接法、双抗体夹心法）BA-ELISA（间接法、双抗体夹心法）（间接法、双抗体夹心法）BAB-ELISA（间接法、双抗体夹心法）（间接法、双抗体夹心法）例如：例如：BAB-ELISA（双抗体夹心法）：（双抗体夹心法）：固相固相Ab+待检待检Ag+（Ab-B）+A+B-E+底物显色底物显色32BAS-ELISA包括：ABC-ELISA（间接法、双抗ABC-ELISA（间接法、双抗体夹心法）（间接法、双抗体夹心法）33ABC-ELISA（间接法、双抗体夹心法）33（四）酶免疫组化（四）酶免疫组化（EIH）原原理理：以以酶酶标标记记抗抗体体与与用用于于相相应应抗抗原原反反应应，通通过过底底物物被被酶酶解解显显色色以以示示踪踪抗抗原原-抗抗体体结结合合物存在的部位。物存在的部位。酶酶免免疫疫组组化化染染色色标标本本可可在在普普通通光光学学显显微微镜镜下下观察，并能长期保存。观察，并能长期保存。此此外外，作作为为辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶底底物物的的二二氨氨基基联联苯苯胺胺（DAB），其其分分解解产产物物为为不不溶溶性性，适适于镜下观察。于镜下观察。34（四）酶免疫组化（EIH）341、直接法、直接法组织标本待测抗原组织标本待测抗原+酶标记抗体酶标记抗体DAB显色显色2、间接法、间接法组织标本待测抗原组织标本待测抗原+Ab1+酶标酶标-二抗二抗使用一种酶标抗体可检测多种抗原。敏感性较直使用一种酶标抗体可检测多种抗原。敏感性较直接法高，但低于接法高，但低于PAP法。法。351、直接法353、生物素、生物素-亲和素法亲和素法将亲和素（将亲和素（A）与生物素（与生物素（B）系统应用于酶系统应用于酶免疫组化免疫组化包括：包括：ABC法（直接法、间接法）法（直接法、间接法）BAB法（直接法、间接法）法（直接法、间接法）BA法法（直接法、间接法）（直接法、间接法）36 3、生物素-亲和素法 363.3.1 1）ABCABC法法直接直接ABCABC法法:玻片玻片Ag+BAg+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B ABCABC Ag-AbAg-AbB-AB*C B-AB*C 特点特点:将将BABBAB法中的法中的A A先与先与B BE E结合，制备成复合结合，制备成复合物物ABCABC间接间接ABCABC法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合复合物结合玻片玻片Ag+Ab1 Ag-Ab1 Ag+Ab1 Ag-Ab1 B BAb2Ab2 Ag-Ab1-Ab2 Ag-Ab1-Ab2B B ABCABC Ag-Ab1-Ab2 Ag-Ab1-Ab2B-AB*CB-AB*C373.1）ABC法372 2）BABBAB法（桥联亲合素法（桥联亲合素-标记生物素法标记生物素法BRABBRAB）直接直接BABBAB法法:组织切片或细胞涂片组织切片或细胞涂片Ag+BAg+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B A A Ag-AbAg-AbB-AB-A B BE E Ag-Ab Ag-AbB-A-BB-A-BE E 特点：以游离特点：以游离A A分别连接分别连接B BAbAb和和B BE E 间接间接BABBAB法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合组织切片或细胞涂片组织切片或细胞涂片Ag+Ab1 Ag-Ab1 Ag+Ab1 Ag-Ab1 B BAb2Ab2 Ag-Ab1-Ag-Ab1-Ab2Ab2B B A A Ag-Ab1-Ab2 Ag-Ab1-Ab2B-A B-A B BE E Ag-Ab1-Ab2 Ag-Ab1-Ab2B-B-A-BA-BE E382）BAB法（桥联亲合素-标记生物素法BRAB）383 3）BABA法（标记亲合素法（标记亲合素-生物素法生物素法LABLAB法）法）直接直接BABA（或（或LABLAB）法）法玻片玻片Ag+BAg+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B A AE E Ag-Ab Ag-AbB-AB-AE E特点：以特点：以A AE/SAE/SAE E代替代替BABBAB法中的法中的A A，省却了加，省却了加B BE E的的步骤步骤间接间接BABA（或（或LABLAB）法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体）法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合复合物结合玻片玻片Ag+Ab1 Ag-Ab1 Ag+Ab1 Ag-Ab1 B BAb2Ab2 Ag-Ab1-Ab2 Ag-Ab1-Ab2B B A AE E Ag-Ab1-Ab2 Ag-Ab1-Ab2B-AB-AE E393）BA法（标记亲合素-生物素法LAB法）39 BASBAS实验方法及反应层次实验方法及反应层次 方方 法法 反应层次反应层次 直接法直接法 BA AgBA Ag(Ab-B)(Ab-B)A*A*BAB Ag BAB Ag(Ab-B)(Ab-B)A AB*B*ABC Ag ABC Ag(Ab-B)(Ab-B)AB*C AB*C 间接法间接法 BA AgBA AgAb1Ab1(Ab2-B)(Ab2-B)A*A*BAB Ag BAB AgAb1Ab1(Ab2-B)(Ab2-B)A AB*B*ABC Ag ABC AgAb1Ab1(Ab2-B)(Ab2-B)AB*C AB*C Ag Ag 抗原；抗原；Ab-B Ab-B 生物素化抗体；生物素化抗体；A A 亲合素；亲合素；A*A*标记亲合素；标记亲合素；B B 生物素；生物素；B*B*标记生物素；标记生物素；Ab1 Ab1 第一抗体；第一抗体；Ab2 Ab2 第二抗体第二抗体;Ab2-B Ab2-B 生物素化第二抗体生物素化第二抗体40 BAS实验方法及反应层次 4、过过氧氧化化物物酶酶-抗抗过过氧氧化化物物酶酶（peroxidaseanti-peroxidasecomplex，PAP）法法和和碱碱性性磷磷 酸酸 酶酶-抗抗 碱碱 性性 磷磷 酸酸 酶酶（alkalinephosphatase-antialkaline phosphatase，APAAP）法法原原理理：应应用用抗抗酶酶抗抗体体与与酶酶结结合合，形形成成可可溶溶性性、稳稳定定的的酶酶-抗抗酶酶抗抗体体复复合合物物。此此法法优优点点是是：未未经经化化学学交交联联反反应应，故故避避免免了了抗抗体体和和酶酶活活性性降降低低，并省去酶标记抗体需纯化的繁复过程。并省去酶标记抗体需纯化的繁复过程。414、过氧化物酶-抗过氧化物酶（peroxidase anti 二、荧光免疫技术二、荧光免疫技术（fluoroimmunoassay）原原理理：以以荧荧光光素素标标记记的的抗抗体体或或抗抗原原，用用于于相相应应抗原或抗体的分析鉴定。抗原或抗体的分析鉴定。荧光免疫技术分为：荧光免疫技术分为：免免疫疫荧荧光光显显微微技技术术（荧荧光光免免疫疫组组化化）：用用荧荧光光抗抗体体对对细细胞胞、组组织织切切片片或或其其他他标标本本中中的的抗抗原原（或或抗抗体体）进进行行鉴鉴定定和和定定位位检检测测，可可在在荧荧光光显显微微镜镜下直接观察实验结果，下直接观察实验结果，流式细胞术：进行自动分析检测流式细胞术：进行自动分析检测荧光免疫测定：用于检测体液标本中抗原或抗体。荧光免疫测定：用于检测体液标本中抗原或抗体。42 二、荧光免疫技术（fluoroimmunoassay）42（一）常用的荧光色素（一）常用的荧光色素1、异硫氰酸荧光素（、异硫氰酸荧光素（FITC）橙黄色橙黄色/黄色粉末，发出黄绿色荧光。最大吸收峰黄色粉末，发出黄绿色荧光。最大吸收峰490495nm，最大发射峰最大发射峰520530nm，含异硫氰基含异硫氰基-N=C=S。应用最多的荧光素。应用最多的荧光素。2、四乙基罗丹明（、四乙基罗丹明（RB200）橘红色粉末，发出橘红色或橙色荧光。最大吸收峰橘红色粉末，发出橘红色或橙色荧光。最大吸收峰570nm，最大发射峰最大发射峰595600nm。含磺酸基。与含磺酸基。与FITC做双标记或对比染色。做双标记或对比染色。3、藻红蛋白（、藻红蛋白（R-RE）发出橙色荧光，最大吸收峰发出橙色荧光，最大吸收峰565nm，最大发射峰最大发射峰575nm，可与可与FITC共用共用488nm激发光，可用于流式细激发光，可用于流式细胞仪的双标记。胞仪的双标记。43（一）常用的荧光色素1、异硫氰酸荧光素（FITC）橙黄色/（二）免疫荧光显微技术（二）免疫荧光显微技术1、方法及原理方法及原理1）直接）直接法法应用特异性荧光抗体直接检查标本中的相应抗原。应用特异性荧光抗体直接检查标本中的相应抗原。2）间接）间接法法以特异性抗体（或待测抗体）为第一抗体，以荧以特异性抗体（或待测抗体）为第一抗体，以荧光素标记的抗球蛋白抗体（标记的抗抗体）为第光素标记的抗球蛋白抗体（标记的抗抗体）为第二抗体，用于检测抗原或抗体。二抗体，用于检测抗原或抗体。44（二）免疫荧光显微技术443）补补体体法法 此此法法是是在在间间接接法法的的第第一一步步抗抗原原-抗抗体体反反应应加加入入补补体体，使使之之与与抗抗原原-抗抗体体复复合合物物结结合；再用荧光素标记的抗补体抗体进行示踪。合；再用荧光素标记的抗补体抗体进行示踪。4）双标记）双标记法法此此法法用用异异硫硫氰氰酸酸荧荧光光素素（FITC）及及罗罗丹丹明明（TRITC）分分别别标标记记不不同同抗抗体体，进进行行同同一一标标本本的的荧荧光光染染色色，若若有有两两种种相相应应抗抗原原存存在在，可可同时见两种（橙红、黄绿）荧光。同时见两种（橙红、黄绿）荧光。45 3）补体法 此法是在间接法的第一步抗原-抗体反应加入补体 2、荧、荧光显微镜检查光显微镜检查1）染色标本尽可能立即观察结果。）染色标本尽可能立即观察结果。2）镜下观察时同一标本区观察时间不易过长。）镜下观察时同一标本区观察时间不易过长。3）通风较好的暗室中进行。）通风较好的暗室中进行。4）油镜检查时用无荧光镜油，先观察对照，再）油镜检查时用无荧光镜油，先观察对照，再看待测标本。看待测标本。46 2、荧光显微镜检查46（三）流式细胞术（三）流式细胞术（FCM）FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞表面标志（抗原或受体）进行快对单个细胞表面标志（抗原或受体）进行快速、精确分析和自动检测，并可对不同类型速、精确分析和自动检测，并可对不同类型细胞进行分选和收集。细胞进行分选和收集。FCM还可对同一细胞还可对同一细胞的多种参数（如的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，故成为当代生胞体积等）进行多信息分析，故成为当代生命科学研究领域中被广泛应用的一项新技术。命科学研究领域中被广泛应用的一项新技术。47（三）流式细胞术（FCM）471、基本概念与原理、基本概念与原理FCM是是一一种种分分析析单单个个微微粒粒（如如细细胞胞、微微生生物物和和人人工工合合成成微微球球等等）物物理理和和化化学学特特性性的的技技术术，其其特点是快速、准确、客观，能定量。特点是快速、准确、客观，能定量。FCM的的原原理理：悬悬浮浮在在液液体体中中的的分分散散细细胞胞单单个个地地依依次次通通过过测测量量区区时时产产生生电电信信号号，从从而而可可快快速速对对大大量量细细胞胞进进行行多多参参数数检检测测和和分分析析，并并可可从从整整个个群体中分选出特定的细胞亚群。群体中分选出特定的细胞亚群。48 1、基本概念与原理 4849492、流式细胞术在免疫细胞研究中的应用、流式细胞术在免疫细胞研究中的应用1）细胞表型分析）细胞表型分析表型分析可用于免疫细胞鉴定、计数和功能评表型分析可用于免疫细胞鉴定、计数和功能评价。价。2）细胞功能检测）细胞功能检测（1）细胞功能状态和活化信号转导：）细胞功能状态和活化信号转导：包包括括检检测测胞胞内内钙钙离离子子浓浓度度、蛋蛋白白磷磷酸酸化化、蛋蛋白白激激酶酶活活性性状状态态、信信息息传传递递相相关关蛋蛋白白表表达达及及相相互互作作用等。用等。50 2、流式细胞术在免疫细胞研究中的应用50（2）细胞增殖：）细胞增殖：应用活细胞染料应用活细胞染料5-二醋酸羧基荧光素琥珀酸二醋酸羧基荧光素琥珀酸单胞菌酯（单胞菌酯（5-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester，CFSE）作）作为标记物，建立了检测细胞增殖的新技术。为标记物，建立了检测细胞增殖的新技术。原理：原理：CFSE能自动穿过胞膜，与胞内蛋白赖能自动穿过胞膜，与胞内蛋白赖氨酸不可逆结合，并随细胞分裂而倍减，借氨酸不可逆结合，并随细胞分裂而倍减，借助助FCM检测荧光强度，可判断细胞的增殖状检测荧光强度，可判断细胞的增殖状态。态。51（2）细胞增殖：51（3）细胞分化：）细胞分化：借助胞内细胞因子染色（借助胞内细胞因子染色（intracelluarcytokinestaining，ICCS），），可应用可应用FCM检检测单细胞产生和分泌的测单细胞产生和分泌的CK，从而判断单一细，从而判断单一细胞亚群的分化和功能状态。胞亚群的分化和功能状态。原理：应用蛋白转运抑制剂使胞内合成的原理：应用蛋白转运抑制剂使胞内合成的CK滞留在高尔基体；应用透膜剂（滞留在高尔基体；应用透膜剂（saponin）使荧光标记抗体可逆性穿透胞膜，以进行胞内使荧光标记抗体可逆性穿透胞膜，以进行胞内染色。染色。52（3）细胞分化：52（4）细胞毒效应：）细胞毒效应：通过检测某些效应分子（通过检测某些效应分子（FasL、穿孔素和颗粒穿孔素和颗粒酶等）可判断细胞毒效应。酶等）可判断细胞毒效应。（5）细胞凋亡：见下文。）细胞凋亡：见下文。53（4）细胞毒效应：53（四）荧光免疫测定（四）荧光免疫测定（FIA）1、荧光偏振免疫测定（、荧光偏振免疫测定（FPIA）该法主要用于小分子物质（特别是药物浓度）测定。该法主要用于小分子物质（特别是药物浓度）测定。原理：荧光素标记的已知抗原原理：荧光素标记的已知抗原+待测抗原待测抗原+抗体抗体形成形成标记抗原抗体复合物，由于其分子量大，旋转慢，在激标记抗原抗体复合物，由于其分子量大，旋转慢，在激发光照射下，吸收的偏振光多，发出的偏振荧光强，小发光照射下，吸收的偏振光多，发出的偏振荧光强，小分子游离标记抗原旋转快，其偏振荧光弱。因此，标本分子游离标记抗原旋转快，其偏振荧光弱。因此，标本中抗原浓度越高，形成的标记抗原抗体复合物越少，发中抗原浓度越高，形成的标记抗原抗体复合物越少，发出的偏振荧光越弱。反之，发出的偏振荧光越强。出的偏振荧光越弱。反之，发出的偏振荧光越强。54（四）荧光免疫测定（FIA）542、时间分辨荧光免疫测定（、时间分辨荧光免疫测定（TR-FIA）原理：应用具有较长荧光寿命的镧系螯合原理：应用具有较长荧光寿命的镧系螯合物（如铕）标记抗原或抗体，并利用时间物（如铕）标记抗原或抗体，并利用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，有效消除分辨荧光分析仪延缓测量时间，有效消除非特异性本底荧光的干扰，所得信号完全非特异性本底荧光的干扰，所得信号完全是镧系螯合物发射的特异荧光，从而最大是镧系螯合物发射的特异荧光，从而最大限度提高测定方法的灵敏度和特异性。限度提高测定方法的灵敏度和特异性。55 2、时间分辨荧光免疫测定（TR-FIA）5556563、酶免疫荧光测定（、酶免疫荧光测定（ELFIA）原理：应用具有潜在荧光的物质作为酶的底原理：应用具有潜在荧光的物质作为酶的底物，经过酶解反应产生高强度荧光，可用荧物，经过酶解反应产生高强度荧光，可用荧光测量仪进行定量测定。光测量仪进行定量测定。573、酶免疫荧光测定（ELFIA）57三、放射免疫技术三、放射免疫技术是以放射性核素作为示踪剂的标记是以放射性核素作为示踪剂的标记免疫测定方法，其特点是将核素分析的高免疫测定方法，其特点是将核素分析的高灵敏度与抗原灵敏度与抗原-抗体反应的特异性相结合。抗体反应的特异性相结合。广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大的推动作用。的发展起到了极大的推动作用。包括放射免疫测定（包括放射免疫测定（RIA）和免疫放射测定）和免疫放射测定（IRMA）58三、放射免疫技术58（一）常用的放射性核素（一）常用的放射性核素 射线：射线：131I、125I、51Cr、60Co 射线：射线：14C、3H、32P 射线半衰期长，易造成对环境的污染，比活射线半衰期长，易造成对环境的污染，比活性差，需液体闪烁仪。一般不用。性差，需液体闪烁仪。一般不用。59（一）常用的放射性核素59（二）放射免疫测定（二）放射免疫测定（RIA）1、RIA基本原理基本原理以以放放射射性性核核素素标标记记的的抗抗原原（Ag*）和和检检品品中中待待测测的的未未标标记记抗抗原原（Ag）与与固固定定量量特特异异性性抗抗体体竞竞争争结结合反应。合反应。若若Ag*和和Ab的的量量固固定定，二二者者结结合合所所形形成成Ag*-Ab复复合合物物受受Ag含含量量制制约约。若若反反应应系系统统中中Ag含含量量高高，其其对对Ab竞竞争争结结合合能能力力即即强强，Ag-Ab复复合合物物生生成成量量增增加加，Ag*-Ab复复合合物物则则相相对对减减少少。因因此此，Ag*Ab复复合合物物形形成成量量与与Ag含含量量间间呈呈一一定定负负相相关关函数关系。函数关系。60（二）放射免疫测定（RIA）60Ag*+AbAg*Ab+Ag*+AgAgAb+AgBFB0T61Ag*+AbAg*Ab+Ag*+2、RIA测定方法测定方法1）AgAb反应反应2）B、F的分离的分离加入加入PR试剂（二抗和试剂（二抗和PEG混合物，混合物，也可制成固相二抗也可制成固相二抗（二抗与颗粒固相物连接）（二抗与颗粒固相物连接）Ag*Ab1+Ab2Ag*Ab1-Ab23）放射性强度的测定放射性强度的测定 计数仪测上清计数仪测上清/沉淀沉淀cpm，制备标准曲线（，制备标准曲线（B/（B+F），），B/F，B/B0）。亦可用计算机处理。）。亦可用计算机处理。622、RIA测定方法62（三）免疫放射测定（三）免疫放射测定（三）免疫放射测定（三）免疫放射测定（IRMAIRMA）1、单位点、单位点IRMA是将待测抗原与过量标记抗体直接反应，然后加是将待测抗原与过量标记抗体直接反应，然后加入固相的抗原免疫吸附剂与游离的标记抗体结合入固相的抗原免疫吸附剂与游离的标记抗体结合经离心去除沉淀物，测定上清液放射性强度，从经离心去除沉淀物，测定上清液放射性强度，从而推算出检品中待测抗原含量。而推算出检品中待测抗原含量。2、双位点、双位点IRMA测定固相上的测定固相上的cpm数数63（三）免疫放射测定（IRMA）63四、化学发光免疫技术四、化学发光免疫技术是将发光技术与免疫反应和计算机技术结合是将发光技术与免疫反应和计算机技术结合的自动化仪器分析技术，目前已趋替代的自动化仪器分析技术，目前已趋替代RIA而而成为免疫检测广泛采用的分析技术。成为免疫检测广泛采用的分析技术。可用于多项指标的检测。可测定内分泌激素可用于多项指标的检测。可测定内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫血类等方面的检测。血类等方面的检测。64 四、化学发光免疫技术64（一）化学发光免疫测定（一）化学发光免疫测定（CLIA）CLIA是以化学发光剂（如鲁米诺、吖啶酯等）是以化学发光剂（如鲁米诺、吖啶酯等）标记抗体或抗原，免疫反应完成后，直接引发标记抗体或抗原，免疫反应完成后，直接引发化学发光反应进行检测。化学发光反应进行检测。65（一）化学发光免疫测定（CLIA）65（二）化学发光酶免疫测定（二）化学发光酶免疫测定（CLEIA）CLEIA的的抗抗原原-抗抗体体反反应应步步骤骤与与酶酶免免疫疫测测定定相相同同，仅仅酶酶促促反反应应所所用用的的底底物物为为发发光光剂剂，通通过过化学发光反应进行检测。化学发光反应进行检测。66（二）化学发光酶免疫测定（CLEIA）66（三）电化学发光免疫测定（三）电化学发光免疫测定（ECLIA）ECLIA实际上是在电极表面由电化学引发的特异性实际上是在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。化学发光反应。三联吡啶钌三联吡啶钌RU(bpy)32+三丙胺三丙胺（TPA）.67 （三）电化学发光免疫测定（ECLIA）ECLIA实电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫分析示意图68电化学发光免疫分析示意图68电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定示意图69电化学发光免疫测定示意图69五、免疫金标记技术（五、免疫金标记技术（immunogoldlabellingtechnique）氯金酸（氯金酸（HAuCl4）在还原剂（枸橼酸三钠）作用下被）在还原剂（枸橼酸三钠）作用下被还原成原子金，聚合成特定大小的金颗粒悬液，并由还原成原子金，聚合成特定大小的金颗粒悬液，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态于静电作用成为一种稳定的胶体状态胶体金。胶体金。是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原-抗体反应。抗体反应。胶体金具有高电子密度，胶体金具有高电子密度，最初主要用于免疫电镜技术，最初主要用于免疫电镜技术，以后其应用范围逐步扩展以后其应用范围逐步扩展。在免疫组化方面，胶体金标记的抗体可直接用于检测在免疫组化方面，胶体金标记的抗体可直接用于检测细胞表面和组织切片中的抗原或受体，并可在普通光细胞表面和组织切片中的抗原或受体，并可在普通光学显微镜下观察。学显微镜下观察。在流式细胞术中，胶体金可作为多参细胞分析和分选在流式细胞术中，胶体金可作为多参细胞分析和分选的有效标记物。的有效标记物。70五、免疫金标记技术（immunogold labelling常用的方法：常用的方法：1、免疫金（银）染色法（、免疫金（银）染色法（IGS/IGSS）组织切片（抗原）组织切片（抗原）+特异性抗体特异性抗体+胶体金标胶体金标记二抗记二抗+银显影剂，标记物上的金颗粒催化硝银显影剂，标记物上的金颗粒催化硝酸银离子还原成银颗粒，在抗原抗体复合物酸银离子还原成银颗粒，在抗原抗体复合物上形成黑色上形成黑色“银壳银壳”，使，使Ag位置放大，从而位置放大，从而提提高了镜下的可见度。高了镜下的可见度。7171用用NC膜或微孔滤膜为载体吸附抗原，用胶体金膜或微孔滤膜为载体吸附抗原，用胶体金标记抗体代替酶标抗体。标记抗体代替酶标抗体。2、斑点免疫层析试验（、斑点免疫层析试验（DICA）72用NC膜或微孔滤膜为载体吸附抗原，用胶体金标记抗体代替酶标抗六、免疫印迹技术（六、免疫印迹技术（immunoblotting）又又称称为为Western-blotting，是是将将凝凝胶胶电电泳泳的的高高分辨力与固相免疫测定结合起来的一种方法。分辨力与固相免疫测定结合起来的一种方法。由由十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳（SDS-PAGE）、蛋蛋白白质质转转印印和和固固相相膜膜免免疫疫测测定三项技术结合而成。定三项技术结合而成。73 六、免疫印迹技术（immunoblotting）73七、免疫七、免疫PCR（immuno-PCR，IM-PCR）是是将将免免疫疫学学反反应应和和PCR技技术术相相结结合合而而创创建建的的一一种种新新的的检检测测技技术术，具具有有抗抗原原、抗抗体体反反应应的的特异性和特异性和PCR技术的高效性。技术的高效性。基基本本原原理理：用用一一段段已已知知的的DNA分分子子作作为为标标记记物物，结结合合一一抗抗或或二二抗抗后后去去检检测测相相应应抗抗原原或或抗抗体体，再再用用PCR法法扩扩增增该该DNA分分子子，扩扩增增产产物物用用琼琼脂脂糖糖电电泳泳定定性性，根根据据该该DNA分分子子的的存存在在与否，确定检测结果。与否，确定检测结果。该该方方法法与与ELISA的的原原理理类类似似，不不同同的的是是以以DNA分分子子作作为为标标记记物物。免免疫疫PCR可可采采用用直直接接法、间接法和双抗体夹心法。法、间接法和双抗体夹心法。74七、免疫PCR（immuno-PCR，IM-PCR）747575 八、细胞凋亡检测技术八、细胞凋亡检测技术（一）形态学检测（一）形态学检测 应应用用电电子子显显微微镜镜或或普普通通光光学学显显微微镜镜直直接接观观察察细细胞胞大大小小、凋凋亡亡小小体体和和其其他他凋凋亡亡细细胞胞的的形形态态学改变；学改变；应应用用某某些些可可直直接接、间间接接产产生生荧荧光光的的染染料料如如双双苯苯并并咪咪唑唑（HO）、碘碘化化丙丙啶啶（PI）、AnnexinV等等使使细细胞胞着着染染，借借助助荧荧光光显显微微镜镜区分凋亡细胞、坏死细胞和正常细胞。区分凋亡细胞、坏死细胞和正常细胞。76 八、细胞凋亡检测技术76（二）生物化学检测方法（二）生物化学检测方法 凋凋亡亡细细胞胞染染色色质质DNA在在核核小小体体单单位位间间连连接接处处断断裂裂，形形成成180200bp整整数数倍倍的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段，在在凝凝胶胶电电泳泳上上表表现现为为梯梯形形电电泳泳图图谱谱（DNAladder）。）。（三）免疫学检测方法（三）免疫学检测方法 原原理理：凋凋亡亡细细胞胞染染色色质质DNA断断裂裂而而产产生生的的核核小小体体DNA，可可与与组组蛋蛋白白结结合合为为复复合合物物。应应用用抗抗组组蛋蛋白白和和抗抗DNA单单抗抗，借借助助ELISA方方法法可可测测定定细细胞凋亡。胞凋亡。该该技技术术优优点点是是：可可用用于于检检测测不不同同培培养养细细胞胞株株或或不不同同动动物物来来源源的的细细胞胞凋凋亡亡；灵灵敏敏度度高高，且且可检测早期细胞凋亡。可检测早期细胞凋亡。77（二）生物化学检测方法 77（四）分子生物学检测方法（四）分子生物学检测方法 常常用用技技术术为为脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸末末端端转转移移酶酶介介导导的的缺缺口口末端标记法（末端标记法（TUNEL），），原原理理：凋凋亡亡细细胞胞的的DNA链链发发生生断断裂裂而而暴暴露露3-OH末末端端，可可借借助助末末端端转转移移酶酶（TdT）将将脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸与与荧荧光光素素、过过氧氧化化物物酶酶、碱碱性性磷磷酸酸酶酶或或生生物物素素形形成成的的衍衍生生物物标标记记到到DNA3-OH末末端端，从从而而检检测细胞凋亡。测细胞凋亡。TUNEL法法的的优优点点是是：能能对对完完整整的的单单个个凋凋亡亡细细胞胞或或凋凋亡亡小小体体进进行行原原位位染染色色；适适用用于于不不同同样样本本的的检检测测；灵敏度远比一般组织化学和生化测定法高。灵敏度远比一般组织化学和生化测定法高。78（四）分子生物学检测方法 787979（五）流式细胞术（五）流式细胞术1、亚、亚“G1”峰检测法峰检测法处处于于增增殖殖周周期期的的细细胞胞，其其在在不不同同周周期期时时相相（Go/G1、S、G2/M）的的DNA含含量量为为2n4n。凋凋亡亡细细胞胞核核内内的的DNA裂裂解解成成小小片片段段，应应用用胞胞膜膜通通透透剂剂可可使使小小分分子子量量DNA片片段段穿穿过过胞胞膜膜而而丢丢失失，仅仅剩剩大大片片段段DNA，这这些些失失去去部部分分DNA的的细细胞胞，染染色色后后形形成成一一个个DNA含含量量2n（即即G1期期细细胞）的分布区，称为胞）的分布区，称为“亚亚G1峰峰”。该该技技术术的的缺缺点点为为：不不能能反反映映发发生生于于G1峰峰后后S期期和和G2期的细胞凋亡；不能区别死细胞和活细胞。期的细胞凋亡；不能区别死细胞和活细胞。80（五）流式细胞术802、HO/PI染色法染色法原原理理：HO被被活活细细胞胞摄摄取取，与与DNA结结合合后后在在紫紫外外光光下下呈呈蓝蓝色色荧荧光光；PI使使死死细细胞胞着着染染，产产生生红红色色荧荧光光。根根据据两两种种荧荧光光所所形形成成的的细细胞胞二二维维直直方方图图，可可分分辨辨正正常常活活细细胞胞、凋凋亡亡细细胞胞和和死死细胞。细胞。3、Annexin法法应应用用AnnexinV，AnnexinV是是一一种种Ca2+依依赖赖的的磷磷脂脂结结合合蛋蛋白白，具具有有易易于于结结合合到到磷磷脂脂类类如如PS（磷磷脂脂酰酰丝丝氨氨酸酸）的的特特性性。对对PS有有高高度度的的亲亲和和性性。借借助助FCM可可定定量量分分析析被被标标记记的的凋凋亡与坏死细胞数。亡与坏死细胞数。812、HO/PI染色法 814、caspase活性检测活性检测caspase（胱胱天天蛋蛋白白酶酶）水水平平及及活活性性升升高高乃乃细细胞胞凋凋亡亡的的标标志志，并并反反映映效效应应细细胞胞的的细细胞胞毒毒活活性性。应应用用能能透透过过胞胞膜膜的的caspase荧荧光光底底物物，其其被被酶酶切切后后释释放放荧荧光光基基团团，借借助助FCM检检测测所所释放的荧光强度，可推断释放的荧光强度，可推断caspase活性。活性。该该法法优优点点为为：可可在在单单细细胞胞水水平平对对抗抗原原特特异异性性T细细胞细胞毒作用进行可视化和数量化分析。胞细胞毒作用进行可视化和数量化分析。824、caspase活性检测 82第二节第二节 免疫分子的检测免疫分子的检测83第二节 免疫分子的检测83一、免疫球蛋白测定一、免疫球蛋白测定检检测测IgG、IgA、IgM含含量量常常用用单单向向免免疫疫扩扩散散法法、火火箭箭免免疫疫电电泳泳法法、免免疫疫比比浊浊法法以以及及免免疫疫化化学学自动分析仪。自动分析仪。血血清清中中IgE和和IgD含含量量很很低低，须须用用RIA、ELISA、RAST等灵敏度较高的方法测定。等灵敏度较高的方法测定。84一、免疫球蛋白测定84 二、补体测定二、补体测定（一）血清总补体活性测定（一）血清总补体活性测定原原理理：应应用用家家兔兔抗抗SRBC抗抗体体致致敏敏的的SRBC作作为为抗抗原原-抗抗体体复复合合物物，激激活活待待测测血血清清中中补补体体经经典典途途径径，导导致致SRBC溶溶解解；若若待待测测血血清清样样品品中中补补体体含含量量减减少少或或某某种种补补体体成成分分缺缺失失，可可影影响响此此种种溶溶血血反反应应。通通常常以以50%溶溶血血作作为为判判定定反反应应结结果果的的终终点点，故故称称为为50%溶溶血血试试验验（50%complementhemolysis，CH50）。根根据据引引起起50%溶溶血血所所需需的的最最小小补补体体量量，计算血清总补体活性。计算血清总补体活性。85 二、补体测定85（二）血清补体旁路途径活性测定（二）血清补体旁路途径活性测定原理：家兔红细胞（原理：家兔红细胞（RRBC）可直接激活人可直接激活人B因因子子，引引起起补补体体旁旁路路途途径径活活化化，导导致致RRBC溶解。溶解。（三）补体各成分测定（三）补体各成分测定1、免免疫疫溶溶血血法法该该法法可可用用于于C4、C2及及B因因子子测测定定。以以抗抗体体致致敏敏的的SRBC作作为为指指示示系系统统进进行行检检测。测。2、免免疫疫化化学学法法常常用用方方法法有有单单向向免免疫疫扩扩散散法法、火火箭免疫电泳法、免疫比浊法、箭免疫电泳法、免疫比浊法、ELISA及及RIA等。等。86（二）血清补体旁路途径活性测定86三、细胞因子及其受体检测三、细胞因子及其受体检测（一）生物学检测法（一）生物学检测法原原理理为为：根根据据CK特特定定的的生生物物学学活活性性，采采用用相相应应指指示示系系统统（如如各各种种依依赖赖性性细细胞胞株株或或靶靶细细胞胞），通通过过与与标标准准品品对对比比，判判断断样样品品中中细细胞胞因因子子活性水平，一般以活性单位（活性水平，一般以活性单位（U/ml）表示。表示。可可分分为为促促进进细细胞胞增增殖殖或或增增殖殖抑抑制制法法、集集落落形形成成法法、细细胞胞毒毒活活性性测测定定法法、细细胞胞病病变变抑抑制制法法、趋化活性测定法等。趋化活性测定法等。87三、细胞因子及其受体检测87生生物物学学检检测测法法优优点点：灵灵敏敏度度高高（达达pg水水平平），并能直接显示，并能直接显示CK生物活性。生物活性。生生物物学学检检测测法法缺缺点点：多多种种CK可可能能具具有有相相同同功功能能，故故干干扰扰因因素素较较多多；某某些些抑抑制制因因子子可可降降低低CK活活性性；某某些些细细胞胞同同时时表表达达CK受受体体，其其与与CK结结合合将将影影响响生生物物学学活活性性检检测测结果。结果。88生物学检测法优点：灵敏度高（达pg水平），并能直接显示CK生（二）免疫学检测法（二）免疫学检测法1、体液中、体液中CK的检测的检测几几乎乎所所有有CK均均可可借借助助免免疫疫学学方方法法进进行行检检测测。常常用用方方法法包包括括ELISA（双双抗抗体体夹夹心心法法或或竞竞争争法）、法）、RIA及免疫印迹法等。及免疫印迹法等。某某些些细细胞胞因因子子含含量量甚甚微微的的样样品品（如如脑脑脊脊液液）可可用用免免疫疫PCR（immuno-PCR）进进行行检检测测，极大地提高检测灵敏度（可达极大地提高检测灵敏度（可达1012mol/L）。）。89（二）免疫学检测法892、单个细胞分泌单个细胞分泌CK的检测的检测（1）反向溶血空斑试验（）反向溶血空斑试验（reversedhemolyticplaqueassay，RHPA）RHPA是一种体外是一种体外检测抗体分泌细胞的试验。亦可将其用于测定检测抗体分泌细胞的试验。亦可将其用于测定CK分泌细胞。分泌细胞。原理：待测原理：待测CK分泌细胞分泌细胞+抗抗CK抗体抗体+SPA-SRBC+补体，补体，4种成分与琼脂糖凝胶混匀，注种成分与琼脂糖凝胶混匀，注入小室内；反应后导致入小室内；反应后导致SRBC溶解，在溶解，在CK分分泌细胞周围形成溶血空斑，每个空斑代表一个泌细胞周围形成溶血空斑，每个空斑代表一个CK分泌细胞，空斑大小与细胞所分泌分泌细胞，空斑大小与细胞所分泌CK的量的量成正比。成正比。90 2、单个细胞分泌CK的检测90（2）酶酶 联联 免免 疫疫 斑斑 点点 试试 验验（ELISPOT）原原理理：抗抗CK抗抗体体包包被被固固相相载载体体+待待测测分分泌泌CK的的细细胞胞+结结合合后后洗洗去去细细胞胞+酶酶标标抗抗CK抗抗体体+底底物物，显显色色反反应应的的深深浅浅测测定定结结合合在在固固相相载载体体上上的的CK量量，并并可可在在光光镜镜下下观观察察分分泌泌CK的的细细胞。胞。91 （2）酶联免疫斑点试验（ELISPOT）9192923、细胞内细胞内CK的的检测检测采采用用FCM免免疫疫荧荧光光技技术术可可从从单单细细胞胞水水平平检检测测不不同同细细胞胞亚亚群群中中的的CK，用用不不同同颜颜色色荧荧光光标标记记的的抗抗CK抗抗体体可可在在同同一一细细胞胞内内同同时时测测定定两两种种不不同同CK。93 3、细胞内CK的检测93免免疫疫学学检检测测法法优优点点：特特异异性性强强，可可测测出出单单一一细细胞胞因因子子含含量量；方方法法简简便便，无无须须细细胞胞培培养养，便便于于大大量量样样品品检检测测；实实验验流流程程短短，方方法易标准化，重复性好法易标准化，重复性好免免疫疫学学检检测测法法缺缺点点：免免疫疫学学方方法法所所检检出出的的细细胞胞因因子子含含量量，与与该该因因子子生生物物活活性性并并非非必必然然平平行行；不不同同单单抗抗所所识识别别的的细细胞胞因因子子表表位位和和亲和力不同，所测结果可出现差异。亲和力不同，所测结果可出现差异。94免疫学检测法优点：特异性强，可测出单一细胞因子含量；方法（三）分子生物学检测法（三）分子生物学检测法应用细胞因子应用细胞因子cDNA探针或寡核苷酸探探针或寡核苷酸探针，经放射性核素（针，经放射性核素（32P或或35P）、生物素）、生物素或地高辛标记，与提取的细胞因子或地高辛标记，与提取的细胞因子mRNA进行进行杂交（杂交（Northernblot）；亦可在细胞或组织切）；亦可在细胞或组织切片上进行原位杂交分析；若同时结合免疫组化片上进行原位杂交分析；若同时结合免疫组化技术，还可鉴定表达细胞因子基因的