琼脂糖凝胶电泳原理步骤详细课件

http:/ GelElectrophoresis.上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容讲课内容 概述概述 1 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点 2 琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用 3 影响迁移率的因素影响迁移率的因素 4 琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白 5.上海交通大学医学院上海交通大学医学院概述概述IntroductionIntroductionvGel Gel Gel Gel ElectrophoresisElectrophoresisElectrophoresisElectrophoresis ：由由由由琼琼琼琼脂脂脂脂、琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖、淀淀淀淀粉粉粉粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。v特点（特点（特点（特点（characteristiccharacteristiccharacteristiccharacteristic）：）：）：）：1.1.1.1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动孔中泳动孔中泳动孔中泳动2.2.2.2.电泳操作方法简便，电泳速度快电泳操作方法简便，电泳速度快电泳操作方法简便，电泳速度快电泳操作方法简便，电泳速度快3.3.3.3.分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰4.4.4.4.适用于生化，免疫等定性定量测定适用于生化，免疫等定性定量测定适用于生化，免疫等定性定量测定适用于生化，免疫等定性定量测定 .上海交通大学医学院上海交通大学医学院琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（Agarose Gel Agarose Gel）天然琼脂（天然琼脂（agaragar）:又名琼胶、菜燕、冻粉又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。高聚物。琼脂糖（琼脂糖（agaroseagarose）琼脂果胶（琼脂果胶（agaropectinagaropectin）Acid sulfateAcid sulfateCarboxylic acid groupsCarboxylic acid groups.上海交通大学医学院上海交通大学医学院 D-D-半乳糖半乳糖3 3，6-6-脱水脱水-L-L-半乳糖半乳糖琼脂糖（琼脂糖（AgaroseAgarose）半乳糖及其衍生物构成的中性物质半乳糖及其衍生物构成的中性物质.上海交通大学医学院上海交通大学医学院.上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容讲课内容 概述概述 1 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点 2 琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用 3 影响迁移率的因素影响迁移率的因素 4 琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白 5.上海交通大学医学院上海交通大学医学院 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点（一）优点（一）优点（一）优点（一）优点（advantage)advantage)advantage)advantage)1.1.1.1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.2.2.2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象3.3.3.3.凝凝凝凝胶胶胶胶结结结结构构构构均均均均匀匀匀匀，孔孔孔孔径径径径较较较较大大大大，可可可可用用用用来来来来分分分分离离离离酶酶酶酶的的的的复复复复合合合合物物物物、核核核核酸酸酸酸、病毒病毒病毒病毒 等大分子物质等大分子物质等大分子物质等大分子物质4.4.4.4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色5.5.5.5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.6.6.6.有热可逆性有热可逆性有热可逆性有热可逆性.上海交通大学医学院上海交通大学医学院（二）缺点（二）缺点（二）缺点（二）缺点(disadvantage)(disadvantage)(disadvantage)(disadvantage)1.1.1.1.机械强度差，易破碎机械强度差，易破碎机械强度差，易破碎机械强度差，易破碎，浓度不能太低，浓度不能太低，浓度不能太低，浓度不能太低2.2.2.2.易被细菌污染，不易保存易被细菌污染，不易保存易被细菌污染，不易保存易被细菌污染，不易保存，临用前配制，临用前配制，临用前配制，临用前配制3.3.3.3.琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖支支支支持持持持层层层层上上上上的的的的区区区区带带带带易易易易于于于于扩扩扩扩散散散散，电电电电泳泳泳泳后后后后必必必必须须须须立立立立即固定染色即固定染色即固定染色即固定染色4.4.4.4.与与与与PAGEPAGEPAGEPAGE相比，分子筛相比，分子筛相比，分子筛相比，分子筛(molecular sieve)(molecular sieve)(molecular sieve)(molecular sieve)作用小作用小作用小作用小，区带少区带少区带少区带少.上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容讲课内容 概述概述 1 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点 2 琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用 3 影响迁移率的因素影响迁移率的因素 4 琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白 5.上海交通大学医学院上海交通大学医学院琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用Applications of Agarose GelApplications of Agarose GelApplications of Agarose GelApplications of Agarose Gel Electrophoresis Electrophoresis Electrophoresis Electrophoresis 1.1.1.1.适适适适用用用用于于于于大大大大分分分分子子子子的的的的核核核核酸酸酸酸、核核核核蛋蛋蛋蛋白白白白等等等等的的的的分分分分离离离离、鉴鉴鉴鉴定定定定及纯化及纯化及纯化及纯化2.2.2.2.临临临临床床床床生生生生化化化化检检检检验验验验中中中中常常常常用用用用于于于于LDHLDHLDHLDH、CKCKCKCK等等等等同同同同工工工工酶酶酶酶的的的的分分分分离与检测离与检测离与检测离与检测3.3.3.3.为为为为不不不不同同同同类类类类型型型型的的的的高高高高脂脂脂脂蛋蛋蛋蛋白白白白血血血血症症症症、冠冠冠冠心心心心病病病病等等等等提提提提供供供供生生生生化指标化指标化指标化指标.上海交通大学医学院上海交通大学医学院ThegelwithUVillumination,theethidiumThegelwithUVillumination,theethidiumbromidestainedDNAglowsorangebromidestainedDNAglowsorange.上海交通大学医学院上海交通大学医学院Digital image of 3 Digital image of 3 Digital image of 3 Digital image of 3 plasmid restriction plasmid restriction plasmid restriction plasmid restriction digests run on a 1%w/v digests run on a 1%w/v digests run on a 1%w/v digests run on a 1%w/v agarose gel,3 Volts/cm,agarose gel,3 Volts/cm,agarose gel,3 Volts/cm,agarose gel,3 Volts/cm,stained with ethidium stained with ethidium stained with ethidium stained with ethidium bromide.The DNA size bromide.The DNA size bromide.The DNA size bromide.The DNA size marker is a commercial marker is a commercial marker is a commercial marker is a commercial 1 1 1 1 kbp ladder.The kbp ladder.The kbp ladder.The kbp ladder.The position of the wells position of the wells position of the wells position of the wells and direction of DNA and direction of DNA and direction of DNA and direction of DNA migration is noted.migration is noted.migration is noted.migration is noted.上海交通大学医学院上海交通大学医学院.上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容讲课内容 概述概述 1 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点 2 琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用 3 影响迁移率的因素影响迁移率的因素 4 琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白 5.上海交通大学医学院上海交通大学医学院影响迁移率的因素影响迁移率的因素Factors affecting migration Factors affecting migration vthe size of the moleculethe size of the moleculevconformation of the molecule conformation of the molecule vthe agarose concentration of a gelthe agarose concentration of a gelvVoltageVoltage.上海交通大学医学院上海交通大学医学院Percent agarose and resolution limits Percent agarose and resolution limits.上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容讲课内容 概述概述 1 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点 2 琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用 3 影响迁移率的因素影响迁移率的因素 4 琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白 5.上海交通大学医学院上海交通大学医学院琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白v原理（原理（PrinciplePrinciple）血清脂蛋白经饱和苏丹黑血清脂蛋白经饱和苏丹黑B B预染后，以琼预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，在脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6pH8.6巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。离成不同区带。.上海交通大学医学院上海交通大学医学院(一一一一)血清脂蛋白血清脂蛋白血清脂蛋白血清脂蛋白(lipoprotein)lipoprotein)lipoprotein)lipoprotein)的组成的组成的组成的组成 ApoA ApoBApoA ApoBApoA ApoBApoA ApoBproteinproteinproteinprotein：Apoprotein Apoprotein Apoprotein Apoprotein ApoC ApoD ApoE ApoC ApoD ApoE ApoC ApoD ApoE ApoC ApoD ApoE 甘油三酯甘油三酯甘油三酯甘油三酯 （TGTGTGTG）脂类脂类脂类脂类 磷脂磷脂磷脂磷脂 （PLPLPLPL）游离胆固醇游离胆固醇游离胆固醇游离胆固醇 （FCFCFCFC）胆固醇酯胆固醇酯胆固醇酯胆固醇酯 （CECECECE）少量糖少量糖少量糖少量糖.上海交通大学医学院上海交通大学医学院.上海交通大学医学院上海交通大学医学院（二）分类（二）分类（二）分类（二）分类1.1.1.1.按电泳法分按电泳法分按电泳法分按电泳法分 乳糜微粒（乳糜微粒（乳糜微粒（乳糜微粒（chylomicron,CMchylomicron,CMchylomicron,CMchylomicron,CM）-脂蛋白脂蛋白脂蛋白脂蛋白 （-lipoproteinlipoproteinlipoproteinlipoprotein）前前前前 -脂蛋白（脂蛋白（脂蛋白（脂蛋白（pre pre pre pre -lipoprotein-lipoprotein-lipoprotein-lipoprotein ）-脂蛋白脂蛋白脂蛋白脂蛋白 （-lipoproteinlipoproteinlipoproteinlipoprotein ）.上海交通大学医学院上海交通大学医学院2.2.2.2.按超速离心法分按超速离心法分按超速离心法分按超速离心法分 乳糜微粒乳糜微粒乳糜微粒乳糜微粒(chylomicron,CM)(0.94)chylomicron,CM)(0.94)chylomicron,CM)(0.94)chylomicron,CM)(pI pI pI pI，各各各各种种种种脂脂脂脂蛋蛋蛋蛋白白白白均均均均带带带带负负负负电电电电，电电电电泳泳泳泳时时时时由由由由负负负负极极极极到到到到正正正正极极极极；VLDLVLDLVLDLVLDL为为为为圆圆圆圆形形形形，受受受受阻阻阻阻力力力力小小小小，LDLLDLLDLLDL形形形形态不规则，受阻力大，所以态不规则，受阻力大，所以态不规则，受阻力大，所以态不规则，受阻力大，所以VLDLVLDLVLDLVLDL跑在前跑在前跑在前跑在前.上海交通大学医学院上海交通大学医学院加样槽加样槽加样槽加样槽前前前前 CMLDLVLDLHDLCMLDLVLDLHDL+.上海交通大学医学院上海交通大学医学院临床应用：高脂蛋白血症的分型临床应用：高脂蛋白血症的分型 CM CM 前前 正常正常型型a a型型b b型型型型型型型型.上海交通大学医学院上海交通大学医学院操操 作作.上海交通大学医学院上海交通大学医学院玻璃片.上海交通大学医学院上海交通大学医学院.上海交通大学医学院上海交通大学医学院.上海交通大学医学院上海交通大学医学院预染色的标本预染色的标本预染色的标本预染色的标本.上海交通大学医学院上海交通大学医学院上样处上样处上样处上样处玻片玻片玻片玻片琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶.上海交通大学医学院上海交通大学医学院.上海交通大学医学院上海交通大学医学院.上海交通大学医学院上海交通大学医学院.上海交通大学医学院上海交通大学医学院CM.上海交通大学医学院上海交通大学医学院v正常参考值（百分比）正常参考值（百分比）-脂蛋白脂蛋白 30-40%30-40%前前-脂蛋白脂蛋白 15%15%-脂蛋白脂蛋白 55%55%l l注意事项：注意事项：血清样品要新鲜血清样品要新鲜为了免去离心步骤，吸取预染血清时，应为了免去离心步骤，吸取预染血清时，应吸取上层，下层或管底可能有染料颗粒沉渣，吸取上层，下层或管底可能有染料颗粒沉渣，否则应再离心后吸预染血清否则应再离心后吸预染血清.上海交通大学医学院上海交通大学医学院v名词解释名词解释名词解释名词解释1.1.1.1.迁移率迁移率迁移率迁移率2.2.2.2.电渗电渗电渗电渗3.3.3.3.电泳电泳电泳电泳v问答题问答题问答题问答题1.1.1.1.影响电泳迁移率的因素有哪些？影响电泳迁移率的因素有哪些？影响电泳迁移率的因素有哪些？影响电泳迁移率的因素有哪些？2.2.2.2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。复习思考题复习思考题.上海交通大学医学院上海交通大学医学院参参 考考 书书 目目临床生物化学及生物化学检验临床生物化学及生物化学检验临床生物化学及生物化学检验临床生物化学及生物化学检验 第三版第三版第三版第三版 人民卫生出版社人民卫生出版社人民卫生出版社人民卫生出版社 周新周新周新周新 主编主编主编主编电泳科学出版社电泳科学出版社电泳科学出版社电泳科学出版社 何忠效何忠效何忠效何忠效 张树政张树政张树政张树政 主编主编主编主编蛋白质电泳实验技术蛋白质电泳实验技术蛋白质电泳实验技术蛋白质电泳实验技术 科学出版社科学出版社科学出版社科学出版社 郭尧君郭尧君郭尧君郭尧君蛋白质技术手册蛋白质技术手册蛋白质技术手册蛋白质技术手册 科学出版社科学出版社科学出版社科学出版社 汪家政汪家政汪家政汪家政 范敏范敏范敏范敏 主编主编主编主编 .